POLYMERASE CHAIN

REACTION

Ririn Ramadhany, Ph.D

 Polymerase Chain Reaction

• Perbanyakan DNA spesifik dengan metoda in

vitro dan enzimatis
• template : DNA
 KOMPONEN PCR

• deoksiribonukleotida
trifosfat (dNTP)
PCR • enzim termostabil
Reagensia Taq DNA polimerase
• Ion Mg2+
• Buffer
• Primer Forward
PCR • Primer Reverse
Reagensia • Probe
• Template DNA
 PRINSIP PCR

Perbanyakan DNA spesifik dengan metode invitro dan enzimatis. PCR

dilakukan dengan kondisi siklus.

DENATURASI
Memisahkan dua untai DNA menjadi
tunggal

ANNEALING
Tahapan penempelan primer spesifik
untuk memulai amplifikasi

ELONGATION
Tahapan pemanjangan untai DNA
spesifik dengan templatenya
TAHAPAN PCR
 REAL TIME (QUANTITATIVE)
POLYMERASE CHAIN REACTION

• Teknik amplifikasi (perbanyakan) DNA dimana

produk amplifikasi dapat dianalisis pada setiap
siklusnya dengan menggunakan fluorogenic
probe

• Produk amplifikasi dapat dideteksi sekaligus

dikuantifikasi pada saat proses berlangsung
sehingga tidak memerlukan perlakukan post-
PCR
 KOMPONEN MASTER MIX qPCR
Konvensional Real Time
• PCR Buffer (ion Mg) • PCR Buffer (ion Mg)
• dNTPs • dNTPs
• Enzim Reverse Transcriptase • Enzim Reverse Transcriptase
• Enzim Taq Polymerase
• Enzim Taq Polymerase
• Primer Forward
• Primer Forward
• Primer Reverse
• Primer Reverse
• Probe
Probe : Sekuen oligonukleotida pendek yang didesain untuk berhibridisasi
dengan sekuen target

5’ 3’
 METODE DETEKSI

1. Non-specific Detection using DNA

Binding Dyes  SYBR Green Dye

2. Specific Detection Target Specific

Probes  Probe : TaqMan
 TAQMAN
Probe
1) Denature
Primer
Fluorescence Quencher

F Q
Polymerase
2) Annealing Hybridize

F
Q
3) Extension Cleavage

F
Q
PROBE FLUOROPHORE
 HASIL REAL TIME PCR

Specimen Thermal Fluorescence Analysis by

Preparation Cycling detection Computer

plateau Deteksi produk PCR secara otomatis saat proses

amplifikasi berlangsung.

eksponensial
Sinyal fluorescence vs siklus PCR
direkam dalam bentuk kurva amplifikasi.
Hasil akhir berupa nilai Ct yang merupakan
inisiasi perpotongan antara garis threshold dengan
kurva amplifikasi

Semakin banyak DNA copy, semakin awal sinyal terdeteksi  semakin rendah nilai Ct
 THRESHOLD

Threshold berada diatas baseline sinyal fluorescence. Sinyal fluorescence yang

terdeteksi diatas threshold adalah sinyal yang digunakan dalam menentukan nilai
threshold cycle (Ct).

Pengaturan threshold manual  diletakkan diatas noise atau background kurva

amplifikasi

Threshold
SYBR GREEN I CHEMISTRYc

• Intercalating dye

• Berikatan dengan
DNA untai ganda

• Saat berikatan
dengan DNA akan
muncul fluoresensi

• Tidak spesifik
SYBR GREEN Assay

• SYBR green dapat berpendar sejak awal

primer menempel pada untai DNA

• Sinyal SYBR green akan meningkat

sejalan dengan banyaknya amplicon
yang terbentuk

• Karena SYBR green menempel pada

semua untai ganda, maka diperlukan
spesifisitas yang tinggi untuk primer
(non-specific ataupun dimer)
Melting Curve Analysis

Melting curve analysis is an assessment of the

dissociation characteristics of double-stranded
DNA during heating.

As the temperature is raised, the double strand

begins to dissociate leading to a rise in the
absorbance intensity, hyperchromicity.
 ANALISIS HASIL REALTIME PCR

• Kualitatif (pos/neg) • Kuantitatif

Quantitative Analysis

Harus menggunakan beberapa standard

control yang telah diketahui konsentrasinya

Dianalisis dengan menggunakan kurva

standard
X axis : pengenceran
Y axis : ct value
SINGLEPLEX VS MULTIPLEX REAL-TIME PCR
MULTIPLEX PCR
 SINGLEPLEX VS MULTIPLEX REAL-TIME PCR
Singleplex
• Hanya memerlukan 1 pasangan
primer dan probe
• Desain, dan optimasi lebih simple
• Interpretasi mudah
• Hanya bisa mendeteksi 1 target
Multiplex
• Menggunakan lebih dari 1 pasangan primer,
probe
• Desain dan optimasi menjadi lebih complex
• Kemungkinan ada primer-primer competition
• Primer dimer sangat krusial
• Dapat mendeteksi lebih dari 1 target dalam
waktu bersamaan
• Lebih ekonomis dan cepat
 TROUBLESHOOTING

Masalah Kemungkinan penyebab

Komposisi mastermix tidak optimal
Suhu PCR tidak optimal
Tidak ada amplifikasi Ada inhibitor
Template RNA/DNA rusak
Probe terdegradasi
Kontaminasi
Sinyal pada negative
Probe terdegradasi
control
Primer Dimer
Konsentrasi template terlalu tinggi
Sinyal terdeteksi terlalu
Probe terdegradasi
awal
Primer Dimer
REALTIME PCR