Teknologi Hibridisasi

Prosedur yang dilakukan di laboratorium molekuler klinis ditujukan untuk target spesifik dalam
DNA genom. Ini memerlukan visualisasi atau deteksi gen tertentu atau wilayah DNA di latar
belakang semua gen lainnya. Ada beberapa cara untuk menemukan wilayah DNA tertentu dari
dalam sampel DNA yang diisolasi.

Southern Blots

The Southern blot dinamai Edwin Southern, yang pertama kali melaporkan prosedurnya.1 Di
Southern blot, DNA diisolasi dan dipotong dengan enzim restriksi. Fragmen dipisahkan oleh
elektroforesis gel, depurinated dan didenaturasi, dan kemudian dipindahkan ke dukungan yang
solid seperti nitroselulosa. Pada langkah terakhir dari prosedur, fragmen DNA diekspos ke probe
berlabel (pelengkap DNA atau RNA) yang spesifik secara berurutan untuk wilayah yang
diinginkan, probe yang tidak terikat dihilangkan, dan sinyal probe terdeteksi untuk menunjukkan
adanya atau tidak adanya (kurangnya sinyal) dari urutan yang bersangkutan. metode asli
mensyaratkan hibridisasi dari radioaktif berlabel probe untuk mendeteksi daerah DNA yang akan
dianalisis. Selama ada penyelidikan identitas yang diketahui, prosedur ini dapat menganalisis gen
atau wilayah gen apa pun dalam genom pada tingkat molekuler. Bagian berikut akan jelaskan
bagian-bagian dari prosedur Southern blot secara rinci serta mendiskusikan modifikasi prosedur
secara berurutan untuk menganalisis RNA dan protein.

Pemotongan dan resolusi Enzim Restriksi

Setelah isolasi DNA, langkah pertama di Southern blot prosedurnya adalah pencernaan DNA
dengan restriksi enzim. Pilihan enzim yang digunakan akan tergantung pada aplikasi. Untuk
pemeriksaan laboratorium rutin, pembatasan peta wilayah DNA target sebelumnya akan
memiliki telah ditentukan, dan enzim yang sesuai akan direkomendasikan. Untuk metode lain,
seperti mengetik organisme yang tidak diketahui atau kloning, beberapa enzim mungkin diuji
untuk menemukan yang paling informatif.
Sepuluh hingga 50 g DNA genom digunakan untuk masing-masing pencernaan enzim
restriksi untuk analisis Selatan. Lebih atau kurang DNA dapat digunakan tergantung pada
sensitivitas sistem deteksi, volume dan konfigurasi sumur, dan kelimpahan DNA target. Secara
klinis laboratorium, ketersediaan spesimen dapat membatasi jumlah DNA yang dapat digunakan.
Setelah pencernaan enzim restriksi, fragmen yang dihasilkan diselesaikan dengan elektroforesis
gel. Persentase dan sifat gel akan tergantung pada ukuran Wilayah DNA yang akan dianalisis
(lihat Bab 5, Tabel 5.1 dan 5.2). Seperti semua elektroforesis, berat molekul standar harus
dijalankan dengan sampel uji.
Setelah elektroforesis, penting untuk mengamati DNA yang dipotong. Gambar 6-4a
menunjukkan gel yang diwarnai dengan etidium bromida dan disinari oleh sinar ultraviolet (UV).
DNA genom dipotong dengan enzim restriksi harus menghasilkan apusan yang mewakili
miliaran fragmen dari semua ukuran yang dirilis oleh pemotongan enzim. Kecerahan noda DNA
harus serupa dari jalur ke jalur, memastikan itu sama jumlah DNA ditambahkan ke semua jalur.
Di jalur mana pun, sejumlah besar DNA di dekat bagian atas gel menunjukkan bahwa aktivitas
enzim restriksi tidak sempurna. Sebuah noda yang terletak terutama di wilayah bawah jalur
adalah tanda bahwa DNA yang diisolasi terdegradasi. Salah satu dari ini dua kondisi terakhir
akan mencegah analisis yang akurat. Jika baik diamati, isolasi DNA dan / atau pembatasan
mencerna harus diulang sesuai.

