QBD-3 Rekayasa

genetika dan
diagnostik
molekuler

TABITHA
PUSPANING
ASMARA
8881190021
01
APA DEFINISI
REKAYASA
GENETIKA?
 Rekayasa genetika adalah manipulasi langsung gen
untuk tujuan praktis, yaitu proses menambahkan DNA
baru secara manual ke suatu organisme. Tujuannya
adalah untuk menambahkan satu atau lebih sifat baru
yang belum ditemukan dalam organisme itu.
02
APLIKASI-APLIKASI
DALAM REKAYASA
GENETIKA
 APLIKASI MEDIS
IDENTIFIKASI GEN MANUSIA YANG MUTASINYA
BERPERAN DALAM PENYAKIT GENETIK
Mengarah pada cara mendiagnosis, merawat, dan bahkan mencegah
penyakitnya. Teknologi DNA juga berkontribusi pada pemahaman
kita tentang penyakit "non-genetik", dari artritis hingga AIDS,
karena gen seseorang memengaruhi kerentanan terhadap penyakit
ini.

DIAGNOSIS DAN PENGOBATAN PENYAKIT

Mendiagnosis ratusan kelainan genetik manusia dengan
menggunakan PCR dengan primer yang menargetkan gen yang
terkait dengan kelainan ini. Penyakit manusia yang telah
diidentifikasi adalah gen untuk penyakit sel sabit, hemofilia, cystic
fibrosis, penyakit Huntington, dan distrofi otot Duchenne.
MANUSIA DAN
PENGEDITAN GEN
●Untuk memasukkan alel
normal dari gen yang rusak ke
dalam sel somatik dari
jaringan yang dipengaruhi
oleh gangguan tersebut.
 PRODUK FARMASI
PENGGUNAAN OBAT
Menentukan urutan dan struktur protein sangat penting untuk
kelangsungan hidup sel tumor telah mengarah pada identifikasi
molekul kecil yang memerangi kanker tertentu dengan menghalangi
fungsi protein ini.

PRODUKSI PROTEIN DALAM KULTUR SEL

Kloning DNA dan sistem ekspresi gen untuk menghasilkan sejumlah
besar protein pilihan yang hadir secara alami hanya dalam jumlah
kecil. Sel inang yang digunakan dalam sistem ekspresi semacam itu
bahkan dapat direkayasa untuk mengeluarkan protein seperti yang
dibuat, sehingga menyederhanakan tugas memurnikannya dengan
metode biokimia tradisional.
BUKTI FORENSIK DAN PROFIL
● Pengujian DNA GENETIK
juga dapat
mengidentifikasi individu yang
bersalah maupun yang tidak
bersalah dengan tingkat
kepastian yang tinggi karena
urutan DNA setiap orang adalah
unik (kecuali untuk kembar
identik).
● Perbandingan DNA seorang ibu,
anaknya, dan ayah yang diakui
dapat secara meyakinkan
menjawab pertanyaan tentang
ayah
● Mengidentifikasi korban-korban
massal.
ERTANIAN DAN PETERNAKAN
● Menghasilkan hewan ● Tanaman dengan gen
transgenik, yang
mempercepat proses
pemuliaan selektif.
Misalnya, membuat
domba dengan wol
berkualitas lebih baik, babi
dengan daging lebih
ramping, atau sapi yang
akan matang dalam waktu
yang lebih singkat.
● Rekayasa genetika
untuk sifat yang dengan cepat
diinginkan, seperti menggantikan
penundaan pematangan program pemuliaan
dan ketahanan terhadap tanaman tradisional,
pembusukan, penyakit, terutama untuk sifat-
kekeringan, memberi sifat yang berguna,
mereka umur simpan seperti herbisida atau
yang lebih lama atau ketahanan hama,
meningkatkan rasa atau yang ditentukan oleh
nilai gizi. satu atau beberapa
gen.
03
ENZIM YANG
DIGUNAKAN DALAM
REKAYASA GENETIKA
 ENZIM RETRIKSI
Membelah DNA manusia dan DNA plasmid. disebut
enzim restriksi karena mereka membatasi pertumbuhan
virus. Mereka juga bertindak sebagai gunting molekuler
untuk memotong setiap bagian DNA di situs tertentu.
Ada empat jenis enzim restriksi yaitu, I, II, III, dan IV,
yang berbeda terutama dalam struktur, situs
pembelahan, spesifisitas, dan kofaktor.
ENZIM DNA LIGASE
Digunakan untuk menyegel DNA asing ke dalam celah
yang dibuat dalam plasmid. The single-stranded tetapi
ujung komplementer dari molekul DNA terpecah
disebut "Ujung lengket." Ini karena mereka dapat
mengikat sepotong DNA pasangan basa pelengkap.
ENZIM DNA POLIMERASE
Untuk mensintesis untai DNA pendek, terutama dengan
metode terjemahan nick.
● Semua DNA polimerase memiliki dua karakteristik
umum:
○ Mereka menambahkan nukleotida ke ujung
3'-OH primer
○ Urutan nukleotida dalam polinukleotida
yang baru lahir diarahkan pada template
04
PRINSIP KLONING
DNA
 Kloning DNA adalah proses pembuatan banyak salinan
identik dari potongan DNA tertentu. Dalam prosedur kloning
DNA, gen atau fragmen DNA lain dimasukkan ke dalam
potongan DNA melingkar yang disebut plasmid. Penyisipan
dilakukan menggunakan enzim yang "memotong dan
menempel" DNA, dan menghasilkan molekul DNA
rekombinan, atau DNA yang dikumpulkan dari fragmen dari
berbagai sumber.
Selanjutnya, plasmid rekombinan dimasukkan ke dalam
bakteri. Ketika mereka bereproduksi, mereka mereplikasi
plasmid dan meneruskannya ke keturunannya, membuat
salinan DNA yang dikandungnya.
Langkah:
• Potongan DNA yang dipilih adalah 'dipotong' dari
organisme sumber menggunakan enzim restriksi.
• Potongan DNA 'ditempelkan' ke vektor dan ujung-ujung
DNA digabungkan dengan vektor DNA melalui ligasi.
• Vektor dimasukkan ke dalam sel inang, seringkali
bakteri atau ragi, melalui proses yang disebut
transformasi. Sel inang menyalin DNA vektor bersama
dengan DNA mereka sendiri, menciptakan banyak
salinan dari DNA yang dimasukkan.
• Vektor DNA diisolasi (atau dipisahkan) dari DNA sel
inang dan dimurnikan. DNA yang telah 'dipotong' dan
'ditempelkan' dari suatu organisme menjadi vektor
disebut DNA rekombinan. Karena itu, kloning DNA juga
disebut teknologi DNA rekombinan.
05
TEKNIK DASAR
DALAM REKAYASA
GENETIKA
 PCR
● Saat dupleks DNA dipanaskan, untaiannya terpisah atau 'meleleh'. Jika urutan singlestranded dapat
disalin oleh DNA polimerase, urutan DNA asli secara efektif diduplikasi. Jika proses ini diulang
berkali-kali, ada peningkatan eksponensial dalam jumlah salinan dari urutan awal. Panjang fragmen
ditentukan oleh 5 ujung primer, yang membantu memastikan bahwa populasi molekul DNA yang
homogen diproduksi. Dengan demikian, setelah siklus yang relatif sedikit, urutan target menjadi
sangat diperkuat, yang menghasilkan cukup banyak urutan untuk identifikasi dan pemrosesan lebih
lanjut.
● Setiap pengujian PCR membutuhkan keberadaan DNA templat, primer, nukleotida, dan DNA
polimerase. DNA polimerase adalah enzim kunci yang menghubungkan nukleotida individu
bersama untuk membentuk produk PCR. Nukleotida meliputi empat basa — adenin, timin, sitosin,
dan guanin (A, T, C, G) —yang ditemukan dalam DNA. Ini bertindak sebagai blok bangunan yang
digunakan oleh DNA polimerase untuk membuat produk PCR. Primer dalam reaksi menentukan
produk DNA yang tepat untuk diamplifikasi. Primer adalah fragmen DNA pendek dengan urutan
yang ditentukan saling melengkapi dengan DNA target yang harus dideteksi dan diperkuat. Ini
berfungsi sebagai titik perpanjangan untuk membangun DNA polimerase.
Cara:
1. Solusi reaksi pertama-tama dipanaskan di atas
titik lebur dari dua untai DNA komplementer
dari DNA target, yang memungkinkan untaian
itu terpisah, suatu proses yang disebut
denaturasi.

