BIOKIMIA ANALISIS DAN KETEKNIKAN

REAL TIME PCR

ABDUL AZIZ
G851190021

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2019
 REAL TIME PCR

1 Instrumen PCR 2 Dogma Sentral

3 Mekanisme
perbanyakan DNA

4 Tahap PCR 5 Aplikasi PCR

2
PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION)
Amplifikasi pita DNA yang dilakukan diluar sel makhluk hidup
Fungsi utama: untuk memperbanyak DNA target dalam waktu
relatif cepat

Instrumen Aplikasi

sepasang primer isolasi gen

template/cetakan DNA sequencing
enzim Taq DNA poly Forensik
merase diagnosa penyakit.
dNTP dan buffer

Teknik ini diperkenalkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia
memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya.
Dogma sentral aliran informasi genetik
Teknik PCR, berdasarkan mekanisme replikasi DNA
pada semua sel (in vivo)
RT PCR
Pada real time PCR hasil amplifikasi melalui
metode real time PCR terukur secara “real time”
seiring dengan berlangsungnya reaksi PCR STEP 3
DATA
ANALISIS

Aplikasi
STEP 2 -Forensik
REAKSI
-dna Sequencing
PCR -diagnosa penyakit

Tahap PCR
STEP 1
DESIGN 1. Denaturasi
2. Annealing
PRIMER 3. Perpanjangan
(extention)
INDIKATOR
-% GC (>50%)
-Panjang Primer (15-30 pb)
- Hindari self dimmer, pair dimmer, hairpin
-Temperatur penempelan primer tidak jauh berbeda
 RT-PCR
Komponen reaksi PCR
1 2 3 4
DNA TARGET PRIMER DNA Polimerase BUFFER
DNA sampel Oligonukleotida Enzim yang cukup MgCl2, Tris HCL dan
mengandung DNA komplemen DNA stabil dalam KCL
target target pemanasan

Denaturasi Annealing Extention Monitoring

5 6 2010
dNTP Fluorescent
Detector
Nukleotida untuk
perpanjangan Ethidium bromide
utas DNA
 Tahap RT PCR

Denaturasi Annealing
1,5 menit 50 oC
5 menit 95 oC

rt PCR

Extention Analisa
1-10 menit 72 oC
 Denaturasi

Annealing

Pemanjangan Pemanjangan
Proses amplifikasi DNA target
Elektroforegram hasil PCR

1 2 3

23.1 kb
9.4 kb
6.5 kb 2,6 kb
4.3 kb
2.3 kb
1 2 kb 3
2.0 0,2 kb
More Cycles = More DNA

Ukuran Jumlah siklus

Marker 0 10 15 20 25 30
 Aplikasi RT-PCR

01 02 03 04

Isolasi Gen DNA Sequencing Forensik Diagnosa Penyakit

• DNA Makhluk hidup • Melihat urutan basa • Identifikasi korban • Diagnosa flu babi
cukup besar suatu DNA • Hasil akurat
atau pelaku
• DNA manusia -/+ 3 miliar • Identifikasi organisme • Amplifikasi hanya
basa kejahatan
hasil isolasi dilakukan pada fragmen
• Isolasi gen penghasil
• Identifikasi tingkat
• Penatibus sit amet DNA virus flu babi
Insulin • Lorem ipsum dolor
kekerabatan organisme (H1N1)
• menyisipkannya gen
insulin ke sel bakteri

13
Terimakasih