Hibridisasi Berbasis Array

Dot/Slot Blotv

Ada banyak variasi pada metode hibridisasi Selatan. Dalam kasus di mana penentuan ukuran target tidak
diperlukan, DNA dan RNA dapat dianalisis lebih cepat menggunakan dot blot atau slot blot. Prosedur ini
biasanya diterapkan pada ekspresi, mutasi, dan analisis amplifikasi / penghapusan. Untuk dot atau slot
blot, DNA atau RNA target disimpan langsung pada membran.
Berbagai perangkat, beberapa dengan sistem vakum, telah dirancang untuk menyimpan
target pada membran. Pipet dapat dig unakan untuk prosedur pengujian hanya beberapa sampel.
Untuk dot blot, target disimpan dalam lingkaran atau titik. Untuk slot blots, target disimpan di
bar anoblong (Gbr. 6-21). Kunci blot lebih akurat untuk kuantisasi dengan pemindaian
densitometri karena menghilangkan kesalahan yang mungkin timbul dari pemindaian melalui
target melingkar. Jika diameternya area yang dipindai tidak persis sama dari satu sampel ke
sampel lainnya, hasil perbandingan mungkin tidak akurat. Dot blot berguna untuk beberapa
analisis kualitatif di mana banyak target yang dibandingkan, seperti analisis mutasi.
Dot dan slot blot dilakukan paling efisien pada sampel yang kurang kompleks, seperti
produk PCR atau preparasi mRNA yang dipilih. hibridisasi silang tidak dapat dibedakan secara
pasti dari identifikasi target yang sebenarnya. Kontrol negatif (DNA dengan kompleksitas yang
sama tetapi tanpa urutan yang ditargetkan) menjadi dasar untuk interpretasi tes ini. Saat
melakukan analisis ekspresi dengan slot atau dot blot, penting juga untuk menyertakan
amplifikasi atau kontrol normalisasi, seperti yang ditunjukkan di sebelah kanan pada Gambar 6-
21. Hal ini memungkinkan koreksi untuk pembebanan atau perbedaan sampel. Kontrol ini juga
dapat dianalisis secara terpisah duplikat membran untuk menghindari reaksi silang antara uji dan
kontrol probe.

Gambar 6-21 Contoh konfigurasi titik titik (kiri) dan noda slot (kanan). Target terlihat dalam rangkap dua,
berdampingan, pada titik titik. Dua baris terakhir dari titik berisi kontrol positif, sensitivitas dan negatif
diikuti dengan kosong tanpa target. Dua baris teratas dari slot blot gel di sebelah kiri mewakili empat
sampel terlihat dalam rangkap dua, dengan sensitivitas positif dan kontrol negatif diikuti dengan blanko
tanpa target pada empat sampel terakhir di sebelah kanan. Dua baris terbawah mewakili kontrol pemuatan
atau normalisasi yang sering berguna dalam studi ekspresi untuk mengonfirmasi bahwa jumlah DNA atau
RNA yang sama terlihat untuk setiap sampel uji.
Teknologi Array Genom

Teknologi array dapat diterapkan pada analisis gen (DNA) dengan melakukan hibridisasi genom
komparatif dan analisis ekspresi gen (RNA atau protein) pada array ekspresi. Ada beberapa jenis
teknologi array, termasuk makroarray, mikroarray, oligonukleotida densitas tinggi array, dan
array mikroelektronika.