Persiapan dan Resolved DNA untuk Blotting (Transfer)

Tujuan dari prosedur Southern blot adalah untuk menganalisis daerah tertentu dari sampel DNA.
Pertama, sampel DNA dicerna, yaitu, dipotong menggunakan berbagai pembatasan
endonuklease, dan kemudian fragmen DNA dipisahkan dengan elektroforesis. Fragmen
pembatasan yang dihasilkan berisi urutan target yang akan dianalisis jelas tidak dapat dibedakan
dalam apusan dari fragmen lain yang tidak memiliki urutan target. Target fragmen dapat
dideteksi dengan hibridisasi dengan homolog urutan DNA beruntai tunggal atau RNA berlabel
dengan penanda yang dapat dideteksi. Untuk mencapai hidrogen yang optimal ikatan antara
probe dan komplementernya urutan dalam DNA sampel yang diselesaikan, untai ganda Fragmen
DNA dalam gel harus didenaturasi dan dipindahkan ke membran nitroselulosa.

Depurinasi

Sebelum memindahkan fragmen DNA dari gel ke membran untuk blotting, fragmen DNA untai
ganda harus didenaturasi, atau dipisahkan, menjadi untai tunggal. Ini dilakukan saat DNA tetap
di tempatnya di dalam gel. Meskipun fragmen pendek dapat didenaturasi langsung seperti yang
dijelaskan di bawah ini, fragmen yang lebih besar (500 bp) lebih efisien didenaturasi jika
didepurinasi sebelum denaturasi (Gbr. 6-5). Oleh karena itu, untuk fragmen besar, gel terlebih
dahulu direndam dalam larutan HCl, suatu proses yang menghilangkan basa purin dari gula
fosfat tulang punggung. Ini akan "melonggarkan" fragmen yang lebih besar untuk denaturasi
lebih lengkap.

Denaturasi
Setelah depurinasi, DNA didenaturasi dengan memaparkan DNA dalam gel ke natrium
hidroksida. Basa kuat (NaOH) mendorong pemutusan ikatan hidrogen yang menahan untaian
DNA satu sama lain. Untaian tunggal yang dihasilkan kemudian tersedia untuk ikatan hidrogen
dengan probe untai tunggal. Selanjutnya, DNA untai tunggal akan mengikat lebih erat daripada
DNA untai ganda ke membran nitroselulosa pada saat transfer.

Perlakuan DNA dengan encer (0,1–0,25 mM) asam klorida menghasilkan hidrolisis glikosidik
ikatan antara basa purin dan gula dari nukleotida. Kehilangan purin ini (adenin dan guanin) dari
tulang punggung gula-fosfat dari DNA meninggalkan situs apurinik (Gbr. 6-5). DNA tulang
punggung tetap utuh dan memegang sisanya basis dalam urutan linier. Penghapusan beberapa
purin basa mempromosikan pemecahan hidrogen berikutnya ikatan antara dua untai DNA selama
langkah denaturasi di Southern blotting.

Blotting (transfer)

Sebelum mengekspos sampel DNA yang terdenaturasi ke probe, DNA harus ditransfer, atau
dihapus, ke substrat padat yang akan memfasilitasi pengikatan probe dan deteksi sinyal. Substrat
ini biasanya nitroselulosa, nitroselulosa pada penyangga inert, nilon atau selulosa yang
dimodifikasi dengan dietil amino etil, atau bahan kimia karboksi metil (CM) kelompok.
Membran jenis lain, polivinil difluorida (PVDF), digunakan untuk melumpuhkan protein untuk
probing dengan antibodi (Western blot).

Tipe Membran

DNA untai tunggal dengan rajin mengikat nitroselulosa membran dengan koneksi nonkovalen,
tetapi ireversibel. Interaksi pengikatan bersifat hidrofobik dan elektrostatik antara DNA
bermuatan negatif dan muatan positif pada membran. Berbasis nitroselulosa membran mengikat
70–150 g asam nukleat per persegi sentimeter. Ukuran pori membran (0,05 mikron hingga 0,45

mikron) cocok untuk fragmen DNA kecil hingga fragmen 20.000 bp panjangnya .
Nitroselulosa murni memiliki kapasitas pengikatan yang tinggi untuk protein dan juga asam
nukleat. Ini adalah yang paling serbaguna media untuk aplikasi transfer molekul. Itu juga
kompatibel dengan buffer dan deteksi transfer yang berbeda sistem. Nitroselulosa tidak sekuat
media lain dan menjadi rapuh dengan beberapa penggunaan kembali. Diperkuat nitroselulosa
lebih sesuai untuk aplikasi di mana: beberapa pemeriksaan mungkin diperlukan. Stabil secara
mekanis membran dapat diformulasikan dengan muatan netral bersih untuk mengurangi latar
belakang. Membran ini memiliki kapasitas pengikatan sangat tinggi (400 g / cm2), yang
meningkat kepekaan. Sebuah lampiran kovalen asam nukleat untuk ini membran dicapai dengan
UV cross-linking.
Membran dengan muatan positif lebih efektif mengikat fragmen kecil DNA. Membran ini,
bagaimanapun, lebih mungkin untuk mempertahankan protein atau kontaminan lainnya yang
akan berkontribusi pada latar belakang setelah membran diperiksa.
Sebelum transfer sampel, membran dibasahi dengan mengapungkannya di permukaan transfer
bumper. Setiap bintik kering (area di mana membran tidak tidak terhidrasi dengan baik) akan
tetap putih sementara sisanya membran menjadi gelap dengan buffer. Jika membran tidak tidak
terhidrasi secara merata, bintik-bintik kering akan menghambat pengikatan Sampel.
Metode Transfer

