Nama Pemeriksaan : Amplifikasi DNA dengan Real-Time PCR (qPCR)

Tujuan : Meningkatkan jumlah copy/ salinan dari DNA target agar dapat
divisualisasikan, dianalisis bahkan dilanjutkan untuk pengurutan
nukleotida (sekuensing)

Metode : Real-Time PCR (kuantitatif)

Prinsip Kerja Real-Time PCR :

Mendeteksi dan menguantifikasi reportes fluoresen. Sinyal fluoresen akan

meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR dalam reaksi.
Dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus, reaksi selama
fase eksponensial dapat dipantau. Peningkatan produk PCR yang
signifikas pada fase eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi gen
target. Makin tinggi ekspresi gen target maka deteksi emisi fluoresen
makin cepat terjadi.

Dasar Teori:

Real-Time PCR (qPCR) adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi
PCR. Dalam Ilmu Biologi Molekuler, Real-Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real
time polymerase chain reactiin (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction), adalah
suatu teknik pengerjaan PCR di laboratoriun untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus
menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil ampifikasi tersebut. Real-Time PCR
memungkinkan dilakukan deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan
DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang
ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa.

Real-Time PCR (qPCR) atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR) atau
PCR kinetik adalah teknik laboratoriun berdasarkan PCR, yang digunakan untuk
mengamplifikasi dan secara simultan mengukur molekul DNA target. Untuk satu atau lebih
urutan tertentu dalam sampel DNA, Real-Time PCR memungkinkan deteksi dan kuantitstif
secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlah salinan mutlak atau jumlah relatif
ketika dinormalisasi untuk DNA yang dimasukkan atau gen normalisasi tambahan.

Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi
(end point) dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah
dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan Real-Time PCR
memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA
hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresesensi
dari probe (penanda). Pada Real-Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap
elektroforesis, sehungga tidak lahi dibutuhkan gel agarosa dan penggunaan Ethidium Bromide
(EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.

Dua metode umum untuk mendeteksi produk PCR secara Real-Time PCR adalah:

(1) Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang terinteraksi dengan DNA beruntai ganda
(dsDNA) misalnya SyBr Green.

(2) Probe (penanda) DNA yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan
berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe FRET
(Hybrisdisasi) dengan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi
yang dipancarkan akan meningkat secara proposional setiap siklus PCR telah berhasik dilakukan
sejalan dengan bertambahnha produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan.

Prinsip kerjanya didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh molekul
reporter yang meningkat sejalan dengan berlangsungnya proses PCR. Hal ini terjadi karena
akumulasi produk PCR pada tiap siklus amplifikasi. Molekul reporter dengan fluoresensi
meliputi pewarna yang berikatan pada double-stranded DNA (menggunakan SYBR®Green atau
EvaGreen®Reagents ) atau menggunakan probe spesifik sekuens/sequence specific probes
(Molecular Beacons or TaqMan® Probes).

Gambar 1. Contoh Mesin Real Time PCR

Analisis menggunakan Real-Time PCR memiliki sensitivitas tinggi dan lebih spesifik
untuk produk PCR tertentu. Keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang
muncul sebagai hasil akumulasi fluorescence dan probe (penanda). Perubahan fluorescence
selama reaksi diukur dengan instrumen yang menggabungkan siklus termal dengan kemampuan
scanning fluorescence dye. Dengan memplot fluorescence terhadap jumlah siklus, Real-Time
PCR menghasilkan plot Amplifikasi yang mewakili akumulasi produk selama seluruh reaksi
PCR berlangsung.
 Gambar 2.

Sumber: Real-Time PCR Handbook. 2012. Life Technologies Corporation

Fluoresensi vs jumlah siklus Real-Time PCR.

Dalam Real-Time PCR, terdapat jenis fluorescence. Sebagian besar orang menggunakan
fluorescense ( SYBR® Green dye - based assay) atau deteksi hydrolysis probe based solution
(TaqMan® or Perfect Probe). Proses SYBR Green Fluorescence DNA Binding Dye yakni
SYBR mengikat DNA untai ganda tetapi tidak satu untai DNA. Sedikit fluoresensi dipancarkan
dari SYBR dalam larutan. SYBR mengikat DNA untai ganda memancarkan fluoresensi sangat
terang. Intensitas sinyal SYBR berkolerasi dengan DNA yang diamplifikasi (jumlah amplifikasi).

Real-time PCR juga meliputi Real Time-RT PCR dimana PCR dilakukan secara Real-Time
menggunakan enzim Reverse Transcriptase secara langsung pada waktu yang bersamaan. Real
Time-RT PCR memiliki tambahan siklus Reverse Transcription yang memacu perubahan
molekul DNA dari molekul RNA. Real Time-RT PCR diperlukan karena RNA kurang stabil
dibandingkan dengan DNA.

Gambar 3. Proses Real-Time PCR pada deteksi target non-spesifik (Fraga et al., 2008).
 Pada prosedur Real-Time PCR, molekul reporter dengan fluoresensi (pada Gambar 3
ditunjukkan dengan bagian berwarna hijau) digunakan untuk memonitor proses PCR.
Fluoresensi akan dipendarkan oleh molekul sebagaimana terakumulasinya produk PCR pada tiap
siklus proses amplifikasi.

Referensi:

1. https://www.generasibiologi.com/2016/03/real-time-pcr.html

2. Tim Praktik Biologi Molekuler.2019. Modul Praktikum Biologi Sel dan Molekuler.
Jurusan Analis Kesehatan Poltekkes Kemenkes Bandung.