2. Temperatur kemudian diturunkan untuk

memungkinkan primer spesifik untuk mengikat
ke segmen DNA target, proses yang dikenal
sebagai hibridisasi atau anil. Annealing antara
primer dan DNA target hanya terjadi jika
mereka saling melengkapi secara berurutan
(mis. A yang mengikat G).

3. Suhu dinaikkan lagi, pada saat itu DNA

polimerase mampu memperpanjang primer
dengan menambahkan nukleotida ke untai DNA
yang sedang berkembang. Dengan setiap
pengulangan dari tiga langkah ini, jumlah
molekul DNA yang disalin berlipat ganda.
 rDNA
Teknologi DNA rekombinan berkaitan dengan penggunaan
tiga alat utama: (1) enzim (enzim restriksi, polimerase, dan
ligase); (2) vektor; dan (3) organisme inang.

Enzim akan membantu memotong (restriksi enzim),

mensintesis (polimerase), dan mengikat (ligase) DNA.
Enzim restriksi memainkan peran penting dalam teknologi
ini. Enzim restriksi akan dipotong di situs tertentu dalam
molekul DNA yang disebut situs restriksi. Biasanya, enzim
restriksi akan menghasilkan ujung lengket pada urutan DNA
yang akan membantunya mengikat secara spesifik pada gen
yang diinginkan. Vektor akan membawa gen yang
diinginkan. Vektor adalah bagian penting dari teknologi
DNA rekombinan. Mereka dianggap sebagai kendaraan
terakhir yang membawa gen yang menarik ke organisme
inang.
Secara umum, teknologi DNA
rekombinan memiliki lima langkah:

1. Memotong DNA yang diinginkan

dengan situs restriksi,
2. Memperkuat salinan gen oleh
PCR,
3. Memasukkan gen ke dalam vektor,
4. Mentransfer vektor ke host
organisme, dan
5. Memperoleh produk-produk gen
rekombinan
 LIGASI
Ligasi DNA adalah penyatuan 2 molekul DNA oleh enzim, DNA ligase. DNA ligase mengkatalisasi
pembentukan dua ikatan fosfodiester kovalen antara gugus hidroksil 3 'dari satu nukleotida dan gugus 5'
fosfat lainnya dalam reaksi tergantung ATP. Dalam kloning molekuler, reaksi ligasi mengikuti
pencernaan sisipan gen dan vektor target.