Transfer dapat dilakukan dengan beberapa cara. Tujuan dari semua metode adalah memindahkan
DNA dari gel ke membran substrat untuk pemeriksaan.
Metode asli yang dikembangkan oleh Southern menggunakan kapiler pemindahan (Gbr. 6-6).
Untuk transfer kapiler, gel ditempatkan di atas reservoir buffer, yang dapat menjadi dangkal
wadah atau kertas membran yang direndam dalam garam tinggi buffer, misalnya, 10X garam
natrium sitrat (10X SSC: 1,5 M NaCl, 0,15 M Na sitrat) atau transfer yang tersedia secara
komersial buffer. Membran nitroselulosa ditempatkan langsung pada gel, dan membran atau
kertas penyerap kering handuk ditumpuk di atas membran. penyangganya adalah dipindahkan
oleh aksi kapiler dari reservoir yang lebih rendah ke bahan kering di atas gel. Pergerakan
penyangga melalui gel akan membawa DNA terdenaturasi keluar dari gel. Ketika DNA kontak
dengan membran nitroselulosa, DNA akan mengikatnya sementara buffer akan lewat melalui
membran atau handuk kertas di atas.

Metode kedua, yang disebut transfer elektroforesis, menggunakan arus listrik untuk
memindahkan DNA dari gel ke membran (Gbr. 6-7). Sistem ini menggunakan elektroda melekat
pada membran di atas (anoda) dan di bawah (katoda) gelnya. Arus membawa DNA secara
melintang dari gel ke membran. Transfer elektroforesis adalah dilakukan dengan “tangki” atau
dengan pendekatan “semidry”. Di dalam metode tangki, elektroda mentransfer arus melalui
membran melalui buffer elektroforesis seperti yang ditunjukkan pada sosok itu. Dalam metode
semi kering, elektroda kontak sandwich gel-membran secara langsung, hanya membutuhkan
buffer yang cukup untuk merendam gel dan membran. Tangki transfer elektroforesis lebih
disukai untuk protein besar diselesaikan pada gel akrilamida, sedangkan metode semi kering
sering digunakan untuk protein kecil
Transfer vakum adalah metode ketiga dari blotting DNA (Gbr. 6-8). Teknik blotting ini
menggunakan suction untuk bergerak DNA dari gel ke membran dalam sirkulasi bumper. Seperti
transfer elektroforesis, metode ini mentransfer DNA lebih cepat, misalnya, dalam hitungan jam
daripada hari, dari transfer kapiler. Juga, transfer terputus-putus karena udara terperangkap di
antara membran dan gel dihindari. Salah satu kelemahan dari metode kedua dan ketiga adalah
biaya dan pemeliharaan elektroforesis dan peralatan vakum.

Setelah mengikat asam nukleat ke membran, potongan, DNA yang terdenaturasi secara
permanen diimobilisasi ke membran dengan memanggang membran dalam oven vakum (80 C,
30–60 mnt.) Atau dengan penautan silang UV, yaitu secara kovalen menempelkan DNA ke
nitroselulosa menggunakan sinar UV energi. Tujuan memanggang atau menghubungkan silang
adalah untuk mencegah fragmen DNA yang ditransfer dari pencucian atau bergerak pada
membran.
Setelah imobilisasi DNA, prahibridisasi langkah diperlukan untuk mencegah probe dari
mengikat ke situs nonspesifik pada permukaan membran, yang akan menyebabkan latar belakang
tinggi. Prahibridisasi melibatkan inkubasi membran dalam buffer yang sama dalam mana probe
selanjutnya akan diperkenalkan. Pada ini titik, buffer tidak mengandung probe. penyangga terdiri
agen pemblokiran seperti larutan Denhardt (Ficoll, polivinil pirolidina, albumin serum sapi) dan
salmon DNA sperma. Natrium dodesil sulfat (SDS, 0,01%) dapat juga disertakan, bersama
dengan formamida, yang terakhir terutama khusus untuk probe RNA. Membran terkena buffer
prahibridisasi pada suhu hibridisasi optimal selama 30 menit hingga beberapa jam, tergantung
pada protokol tertentu. Pada tahap ini sampel siap untuk hibridisasi dengan probe, yang akan
memungkinkan visualisasi dari gen tertentu atau wilayah yang diminati.