Macroarrays

Berbeda dengan Northern dan Southernblots, dot (dan slot) blot menawarkan kemampuan untuk
menguji dan menganalisis jumlah sampel yang lebih besar pada saat yang bersamaan.
Metodologi ini terbatas, Namun, berdasarkan area bahan substrat, nitroselulosa membran, dan
volume hibridisasi solusi yang diperlukan untuk menyediakan probe yang cukup untuk
menghasilkan sinyal yang memadai untuk interpretasi.
Selain itu, meskipun hingga beberapa ratus sampel uji dapat dianalisis secara bersamaan,
sampel tersebut dapat diuji hanya untuk satu gen atau produk gen. Variasi dari teknik ini adalah
reverse dot blot, di mana beberapa probe yang berbeda diimobilisasi pada substrat, dan sampel
uji diberi label untuk hibridisasi dengan probe yang diimobilisasi. Dalam konfigurasi ini,
terminologi dapat membingungkan. Immobilizedprobe kadang-kadang disebut sebagai target,
dan spesimen berlabel DNA, RNA, atau protein disebut probe. Terlepas dari penunjukannya, ide
umumnya adalah bahwa urutan yang diketahui bergerak di lokasi yang diketahui pada noda, dan
jumlah sampel yang berhibridisasi ditentukan oleh sinyal dari sampel berlabel.
Reverse dot blot pada membran nitroselulosa dari beberapa hingga beberapa ribu target
adalah makroarray. Radioaktif atau sinyal chemiluminescent biasanya digunakan untuk
mendeteksi target hibridisasi dalam sampel. Macroarray dibuat dengan melihat beberapa probe
ke nitroselulosa membran. Hibridisasi bahan sampel berlabel dibaca oleh mata atau dengan
phosphorimager (perangkat pencitraan kuantitatif yang menggunakan fosfor penyimpanan
teknologi bukan film sinar-x). Analisis melibatkan perbandingan intensitas sinyal dari sampel uji
dan kontrol yang terlihat pada membran duplikat.
Meskipun makroarray sangat meningkatkan kapasitas untuk menilai banyak target, sistem
analisis ini masih dibatasi oleh area membran dan spesimen. persyaratan. Saat jumlah target
meningkat, volumebahan sampel yang dibutuhkan meningkat. Ini membatasi kegunaan metode
ini untuk digunakan pada sejumlah kecil bahan uji, terutama yang mungkin ditemui dengan
spesimen klinis.
Microarrays
Pada tahun 1987, penggunaan kaca yang diolah sebagai pengganti membran nitroselulosa atau
nilon untuk produksi susunan dikembangkan, meningkatkan keserbagunaan aplikasi susunan.
Dengan peningkatan teknologi bercak dan kemampuan untuk menyimpan bercak target yang
sangat kecil pada substrat kaca, susunan makro berkembang menjadi susunan mikro. Puluhan
ribu target dapat disaring secara bersamaan di area yang sangat kecil dengan memperkecil
pengendapan tetesan (Gbr. 6-22). Sistem penyimpanan otomatis (array) dapat menempatkan
lebih dari 80.000 titik pada substrat kaca seukuran slide mikroskop. Penyelesaian draft kasar dari
urutan genom manusia mengungkapkan bahwa genom manusia dapat terdiri dari kurang dari
30.000 gen. Jadi, bahkan dengan melihat urutan perwakilan dari setiap gen dalam rangkap tiga,
penyaringan simultan dari seluruh genom manusia pada satu chip berada dalam lingkup
teknologi array. Membran nitroselulosa yang lebih besar, kemudian, digantikan oleh slide
mikroskop kaca. Slide yang membawa susunan target disebut sebagai chip (Gbr. 6-23). Target
biasanya DNA, baik cDNA, produk PCR, atau oligomer; namun, target dapat berupa DNA,
RNA, atau protein. Target terlihat dalam rangkap tiga dan ditempatkan di seluruh chip untuk
menghindari artefak geografis yang mungkin terjadi dari hibridisasi yang tidak merata atau
masalah teknis lainnya. Probe biasanya cDNA yang dihasilkan dari sampel RNA tetapi juga
dapat berupa DNA genom, RNA, atau protein.
Metode lain yang digunakan untuk
menyimpan target pada chip termasuk
melakukan sintesis DNA secara langsung
pada kaca atau penyangga silikon.10
Teknik ini menggunakan informasi urutan
untuk merancang oligonukleotida dan
secara selektif menutupi, mengaktifkan,
dan mengikat nukleotida secara kovalen
pada posisi yang ditentukan pada chip.
Fotolitografi berpemilik teknik
(Affymetrix) memungkinkan sintesis
oligomer pendek yang sangat efisien
(panjang 10–25 basa) pada susunan kepadatan tinggi (Gbr. 6-24). Oligomer ini kemudian dapat
diselidiki dengan fragmen berlabel dari urutan tes. Dengan menggunakan teknologi ini, lebih dari
100.000 target dapat diterapkan pada chip. Jenis array ini disebut array oligonukleotida densitas
tinggi dan digunakan untuk mutasi analisis, analisis polimorfisme nukleotida tunggal, dan
sekuensing.
Jenis lain dari metode larik menggunakan mikroelektronika untuk memfokuskan target ke
posisi tertentu pada larik (Gbr. 6-25). Setelah terikat, target ini dapat dihibridisasi dengan sampel
DNA atau RNA berlabel di bawah kondisi yang terkendali. Ini adalah array mikroelektronika.
Dalam teknologi ini, setiap posisi pada array dilekatkan pada elektroda yang dapat diprogram
untuk menarik dan mengkonsentrasikan sampel berlabel. Dengan meningkatkan kondisi
hibridisasi secara terpisah di setiap titik pada larik, resolusi nukleotida tunggal dimungkinkan
bahkan pada fragmen sampel yang lebih panjang.