DNA ligase dapat digunakan untuk memasukkan gen ke dalam vektor plasmid, atau untuk membuat gen
fusi dengan menggabungkan satu gen ke gen lainnya. Proses ini disebut ligasi. Ligasi dapat dilakukan
pada panjang DNA yang memiliki ujung "tumpul" atau "lengket". Dalam ligasi “ujung tumpul”, fragmen
DNA bergabung langsung bersama oleh ligase DNA.
Dalam ligasi "sticky end", tumpang tindih daerah ikatan
DNA hidrogen untai tunggal komplementer satu sama lain,
dan enzim ligase DNA menghubungkan tulang punggung
gula fosfat bersama-sama. Melalui pemilihan enzim restriksi
menciptakan ujung yang lengket.
 Isolasi DNA dari sel
Isolasi DNA dilakukan terhadap DNA yang membawa gen
yang akan disisipkan (gen target) dan DNA yang akan
digunakan sebagai pembawa (vektor).
DNA yang digunakan sebagai vektor adalah plasmid (DNA
ekstrakromosomal dari bakteri), cosmid (DNA fage yang
membentuk plasmid), dan DNA fage. Salah satu plasmid
yang biasa digunakan sebagai vektor rekombinan adalah
pUC18/19.
Pada umumnya, vektor rekombinan
mempunyai situs pengenalan enzim restriksi
yang spesifik sehingga DNA tersebut dapat
dipotong dan disisipi dengan DNA target.
Situs enzim restriksi tersebut memotong
suatu gen yang berfungsi sebagai penanda
seleksi (selectable marker), misalnya: gen
penyandi ketahanan terhadap ampisilin.

Pada beberapa vektor, beberapa situs enzim

restriksi yang digunakan untuk penyisipan
DNA target terkumpul dalam suatu wilayah
yang disebut MCS (Multiple Cloning Site)
atau polylinker.
 Pemotongan DNA

● Pemotongan dan
penyambungan molekul DNA
dilakukan secara enzimatis.

● Pemotongan pita DNA:

menggunakan enzim restriksi
yang bekerja spesifik,
mengenali situs tertentu dalam
rantai DNA (misalnya: EcoRI
mengenali dan memotong
situs GAATTC) dan
menghasilkan pola tertentu.
 Site-directed mutagenesis
Mutagenesis situs-diarahkan (SDM) adalah metode 1. Untuk mempelajari perubahan aktivitas protein yang
untuk membuat perubahan spesifik, bertarget dalam terjadi sebagai akibat dari manipulasi DNA.
DNA plasmid beruntai ganda. Ada banyak alasan
untuk membuat perubahan DNA spesifik 2. Untuk memilih atau menyaring mutasi (pada tingkat
(penyisipan, penghapusan, dan penggantian), DNA, RNA atau protein) yang memiliki sifat yang
termasuk: Diinginkan

3. Untuk memperkenalkan atau menghapus

pembatasan pada situs atau tag endonuklease SDM
adalah alat yang sangat penting untuk memodifikasi
gen dan mempelajari sifat struktural dan fungsional
protein, berdasarkan pada struktur, fungsi, mekanisme
katalitik, dan residu katalitik enzim. SDM mencakup
mutasi tunggal dan kombinasional. Biasanya dianalisis
dengan metode bioinformatik. SDM tunggal dan banyak
mutasi telah digunakan untuk mempercepat dan
menyederhanakan metode-metode mutagenesis. Sifat-
sifat enzim dapat ditingkatkan secara nyata dengan
kombinasi SDM dengan metode lain.
06
ASPEK BIOLOGI
MOLEKULER DALAM
PENGEMBANGAN
VAKSINASI
1. Vaksin konvensional baik vaksin generasi pertama yaitu vaksin yang mengandung mikroorganisme
hidup yang telah dilemahkan. Vaksin generasi pertama seringkali dapat bermutasi kembali menjadi
virulen sehingga menimbulkan efek yang tidak diinginkan. Oleh sebab itu biasanya jenis vaksin
yang dilemahkan ini tidak dianjurkan diberikan kepada penderita yang mengalami
imunokompromais
2. vaksin generasi kedua yaitu vaksin yang mengandung mikroorganisme yang dimatikan. n vaksin
generasi kedua adalah vaksin mengandung mikroorganisme yang dimatikan menggunakan zat kimia
tertentu, biasanya dengan menggunakan formalin atau fenol, dalam peng gunaannya sering
mengalami kegagalan atau tidak menimbulkan respon imun tubuh.
3. Vaksin generasi yang ketiga yaitu vaksin rekombinan yang juga dikenal dengan vaksin sub unit yang
mengandung fragmen antigenik dari suatu mikroorganisme yang dapat merangsang respon imun,
dalam penggunaannya masih memiliki beberapa kelemahan. Vaksin sub unit dibuat melalui teknik
rekayasa genetika untuk memperoleh fragmen antigenik dari mikroorganisme, sehingga disebut
dengan vaksin rekombinan. Salah satu vaksin yang telah diproduksi dengan metode rDNA adalah
vaksin hepatitis B. Ragi S. cerevisiae digunakan untuk mengekspresikan antigen permukaan virus
hepatitis B (HBsAg), di bawah kendali alkohol dehidrogenase promotor. Protein kemudian dapat
dimurnikan dari biakan fermentasi dan digunakan untuk inokulasi. Ini menghilangkan kemungkinan
kontaminasi vaksin oleh virus atau racun yang ditularkan melalui darah, yang merupakan risiko jika
sumber alami digunakan untuk produksi vaksin. Vaksin rekombinan lebih aman dibandingkan
dengan vaksin yang mengandung seluruh sel virus, karena fragmen antigenik yang terdapat dalam
vaksin rekombinan tidak dapat bereproduksi dalam tubuh penerima, disamping itu vaksin
rekombinan umumnya tidak menimbulkan efek samping. Namun demikian vaksin generasi ketiga
inipun ternyata hanya dapat menimbulkan respon imun humoral dan tidak dapat menimbulkan
respon imun seluler
4. Vaksin DNA merupakan vaksin generasi keempat yang diharapkan dapat mencegah penyakit
infeksi. Beberapa keuntungan vaksin DNA, selain dapat merangsung respon imun humoral dan
imun selular, vaksin DNA dapat diproduksi dalam skala besar lebih ekonomis dibandingkan vaksin
konvensional. Selain tidak memerlukan perlakukan khusus terhadap mikroba patogen selama proses
produksi, plasmid DNA sangat stabil dan dapat direkayasa sedemikian rupa untuk memperoleh
gabungan beberapa plasmid DNA yang mempunyai spektrum luas yang bersifat multivalen.
Walaupun saat vaksin DNA masih dalam fase uji klinik terhadap manusia, akan tetapi vaksin DNA
diharapkan dapat mengatasi berbagai penyakit infeksi khususnya penyakit infeksi yang bersifat
pandemik yang sangat sulit diatasi dengan vaksin konvensional.

