Nah, bagaimana Prinsip kerjanya?

Apakah kamu tahu bahwa prinsip kerja Polymerase Chain Reaction PCR mencontoh
bagaimana DNA di dalam tubuh manusia dapat diperbanyak? Ternyata DNA di dalam tubuh kita
juga diperbanyak, lho, fenomena ini dikenal dengan sebutan replikasi DNA. karena setiap sel di
tubuh manusia harus terus diperbaharui dan terus tumbuh dan berkembang sesuai
pertambahan usia. Maka dari itu, DNA di dalam tubuh juga harus ikut diperbanyak karena setiap
sel tubuh kita membutuhkan unit DNA.
Seperti dalam proses replikasi DNA pada organisme hidup, teknik PCR juga membutuhkan
sebuah Enzim DNA polymerase yang bertugas untuk membuat kopian strand DNA baru
dengan menggunakan stand DNA yang sudah ada sebagai template. DNA polimerase yang
biasanya digunakan pada teknik proses PCR disebut dengan Taq polymerase, yaitu enzim
DNA polimerase stabil yang berhasil diisolasi dari bakteri termofilik
ekstrem Thermus aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik. Sifatnya yang
thermostabil membuat Taq polymerase ideal untuk digunakan pada tahap pemisahan
(denaturasi) template DNA.
 
Baca Juga : Fungsi Aplikasi PCR Selain Diagnosa Penyakit
 
Selain Taq polymerase, adanya Primer juga dibutuhkan, sekuen nukleotida pendek yang dapat
menginisiasi starting point dari sintesis DNA. Dalam reaksi berantai (Polimerase Chain
Reaction) PCR, pelaku eksperimen sudah menentukan sebelumnya daerah DNA mana yang
akan dikopi dan diamplifikasi dengan memilih urutan primer mana yang akan digunakan. Primer
PCR berupa single stranded DNA dan panjangnya berukuran sekitar 20 nukleotida. Pada
prinsip kerja PCR, digunakan sebanyak 2 primer yang didesain mengapit daerah DNA yang
ingin diperbanyak.
Setelah primer berikatan dengan DNA templat, untai tunggal DNA akan diperpanjang oleh
enzim DNA polimerase dan daerah yang diapit akan terkopi.
Cara Kerja PCR
Kunci dalam pelaksanaan reaksi PCR membutuhkan Taq Polymerase, Primer, DNA templat
dan nukleotida (blok pembangun DNA). Keseluruhan bahan digabung dalam
sebuah tube, bersama kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim, dan melewati siklus pemanasan
dan pendingan berulang yang memungkinkan terjadinya amplifikasi DNA.
Langkah kerja PCR melewati 3 tahap berikut:

1. Denaturation / denaturasi (96°C): Pada proses denaturasi, panas

mempengaruhi strand DNA akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-
stranded).
2. Annealing / penempelan (55-65°C): Pada tahap penempelan ini, suhu annealing primer
akan menempel dan berikatan pada daerah komplementer pada sekuen single-stranded
DNA.
 3. Extension / elongasi (72°C): Pada suhu ini Taq polymerase melakukan pemanjangan
membentuk strand DNA baru.

Siklus ini berulang 25-35 kali dalam reaksi PCR, dimana membutuhkan waktu sekitar 2-4 jam
bergantung pada Panjang DNA yang ingin dikopi. Jika reaksinya efisien, wilayah target dapat
berubah dari hanya satu atau beberapa salinan menjadi milyaran. Karena ada banyak salinan
atau untai ganda primer dan banyak molekul Taq polymerase yang mengambang di sekitar
reaksi, sehingga jumlah molekul DNA kira-kira bisa berlipat ganda dalam setiap putaran siklus.
Pola pertumbuhan eksponensial ini ditunjukkan pada gambar di bawah ini.