Persiapan sampel untuk analisis array membutuhkan fluorescent pelabelan sampel uji sebagai
microarrays dan array kepadatan tinggi lainnya dibaca oleh fluorescent otomatis sistem deteksi.
Metode pelabelan yang paling sering digunakan untuk RNA adalah sintesis cDNA atau salinan
RNA dengan penggabungan nukleotida berlabel. Untuk DNA, priming acak atau terjemahan
nick digunakan. Beberapa metode alternatif juga telah dikembangkan

Untuk analisis ekspresi gen, probe target diimobilisasi pada chip dihibridisasi dengan mRNA
berlabel dari sel yang dirawat atau jenis sel yang berbeda untuk menilai aktivitas ekspresi gen
yang diwakili pada chip. Array yang digunakan untuk aplikasi ini diklasifikasikan sebagai
ekspresi arrays.12 Array ekspresi mengukur transkrip atau produksi protein relatif terhadap
kontrol referensi yang diisolasi dari spesimen yang tidak diobati atau normal (Gbr. 6-26).

Aplikasi lain dari teknologi array adalah komparatif hibridisasi genom (array CGH). Metode ini
adalah digunakan untuk menyaring genom atau lokus genomik spesifik untuk penghapusan dan
amplifikasi.13 Untuk metode ini, DNA genom diisolasi, difragmentasi, dan diberi label untuk
hibridisasi pada chip (Gbr. 6-27). Jenis metode ini analog dengan teknik sitogenetik yang
dilakukan pada metaphase kromosom. Array CGH dapat memberikan resolusi yang lebih tinggi
dan informasi genetik yang lebih jelas daripada analisis sitogenetik tradisional, tetapi ini terbatas
pada analisis lokus yang direpresentasikan pada chip. Array genom dapat dilakukan pada
jaringan tetap dan sampel terbatas. Metode telah dikembangkan untuk mengamplifikasi DNA
genom secara global untuk meningkatkan analisis CGH.14,15 Membaca microarray
membutuhkan pembaca fluoresen dan perangkat lunak analisis.

Setelah penentuan latar belakang dan normalisasi dengan standar yang disertakan pada larik,
perangkat lunak rata-rata: intensitas sinyal dari data sampel duplikat atau rangkap tiga. Hasilnya
dilaporkan sebagai jumlah relatif dari referensi dan sinyal uji. Tergantung pada programnya,
varians lebih dari 2-3 standar deviasi dari 1 (test referensi) dianggap sebagai indikasi kenaikan
yang signifikan (tes:referensi 1) atau penurunan (tes:referensi 1) dalam sampel uji. Beberapa
keterbatasan pada teknologi array pada awalnya membatasi penggunaan mikroarray di
laboratorium klinis. Kurangnya standar dan kontrol yang ditetapkan untuk pengikatan yang
optimal mencegah kalibrasi array dari satu laboratorium ke yang lainnya. Tidak cukup data yang
terkumpul untuk menentukan pengikatan nonspesifik latar belakang dan hibridisasi silang yang
mungkin terjadi di antara dan di dalam serangkaian urutan tertentu pada larik. Misalnya, berapa
banyak variasi yang akan dihasilkan dari membandingkan dua sampel normal bersama-sama
beberapa kali? Latar belakang "noise" juga dapat mempengaruhi interpretasi hasil array.
Selanjutnya, hibridisasi pasif dari ribuan urutan yang berbeda akan menghasilkan afinitas
pengikatan yang berbeda di bawah yang sama kondisi ketat, kecuali urutan imobilisasi adalah
dirancang dengan hati-hati untuk memiliki suhu leleh yang sama. Untuk analisis mutasi, panjang
probe amobil dibatasi karena penggunaan kondisi hibridisasi tunggal untuk semua sekuens.
Untuk aplikasi ekspresi gen, hanya kuantitas relatif, bukan absolut, yang mungkin.
Kekhawatiran ini dan lainnya sedang ditangani untuk meningkatkan keandalan dan konsistensi
analisis array. Karena semakin banyak data yang terakumulasi, pengukuran dasar, standar
universal, dan kontrol yang direkomendasikan akan ditetapkan. Kemajuan dalam
mikroelektronika dan mikrofluida juga telah diterapkan pada desain dan pembuatan array.
Meskipun array, sampai saat ini, dalam penggunaan terbatas di laboratorium klinis, peningkatan
harga dan ketersediaan instrumentasi dan chip premade meningkatkan nilainya untuk aplikasi
medis. Persyaratan sampel minimal dan analisis komprehensif dengan investasi yang relatif
kecildalam waktu dan tenaga adalah fitur menarik dari teknologi array.