Struktur dan elemen genetik dari suatu vaksin DNA terdiri dari dua unit utama yaitu :
● Unit propagasi plasmid yang berfungsi sebagai pengendali replikasi dan perbanyakan plasmid
DNA secara in vitro dalam sel bakteri, sesuai dengan jumlah dan volume yang diinginkan pada saat
diproduksi.
● Fragmen DNA yang mengandung gen vaksin yang telah dikloning ke dalam plasmid DNA, dimana
gen vaksin ini diharapkan mengekspresi protein asing di dalam sel hospes (tubuh manusia). Elemen
genetik dari vaksin DNA dapat dilihat pada
07
PRINSIP DETEKSI
ASAM NUKLEAT
 Hibridisasi asam nukleat
Urutan spesifik dapat dideteksi dalam DNA sel total
melalui hibridisasi dengan probe DNA berlabel, yang
mengandung nukleotida radioaktif atau nukleotida
termodifikasi yang dapat dideteksi dengan fluoresensi
atau chemiluminescence. DNA didenaturasi dengan
memanaskan hingga 95 ° C, menghasilkan molekul
beruntai tunggal. Probe berlabel kemudian ditambahkan
dan suhu diturunkan ke 65 °C, memungkinkan untai
DNA komplementer untuk renaturasi dengan
berpasangan satu sama lain. Probe berhibridisasi ke
sekuens komplementer dalam DNA sel, yang kemudian
dapat dideteksi dengan memasukkan probe berlabel ke
dalam molekul beruntai ganda.
Berdasarkan objek pengamatannya, hibridisasi dibedakan menjadi:
● Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)
Metode ini menggunakan probe yang mengandung komponen ber-fluoresen. Komponen ini dapat
berpendar jika dikenakan sinar UV sehingga lokasi gen yang dicari dapat diketahui. Adapun probe yang
digunakan hanya berupa potongan asam nukleat pendek untuk jenis gen tertentu saja.

● Genomic In Situ Hybridization (GISH)

Prinsip dasarnya hampir sama dengan FISH, hanya saja komponen yang menjadi probe adalah
keseluruhan genom DNA dari suatu spesies. Metode ini digunakan untuk memeriksa penyebaran
genomic DNA interspesies dan organisasi sekuensnya.
Southern blotting
Banyak digunakan untuk mendeteksi gen spesifik
dalam DNA seluler.
DNA yang akan dianalisis dicerna dengan restriksi
endonuklease, dan fragmen DNA yang dicerna
dipisahkan oleh elektroforesis gel. Gel kemudian
dilapis dengan filter nitroselulosa atau membran nilon
tempat fragmen DNA ditransfer (dihilangkan) untuk
menghasilkan replika gel. Filter kemudian diinkubasi
dengan probe berlabel, yang berhibridisasi dengan
fragmen DNA yang mengandung urutan
komplementer, yang memungkinkan visualisasi
fragmen spesifik dari sel DNA ini.
Northern blotting
Northern Blotting digunakan untuk
menganalisis urutan RNA (RNA sequence)
tertentu di antara kumpulan molekul RNA.
Pada dasarnya metode ini adalah kombinasi dari
denaturasi RNA elektroforesis gel dan staining.
Pada proses ini, RNA dipisahkan berdasarkan
ukuran dan kemudian ditransfer ke membran
yang kemudian diperiksa dengan pelengkap
berlabel urutan kepentingan tertentu. Hasilnya
dapat digambarkan melalui berbagai cara
tergantung pada label yang digunakan. Hasil yang
paling dalam pada penyataan band yang mewakili
ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas
band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA
target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini
umumnya digunakan untuk mempelajari kapan
dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi
dengan mengukur berapa banyak RNA hadir
dalam sampel yang berbeda.
DNA Microarray
● DNA microarray adalah teknologi yang
digunakan untuk melihat urutan sekuens
asam nukleat yang berada pada lokasi
tertentu dan dapat digunakan untuk
menganalisis beribu-ribu sampel pada
waktu yang bersamaan. Prinsipnya adalah
mengandalkan kemampuan DNA sampel
yang telah dilabel dengan zat fluorescent
untuk melakukan rekombinasi dengan probe
yang telah ada pada chip microarray.
● Aplikasi microarray banyak digunakan
dalam deteksi kanker di mana sel kanker
mengalami abnormalitas dalam
mengekspresikan gennya. Teknologi ini
juga memungkinkan untuk mengetahui
tahapan perkembangan sel kanker dengan
melihat level ekspresinya terhadap probe
spesifik yang telah terdapat pada chip
microarray.
08
PRINSIP BERBAGAI
DETEKSI ANTIGEN
Metode ELISA untuk mengukur
reaksi Antigen (Ag)
Antibodi(Ab)meningkat penggunaannya
dalam pendeteksian antigen (dari agen
infeksius) atau antibodi karena
metodenya yang sederhana tapi sensitif.
● Sekarang ELISA telah diterapkan
secara luas dalam deteksi berbagai
antibodi dan antigen seperti

