PCR and Design Primer

Erlix R Purnama, M.Si.

2024
PCR?
Polymerase chain reaction (PCR) adalah metode yang
digunakan dalam biologi molekuler untuk membuat
banyak salinan segmen DNA tertentu
- Saiki, 1988

” PCR dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983 ketika ia menjadi
karyawan di Cetus Corporation. Kemudian dianugerahi Hadiah Nobel
Kimia pada tahun 1993 untuk pekerjaannya dalam mengembangkan
metode ini.
” – Mulis et all., 1983
Polymerase Chain Reaction
Merupakan teknik perbanyakan DNA target secara in vitro

 Polymerase = Menggunakan enzim DNA polimerase

 Chain = Produk reaksi pertama menjadi template DNA untuk reaksi berikutnya
 Reaction = menghasilkan produk yang berlipat secara eksponensial

 Spesifik
 Cepat
 Sensitif
General Mechanism

Mekanisme dasar adalah proses repliklasi DNA, namun dilakukan modifikasi dan DNA Polimerase
merupakan satu-satunya enzim digunakan

Topoisomerase
Helixase

Single-Strand Binding
Protein

DNA Polymerase III & I

Ligase
DNA Primase
General Mechanism

Polimerase Chain Reaction  Reaksi Polimerasi yang terjadi secara berantai membentuk suatu siklus berulang
General Workflow
Metode PCR

Elektroforesi
+ gels doc

PCR
Detruksi Purifikasi Uji konsentrasi &
Jaringan DNA/RNA kemurnian

Preparasi Purifikasi PCR Setup & Visualisasi

Quality Control Hasil
Sampel DNA/RNA PCR
 EKSTRAKSI DNA

• Ekstraksi - suatu proses untuk mendapatkan DNA yang dilakukan secara mekanik atau enzimatis

HOW?
 Metode Destruksi Sampel

Mekanik Kimiawi
• Ultrasonikasi • Lysis buffer
• Nitrogen cair • Enzimatik (Proteinase-K /
• Blender Proteinase)
• Bead
 Purifikasi DNA

• Menggunakan kolom silika:

a. Binding (Ex: Chaotropic agent)
b. Washing (Ex: Guanidine salt + Etanol)
c. Elution (Ex: RNA-free Water; buffer elution)
QC: Konsentrasi dan
Kemurnian
 Menggunakan Nano-volume UV quantification
 Dapat digunakan sebagai kontrol eksternal

 Rasio A260/A280: Rekomendasi sekitar 1.8-2.1

< 1.8 terdapat kontaminasi protein,
> 2.1 terdapat kemungkinan adanya kontaminasi garam

 Rasio A260/A230: Rekomendasi sekitar 2.0-2.2

Jika lebih kecil berarti ada kontaminasi garam, EDTA,
karbohidrat, peptida, and phenol (secara umum aromatic
compounds)
 Komponen PCR

Template
DNA sample (can be gDNA, cDNA,
mDNA, plasmid DNA, or DNA Tool
amplicon from previous PCR)

primer (additional oligo ssDNA)

dNTPs KIT
dATP, dGTP, dTTP, dCTP

Taq Polimerase
Heat-susceptible DNA Taq Polimerase
from Thermus aquaticus Reagent
Thermal Cycler
co-factor
Mg2+ (or Mn2+), KCl
 Mengapa Spesifik?

Tiap makhluk hidup memiliki urutan DNA yang berbeda-beda

Perbedaan tersebut dimanfaatkan dalam PCR melalui desiain primer
General Steps

 Denaturation
• Denaturasi DNA untai ganda (double-stranded DNA) (melting) menjadi untai tunggal
• Temperature di atas 90°C
 Annealing
• Temperatur 40-65°C, primer menempel (anneal) pada urutan komplementer pada DNA target
• Suhu optimum tergantung dari urutan primer dan sekitar 5°C di bawah Tm primer
 Extension
• Proses pemanjangan untai DNA baru pada ujung 3’ oleh enzim DNA polymerase pada temperatur 70-72°C

Nb: Pada beberapa reaksi dengan ukuran amplicon pendek, tahap annealing dan Extension digabung
pada suhu 60ᵒC
Siklus Reaksi

Siklus PCR
General Steps
General Mechanism
 Visualisasi Hasil

Hasil End-point PCR dapat divisualisasi dan dianalisis menggunakan teknik elektroforesis. Dapat juga
dilanjutkan hingga bloting (Southern & Nortern blotting)

• Elektroforesis gel adalah suatu metode yang

digunakan untuk memisahkan dan
menganalisis fragmen-fragmen makromolekul
(asam nukleat dan protein)
• Menggunakan gel sebagai “saringan”
 Konvensional vs Real-Time PCR

Jika menggunakan Real-

Time, jumlah DNA yang
sangat sedikit dapat
dideteksi

Hampir Tak Terlihat &

rawan miss-interpletasi
Konvensional vs Real-Time PCR
General Overview qPCR

• Polymerase chain reaction (PCR) adalah metode yang digunakan dalam bidang
biologi molekular untuk memperbanyak salinan suatu segmen DNA – Saiki,
1988
• Merupakan metode standar dan dikenal sebagai salah satu metode
kuantifikasi gen yang mudah dan relatif terjangkau.
• Salah satu teknologi yang paling baik, terpercaya, dan handal pada bidang
biologi molecular saat ini
• Telah digunakan secara luas pada banyak bidang di seluruh dunia
Manfaat