Hasil dari reaksi PCR dapat divisualisasi menggunakan Gel Electrophoresis. Prinsip dari gel
electrophoresis yaitu pemanfaatan kutub positif dan negatif elektroda untuk menarik fragmen
DNA didalam matriks gel berarus listrik sehingga fragmen DNA terpisah berdasarkan
ukurannya. Sebagai standar digunakan DNA ladder untuk mengukur ukuran suatu fragment
DNA hasil PCR. Fragmen DNA dengan panjang yang sama membentuk ‘pita’ pada gel, yang
dapat dilihat dengan mat ajika gel diwarnai dengan pewarna pengikat DNA. Sebagai contoh,
reaksi PCR yang menghasilkan fragmen 400 base pair (bp) terlihat seperti pada gel.
Polymerase Chain Reaction PCR berkerja dengan visualisasi menggunakan gel elektroforesis
menggunakan mesin PCR konvensional. Dengan teknik ini, hasil PCR hanya dapat dilihat
diakhir setelah proses selesai menggunakan gel elektroforesis (kualitatif) dan tidak dapat
dikuantifikasi. Dengan perkembangan teknologi, kini hasil PCR dapat dilihat secara langsung
dan dapat terkuantifikasi menggunakan mesin Real-time PCR. Real-time PCR disebut juga
dengan quantitative PCR (qPCR) karena hasil PCR dapat analisis secara kuantitatif.

Bagaimana prinsip kerja Real-time PCR?

Prinsip kerja real-time PCR (qPCR) sama dengan PCR konvensional. Namun untuk melihat
proses amplifikasi secara nyata ‘real-time’, perlu penambahan probe fluorescence
(penanda) pada target sampel PCR sehingga cahaya fluorescence dapat tertangkap oleh
detektor yang terdapat pada mesin real-time PCR. Oleh karena itu, jika jumlah salinan gen
meningkat selama reaksi, fluoresensi juga akan meningkat yang mana menunjukkan kemajuan
pada reaksi PCR. Hasil reaksi PCR menggunakan mesin real-time PCR, dilihat berupa kurva
eksponensial pada software komputer dimana kurva Y menunjukkan jumlah cahaya
fluorescence yang tertangkap, sedangkan kurva X menunjukkan jumlah siklus PCR yang
berlangsung.

Bagaimana untuk sampel RNA?

RNA adalah materi genetik nukleotida beruntai tunggal (single-stranded RNA), sehingga untuk
dapat memenuhi proses 1 denaturasi di mesin PCR, RNA perlu dikondisikan menjadi RNA
beruntai ganda yang disebut complementary DNA (cDNA). Proses pembuatan cDNA dari
RNA memerlukan sebuah enzim yang bernama Reverse Transcriptase. Dalam pengerjaannya
enzim Reverse Transcriptase ditambahkan kedalam tube bersama bahan PCR lainnya. Proses
pengerjaan PCR yang menggunakan sampel RNA ini disebut juga dengan Reverse
Transcription PCR (RT-PCR). Namun saat ini jarang sekali peneliti melakukan pengerjaan
sampel RNA menggunakan mesin PCR konvensional. Umumnya peneliti RNA menggunakan
mesin real-time PCR untuk mengamplifikasi sampel RNA, karena waktu yang dibutuhkan lebih
singkat karena proses reverse transcription dan amplifikasi dapat dilaksanakan dalam satu
rangkaian sekaligus. Selain itu penggunaan mesin real-time memungkinkan hasil amplifikasi
terlihat secara langsung dan dapat terkuantifikasi. Proses amplifikasi RNA menggunakan mesin
real-time PCR disebut juga dengan RT-qPCR.
Genecraft Labs sebagai salah satu distributor alat laboratorium, bioteknologi terbesar dan
terpercaya di Indonesia memiliki beberapa pilihan instrumen mesin PCR yang dapat memenuhi
kebutuhan penelitian anda, antara lain:
Mesin PCR konvensional:

 SENSOQUEST Labcycler 48 – Gradient Thermocycler (PCR)

 SENSOQUEST Labcycler Thermocycler

Mesin Real-time PCR:

 QIAGEN Rotor-Gene Q
 QIAGEN QIAquant 96