●
hormon, toksin, dan virus.
Terdapat 3 jenis pengujian ELISA,
Direct ELISA, Indirect ELISA,
Sandwich ELISA
ELISA
ELISA atau singkatan dari Enzyme-
linked Immunosorbent Assay
merupakan jenis immunoassay (uji
imun) yang telah digunakan secara luas.
ELISA merupakan rapid test atau uji
cepat dalam mendeteksi atau
mengkuantifikasi jumlah antibodi atau
antigen melawan virus, bakteri, atau
bahan lain. ELISA dinamakan demikian
karena memang melibatkan penggunaan
enzim dan immunosorbent.
● 1. Berat molekul protein
diseparasi atau dipisahkan
dengan menggunakan SDS-PAGE
elektroforesis dan ditransfer ke
membrane nitrocellulose (NC)
selanjutnya di lakukan labeling

●
Antibodi.
 
● 2. Pada dasarnya prosedur dari
Western blot adalah Gel SDS-
PAGE ditransfer ke membrane
Nitroselulose, selanjutnya
imunostainining (Bloking Non
spesifik, inkubasi antibody
primer, inkubasi antibody
sekunder, inkubasi enzim SA-
HRP, dan inkubasi substrat).
●   biasanya berbahan dasar nitroselulose
● 3. Identifikasi berat molekul
sampel dengan cara
membandingkan band yang
● terpendar pada menbran
nitroselulose sejajar dengan
marker.
●   gel yang kemudian diwarnai secara
WESTERN
BLOT
Western blot adalah teknik untuk
mengidentifikasi antibodi spesifik pada
protein yang telah dipisahkan antara
satu dengan yang lain menurut
ukurannya melalui elektroforesis gel.
Blot merupakan sebuah membran,
atau PVDF (Polyvynilidine fluoride).
Gel diletakkan diatas membran dan
aliran listrik akan menginduksi protein
pada gel untuk berpindah pada
membran. Membran tersebut akan
menjadi replika dari pola protein pada
sekuensial dengan antibodi.
● Prinsip teknik imunofulorensi
adalah pengenalan antigen dengan
antibody spesifik dan
visualisasinya dengan label,
contohnya fluorescin, rhodamin,
atau enzim yang direaksikan
dengan substrat kromogenik.

● Sedangkan teknik imunoenzim

adalah suatu teknik imunologi
berdasarkan pada penggunaan:
1. 1. Ikatan enzim dengan antibody
spesifik (enzyme-antibody
conjugated),
● 2. Kompleks enzim-antienzim,
● 3. Kompleks antibody-antigen
dengan pelabelan enzim
(peroksidase), yang akan
menghasilkan perubahan warna
dengan substrat dan kromogen
spesifik. Keseluruhan teknik ini
digunakan secara histologi untuk
visualisasi/pelabelan specimen
jaringan dan mengetahui letak
antigen.
IMUNOHISTOKI
MIA
Metode yang bertujuan untuk
mengindetifikasi sel-sel spesifik
berdasarkan komponen antigenic atau
produk selulernya dengan reaksi
kompleks antigen-antibodi. Dengan kata
lain, imunohistokimia digunakan sebagai
dasar penegakan diagnosis dan
identifikasi tipe sel berdasarkan detail
sitomorfologi, terutama pada kasus-
kasus tumor dan keganasan. Pada teknik
ini dapat digolongkan dengan teknik
immunofluoresensi dan imuno enzim.
09
PERAN ANTIBODI
MONOKLONAL DAN
ANTIBODI
POLIKLONAL DALAM
DIAGNOSTIK
 Antibodi Monoklonal
Setiap sel plasma yang berasal dari sel B yang sama mengeluarkan
antibodi terhadap antigen spesifik. Ini adalah antibodi monoklonal,
karena semuanya adalah tipe yang sama dan karena diproduksi oleh sel
plasma yang berasal dari sel B yang sama.