• Kemampuan deteksi yang presisi jumlah kopi DNA target pada

tiap reaksi
• Mengeliminasi perlakuan post-PCR karena reaksi dan deteksi
dilakukan sekaligus pada tabung yang sama
• Progres reaksi PCR dapat diamati secara langsung (real time)
• Relatif murah, sensitive, dan telah digunakan secara luas
sehingga telah dilakuan berbagai proses divalidasi dan
pengembangan
General Workflow
Metode PCR

Detruksi Purifikasi Uji konsentrasi & Real-time PCR

Jaringan DNA/RNA kemurnian

Preparasi Purifikasi PCR Setup &

Quality Control
Sampel DNA/RNA PCR
General Workflow

Pengambilan data
jumlah DNA baru yang disintesis
Prinsip kerja Real-Time PCR
Reporter Type

Suatu molekul kimia (Fluorophore) yang dapat mengemisikan cahaya (berbendar) ketika tereksitasi dan
digunakan sebagai penanda jumlah DNA hasil PCR (amplikon) yang disintesis

01 Non-Specific Detection

Double-stranded DNA-binding dyes

Specific Detection 02

Probe-based method (Fluorescent-Quencer reporter)

Universal Dye
 Universal Dye
Cahaya Eksitasi

Cahaya Emisi

Cahaya Eksitasi

Cahaya Emisi
Probe
Mekanisme Visualisasi

Reaction chamber
Detection
filters

Lens

PMT
detector
assembly
LED light
Tubes in rotor
source
spin past optics
assembly

Spindle/motor
assembly
Mekanisme Visualisasi

Filter set
Rotor spins tubes at 400
(rotates for each
rpm
channel)

Sensitive PMT
(photomultiplier) detector

LED light source

(rotates for each channel)
Mekanisme Visualisasi

Trusted Partner for Laboratory Solution

Data Presentation

Baseline
level fluorensi pada saat inisiasi
reaksi

Threshold
Level fluorensi yang secara statistic
merefleksikan peningkatan level
fluorensi yang signifikan

Threshold Cycle (Ct)

jumah siklus yang dibutuhkan agar
level fluorensi mencapai threshold.
Data Presentation
 Data Presentation

Jumlah awal Siklus Reaksi ke-15 Siklus Reaksi ke-20 Siklus Reaksi ke-25
template (x.215) (x.220) (x.225)
3
1 1. 215 = 32.768 1. 220 = 1.048.576 1. 225 = 33.554.432
2
10 10. 215 = 327.680 10. 220 = 10.485.760 10. 225 = 335.544.320
1
100 100. 215 = 3.276.800 100. 220 = 104.857.600 100. 225 = 3.355.443.200

Misal batas deteksi minimum adalah 3.000.000 kopi

 Primers dictate the successfulness of a PCR

Specificity?

Proper
annealing to
the template?
Apa itu Primer?
• Primer merupakan rantai pendek asam nukleat
yang digunakan untuk mengawali sintesis DNA.

• Primer akan mengamplifikasi sekuen tertentu dari

target gen yang dicari.

• Primer terdiri dari forward (FWD) dan reverse (REV)

primer dengan masing-masing memiliki sekuen 5’
 3’.
Primer
Parameter Penting
• Ukuran primer : primer sebaiknya berukuran 18-24
bp.
• Primer yang terlalu pendek menurunkan spesifitas
untuk anneal ke sekuen target.
• Sedangkan primer yang terlalu panjang maka dapat
menurunkan efisiensi annealing
Parameter Penting
• Jumlah residu G dan C antara 50-60% untuk setiap
primer untuk menghasilkan produk PCR yang stabil.

• Beberapa ahli juga memperkenankan jumlah residu

G – C antara 40-60%.

• Primer sebaiknya berakhir dengan residu G atau C

pada 3’ end (GC clamp) karena residu yang lain
akan berikatan kurang spesifik dengan rantai DNA
Parameter Penting
• Perbedaan melting temperature (Tm) antar primer
tidak lebih besar dari 5°C.
• Primer yang ideal memiliki Tm antara 55-65 °C

• Shorter than 13: Tm= (A+T) X 2 + (G+C) X 4

• Longer than 13: Tm= 64.9 + 41(G+C-
16.4)/(A+T+G+C)

• Formulae are from http://www.basic.northwestern.

edu/biotools/oligocalc.html
Parameter Penting
• Memiliki distribusi yang balance antara G/C dan
A/T domains.
• No long strings of a single base (<4)
Parameter Penting
• Hindari pembentukan struktur sekunder
• Self complementary diusahakan memiliki
prosentase serendah mungkin untuk menghindari
primer dimer atau pembentukan hairpin loops
Posisi Primer yang Baik
Links for designing primers
• Pada dasarnya merancang sebuah primer berbeda
untuk setiap teknik yang digunakan, sebagai
contoh, merancang primer untuk qPCR dan kloning
tentu berbeda, terutama pada parameter yang
perlu diperhatikan.

• Namun, pada umumnya, aplikasi yang digunakan

adalah Primer Blast dari NCBI, dapat diakses
melalui :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Links for designing primers
• http://www.tataa.com/
• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
• www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netp
rlaunch.html
• www.ensembl.org
• http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-
bin/primer/primer3_www.cgi
• http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/dna/for
m1.cgi
• Primer Design- Beacon Designer/AlelleID
• Primer express 3 (AB)