• Saat ini, antibodi monoklonal sedang digunakan untuk diagnosis

cepat dan pasti dari berbagai kondisi. Misalnya, hormon
human chorionic gonadotropin (HCG) ada dalam urin wanita
hamil. Antibodi monoklonal dapat digunakan untuk mendeteksi
hormon ini.
• Antibodi monoklonal juga digunakan untuk mengidentifikasi
infeksi seperti flu H1N1, HIV, dan RSV, infeksi virus
pernapasan yang umum terjadi pada anak kecil. Karena
mereka dapat digunakan untuk membedakan antara sel-sel jaringan
kanker dan normal, mereka juga digunakan untuk membawa
radioisotop atau obat beracun ke tumor, yang kemudian dapat
dihancurkan secara selektif.
 Antibodi poliklonal
Antibodi poliklonal (pAbs) adalah campuran heterogen yang
biasanya diproduksi oleh klon sel B yang berbeda dalam
tubuh. Mereka dapat mengenali dan mengikat banyak epitop
antigen tunggal. Antibodi poliklonal diproduksi dengan
menyuntikkan imunogen ke hewan. Setelah disuntik dengan
antigen spesifik untuk memperoleh respons imun primer,
hewan diberi imunisasi sekunder bahkan tersier untuk
menghasilkan titer antibodi yang lebih tinggi terhadap
antigen tertentu.

• Antibodi poliklonal adalah reagen yang ideal dalam uji

diagnostik dan reaksi hemaglutinasi karena
kemampuannya untuk mengenali epitop yang berbeda dari
molekul target. Penggunaan terbaik antibodi poliklonal
adalah untuk mendeteksi antigen yang tidak diketahui.
Antibodi poliklonal digunakan sebagai antibodi sekunder
dalam immunoassay (mis. ELISA, western blotting, tes
microarray, imunohistokimia, flow cytometry). Peran
mereka adalah untuk mengikat epitop yang berbeda dan
memperkuat sinyal, yang mengarah ke deteksi yang lebih
baik.
10
CARA MENDETEKSI
ADANYA MUTASI
 Karyotyping Konvensional
Studi kromosom disarankan dalam situasi
berikut: dugaan kelainan kromosom,
gangguan seksual, anomali kongenital ganda
dan / atau keterbelakangan perkembangan,
ketidakmampuan belajar yang tidak
terdiagnosis, infertilitas atau keguguran
ganda, lahir mati dan keganasan [2]. Secara
tradisional, studi mikroskopis kromosom
dilakukan pada kromosom yang dipadatkan
pada perbesaran sekitar 1000 pada metafase.
Fluorescence in situ hybridization (FISH)
FISH diterapkan untuk menyediakan
lokalisasi gen khusus pada kromosom.
Diagnosis cepat trisomi dan mikrodelesi
diperoleh dengan menggunakan probe
spesifik. Biasanya probe terdenaturasi
ditambahkan ke penyebaran kromosom
metafase dan diinkubasi semalaman untuk
memungkinkan hibridisasi spesifik-urutan.
Setelah menghilangkan probe tidak terikat,
probe terikat divisualisasikan oleh fluoresensi
di bawah sinar UV; dengan demikian, situs
gen yang menarik diamati sebagai gambar.
Teknik ini digunakan untuk memeriksa
penyebab trisomi, sindrom mikrodelesi, dll.
Comparative genomic hybridization (CGH)
● CGH, teknik FISH khusus (probe ganda), diterapkan untuk mendeteksi semua ketidakseimbangan
genom. Dasar-dasar teknik ini adalah perbandingan DNA genom total dari DNA sampel yang
diberikan (mis.
● DNA tumor) dengan DNA genom total sel normal. Biasanya, jumlah yang sama dari tumor dan DNA
normal diberi label dengan dua pewarna fluoresen yang berbeda; campuran ditambahkan dan
diseragamkan ke slide metafase limfosit normal. Mikroskop fluoresen yang dilengkapi dengan
kamera CCD dan sistem analisis gambar digunakan untuk evaluasi . Rincian teknis telah dijelaskan
dalam berbagai publikasi CGH. Salinan jumlah materi genetik (keuntungan dan kerugian) dihitung
oleh perangkat lunak evaluasi. CGH digunakan untuk menentukan perubahan jumlah salinan genom
pada kanker dan sel-sel yang kariotipe-nya sulit atau tidak mungkin untuk disiapkan atau dianalisis.
Dalam array-CGH, ​slide metafase digantikan oleh urutan DNA spesifik, terlihat dalam array pada
slide kaca ; jadi resolusinya meningkat.
11
CARA ATAU PRINSIP
DIAGNOSTIK
MOLEKULER PADA
PENYAKIT MENURUN
 DIAGNOSTIK MOLEKULER

Selain penyebab genetik kelainan, kecenderungan penyakit atau pilihan

pengobatan dapat diungkapkan dengan menentukan variasi DNA.
Diagnostik molekuler menyediakan cara untuk penilaian susunan genetik
manusia; ini menggabungkan obat-obatan laboratorium dengan genetika
molekuler untuk mengembangkan metode analitis berbasis DNA / RNA
untuk memantau patologi manusia. Berbagai metode telah digunakan
untuk deteksi mutasi.
MUTASI YANG DIKETAHUI
1. Polymerase chain reaction (PCR)
Memeriksa produk PCR, elektroforesis (elektroforesis gel agarosa atau poliakrilamid) digunakan untuk mengukur produk PCR dengan
membandingkannya dengan tangga DNA (penanda berat molekul). Di sini, aplikasi dari beberapa versi PCR disebutkan.

• Reverse transcriptase PCR (RT-PCR): disini, untaian molekul RNA ditranskripsi secara terbalik ke dalam DNA
komplementernya (cDNA) menggunakan enzim reverse transcriptase. CDNA ini kemudian diperkuat oleh PCR. RT-PCR diterapkan
untuk mempelajari mutasi pada tingkat RNA.
• Multiplex PCR: disini, beberapa wilayah target terpilih dalam sampel diamplifikasi secara simultan menggunakan pasangan
primer yang berbeda.
• PCR bersarang: Ini mencakup dua PCR berturut-turut; produk dari reaksi PCR pertama digunakan sebagai templat untuk PCR
kedua. Jenis PCR ini digunakan untuk memperkuat template dalam jumlah salinan rendah dalam spesimen. Ini memiliki manfaat
peningkatan sensitivitas dan spesifisitas.
• Sistem mutasi refraktori amplifikasi (ARMS) PCR: Amplifikasi spesifik alel (AS-PCR) atau ARMS-PCR adalah teknik
umum untuk mendeteksi mutasi titik atau penghapusan kecil [31]. Genotipe (keadaan normal, heterozigot, dan homozigot) dari
sampel dapat ditentukan dengan menggunakan dua reaksi komplementer: satu berisi primer spesifik untuk amplifikasi urutan DNA
normal pada lokus yang diberikan dan yang lainnya berisi primer spesifik mutan untuk amplifikasi DNA mutan . ARMS-PCR telah
digunakan untuk memeriksa mutasi paling umum pada gen GJB2, mutasi 35delG di antara anak-anak tuli.
• PCR waktu nyata: Dalam teknik ini, DNA yang diperbesar terdeteksi saat PCR berlangsung. Ini biasanya digunakan dalam studi
ekspresi gen dan kuantifikasi jumlah salinan awal target.
2. DNA microarray 3. Sequencing DNA
Sebagai teknik yang kuat dalam genetika molekuler, sequencing
“chip” atau microarray DNA telah digunakan
DNA menyediakan analisis gen pada tingkat nukleotida. Tujuan
sebagai pengujian yang memungkinkan untuk
utama sekuensing DNA adalah untuk menentukan urutan wilayah
banyak mutasi. Dalam teknologi ini, untai
kecil yang diminati (∼1 kilobase) menggunakan produk PCR
DNA tunggal termasuk urutan target yang
sebagai templat. Sequencing Dideoxynucleotide atau Sanger
berbeda ditetapkan untuk dukungan yang solid
sequencing merupakan teknik yang paling banyak digunakan untuk
dalam format array. Di sisi lain, sampel DNA
sequencing DNA. Sekuensing DNA dapat digunakan untuk
atau cDNA yang dilabeli dengan pewarna
memeriksa semua variasi DNA kecil yang diketahui dan tidak
fluorescent digabungkan ke dalam chip.
diketahui.
Kemudian menggunakan sistem laser,
keberadaan fluoresensi diperiksa; urutan dan
jumlah mereka dalam sampel ditentukan.

4. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

MLPA umumnya diterapkan pada penghapusan layar dan duplikasi hingga 50 urutan
DNA genom atau RNA yang berbeda. Secara keseluruhan, penghapusan dan
duplikasi gen menyumbang hingga 10%, dan dalam banyak gangguan hingga 30%
dari mutasi penyebab penyakit. Dalam teknik ini, secara singkat, set probe
dipadukan dengan DNA genom dalam larutan. Setiap probe terdiri dari dua bagian;
satu setengah terdiri dari urutan target spesifik dan urutan primer universal, dan
setengah lainnya memiliki urutan lebih lainnya, sebuah fragmen acak panjang
variabel untuk memberikan perbedaan ukuran untuk resolusi elektroforesis.
MUTASI YANG TIDAK
DIKETAHUI
1. Single Strand Conformational
Polymorphism (SSCP):
SSCP adalah salah satu teknik penyaringan
paling sederhana untuk mendeteksi mutasi yang
tidak diketahui (microlesions) seperti substitusi
basa tunggal, penghapusan kecil, insersi kecil,
atau mikroversi. Variasi DNA menyebabkan
perubahan konformasi fragmen DNA
terdenaturasi selama migrasi dalam
elektroforesis gel. Konformasi ini unik dan
dihasilkan dari urutan nukleotida primer.
Mobilitas fragmen-fragmen ini berbeda melalui
gel poliakrilamida yang tidak jenuh; deteksi
variasi didasarkan pada struktur konformasi ini.
PCR digunakan untuk memperkuat fragmen,
yang disebut PCR-SSCP, karena ukuran
fragmen optimal dapat 150 hingga 200 bp.
Sekitar 80-90% dari mutasi titik potensial
terdeteksi oleh SSCP
2. Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE)
DGGE telah digunakan untuk penyaringan
mutasi titik yang tidak diketahui. Ini
didasarkan pada perbedaan perilaku leleh
fragmen DNA kecil (200-700 bp); bahkan
substitusi basis tunggal dapat menyebabkan
perbedaan seperti itu. Deteksi fragmen
bermutasi akan dimungkinkan dengan
membandingkan perilaku peleburan fragmen
DNA pada denaturing gradient gel. Sekitar
kurang dari 100% mutasi titik dapat dideteksi
menggunakan DGGE. Maksimum fragmen
hampir 1000 bp dapat diselidiki dengan
teknik ini.
3. Analisis heterodupleks
Campuran molekul tipe-liar dan DNA mutan
didenaturasi dan dinenaturasi untuk
menghasilkan heteroduplikasi. Homoduplices
dan heteroduplices menunjukkan mobilitas
elektroforesis yang berbeda melalui gel
poliakrilamid nondenaturing. Dalam teknik ini,
ukuran fragmen berkisar antara 200 dan 600 bp.
Hampir 80% dari mutasi titik telah diperkirakan
terdeteksi oleh analisis heteroduplex.
4. Polimorfisme panjang fragmen
restriksi (RFLP)
Mutasi titik dapat mengubah situs restriksi
dalam DNA yang menyebabkan perubahan
pembelahan dengan restriksi endonuklease
yang menghasilkan fragmen dengan berbagai
ukuran (Gbr. 4D). RFLP digunakan untuk
mendeteksi mutasi yang terjadi di situs
restriksi.
 REFERENSI
1. Clementi D. Genetic engineering [Internet]. London: BBC; 2018 [cited 5 Mei 2020]. Available from: https://www.bbc.co.uk/bitesize/guides/zsg6v9q/revision/4
2. Mader S, Windelspeciht M. Human Biology. 15th Ed. New York: Mcgraw-hill Education; 2018. p. 489-5.
3. Urry, Cain, Wasserman, Minorsky, Reech. Campbell biology. Genetics. 11th ed. New york: Pearson;2016.p.431-7.
4. Alberts B, JohnsonA, Lewis J, Morgan D, Raff M, Roberts K, et all. Molecular biology of the cell. 6th ed. New tork: Garland science; 2015. 464-465p.
5. Blaber M. DNA modifying enzymes [Internet]. Florida: Biologi libretext; 2019 [cited 16 mei 2020]. Available from:
https://bio.libretexts.org/Bookshelves/Biochemistry/Supplemental_Modules_(Biochemistry)/1%3A_DNA/1.4%3A_DNA_Modifying_Enzymes
6. Rodwell VW, Bender DA, Botham KN, Kennely PJ, Weil PA. Harpers illustrated biochemistry. Genetika molekular, DNA rekombinan, dan teknologi genomik. 30th ed. New
York: The McGraw Hill Education; 2015.p.453.
7. Khan Academy. Overview: DNA cloning. Khan Academy [Internet]. [cited 2020 May 15]. Available from: https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-
technology/dna-cloning-tutorial/a/overview-dna-cloning
8. Reece JB, Taylor MR, Simon EJ, Dickey JL. Biology.7th. San Francisco: Pearson Education; 2012. 232-3 p.
9. DNA cloning [Internet]. Science Learning Hub. 2020 [cited 16 May 2020]. Available from: https://www.sciencelearn.org.nz/resources/2031-dna-cloning
10. Garibyan L, Avashia N. Polymerase Chain Reaction. Journal of Investigative Dermatology. 2013;133(3):1-4.
11. Nicholl D. An introduction to genetic engineering. 3rd ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2008.
12. Pham PV. Medical biotechnology: techniques and applications. InOmics Technologies and Bio-Engineering 2018 Jan 1 (pp. 449-469). Academic Press.
13. DNA ligation [Internet]. Di.uq.edu.au. 2020 [cited 16 May 2020]. Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed/sparq-ed-services/dna-ligation
14. Biolabs N. Site Directed Mutagenesis | NEB [Internet]. International.neb.com. 2020 [cited 16 May 2020]. Available from:
https://international.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/site-directed-mutagenesis
15. Yang H, Li J, Du G, Liu L. Microbial production and molecular engineering of industrial enzymes: challenges and strategies. InBiotechnology of Microbial Enzymes 2017 Jan 1
(pp. 151-165). Academic Press.
16. Mercuriani IS. Bioteknologi: teknologi DNA rekombinan dan aplikasinya. Staff.uny.ac.id [Internet]. 2008 [cited 2020 May 15]. Available from:
http://staff.uny.ac.id/sites/default/files/pengabdian/ixora-sartika-marcuriani-dr-msi/modul-pengayaan-materi-bioteknologi-untuk-sma.pdf
17. Radji M. Vaksin DNA: Vaksin generasi keempat. Pharmaceutical Sciences and Research (PSR). 2012 Aug 14;6(1):28-37.
18. Cooper GM. The cell: a molecular approach. 8th ed. New York: Sinauer Associates; 2019. p. 131-41.
19. Artanto, s. Prijambada, I. Susetya, H. Pengembangan kit elisa untuk deteksi igG dan M terhadap virus influenza. Tesis. Yogyakarta. 2013: Perpustakaan UGM
20. Tankheswar, A. Elisa test: principle, materials, procedure, and results. Journal. 2012: Microbe Online
21. Mader SS, Winddelspecht M. Human biology. 15th ed. New York: McGraw-Hill Education; 2018. p. 138-9
22. Creative Diagnostic. Polyclonal vs monoclonal antibody [Internet]. [Cited 16 May 2020]. Available from :
https://www.creative-diagnostics.com/polyclonal-vs-monoclonal-antibodies.htm
23. Sinclair A. Genetics 101: detecting mutations in human genes. Canadian Medical Association Journal. 2002 Aug 6; 167(3): 275-9.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC117476/
24. Mahdieh N, Rabbani B. An Overview of Mutation Detection Methods in Genetic Disorders. Iran Journal of Pediatric. 2013 Aug; 23(4): 375–88.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3883366/
Thanks!

CREDITS: This presentation template was created by

Slidesgo, including icons by Flaticon, and infographics
& images by Freepik.