Northern Blots

Northern blot adalah modifikasi dari teknik Southern blot dan dirancang untuk menyelidiki
struktur RNA dan kuantitas. Meskipun sebagian besar analisis Utara dilakukan untuk
menyelidiki tingkat ekspresi serta stabilitas gen (transkripsi dari DNA), metode ini juga dapat
digunakan untuk menyelidiki kelainan struktural RNA yang dihasilkan dari penyimpangan dalam
sintesis atau pemprosesannya, seperti dengan melakukan penyambungan alternatif/ alternate
splicing. Abnormalitas pada saat splising dapat menyebabkan sejumlah penyakit, seperti beta-
thalassemias dan defisiensi hormon pertumbuhan terisolasi familial. Analisis struktur dan
kuantitas RNA secara tidak langsung mengungkapkan mutasi dalam sinyal regulasi atau splicing
dalam DNA.
Perawatan harus dilakukan dengan persiapan RNA untuk mempertahankan lingkungan
bebas RNase. Setelah isolasi dan kuantisasi RNA, sampel (hingga sekitar 30 g RNA total atau
0,5–3,0g RNA poliA, tergantung pada kelimpahan relatif dari transkrip yang diteliti) dapat
menjadi diaplikasikan langsung pada gel agarosa. Konsentrasi agarosa atau 0,8% -1,5% biasanya
digunakan. Gel poliakrilamida juga dapat digunakan, terutama untuk transkrip yang lebih kecil;
untuk misalnya, untuk analisis ekspresi gen virus.
Elektroforesis gel RNA harus dilakukan selama denaturasi kondisi untuk penilaian
ukuran transkrip yang akurat (lihat Bab 5). Denaturasi lengkap juga diperlukan untuk transfer
RNA yang efisien dari gel ke membran, seperti halnya transfer DNA di Southern blot. Karena
denaturasi dilakukan selama elektroforesis, langkah denaturasi terpisah tidak diperlukan untuk
bercak Utara. Setelah elektroforesis, perwakilan jalur dapat dipotong dari gel, direndam dalam
amoniumasetat untuk menghilangkan denaturan, dan diwarnai dengan acridine oranye atau
etidium bromida untuk menilai kualitas dan pemuatan sampel yang setara. Denaturant, seperti
formaldehida, harus dihilangkan dari gel sebelum transfer karena menghambat pengikatan RNA
menjadi nitroselulosa. Ini dilakukan dengan membilas gel dalam air deionisasi. RNA ditransfer
dalam 10X atau 20X SSC atau 10X SSPE (1,8 M NaCl, 0,1 M natrium fosfat, pH 7,7, 10 mM
EDTA) menjadi nitroselulosa sebagai dijelaskan di atas untuk DNA. 20X SSC harus digunakan
untuk transkrip kecil (500 basa atau kurang). Prosedur blotting untuk RNA di Northern blot
dilakukan di 20X SSC, mirip dengan prosedur untuk transfer DNA di noda selatan.
Prahibridisasi dan hibridisasi dalam formamida / Buffer prahibridisasi / hibridisasi SSC / SDS
dilakukan juga seperti dengan Southern blot. RNA ditransfer dalam 10X atau 20X SSC atau 10X
SSPE (1,8 M NaCl, 0,1 M natrium fosfat, pH 7,7, 10 mM EDTA) menjadi nitroselulosa seperti
dijelaskan di atas untuk DNA. 20X SSC harus digunakan untuk transkrip kecil (500 basa atau
kurang). Prosedur blotting untuk RNA di Northern blot dilakukan di 20X SSC, mirip dengan
prosedur untuk transfer DNA di noda selatan. Prahibridisasi dan hibridisasi dalam formamida /
Buffer prahibridisasi / hibridisasi SSC / SDS dilakukan juga seperti dengan Southern blot. Jika
RNA memiliki telah didenaturasi dalam glioksal, membran harus direndam dalam buffer Tris
hangat (65 C) untuk menghilangkan denaturant segera sebelum prahibridisasi.

Western Bloth

Modifikasi lain dari Southern blot adalah Western blot. Target tidak bergerak untuk Western blot
adalah protein. Ada banyak variasi pada Western blot. Umumnya serum, lisat sel, atau ekstrak
dipisahkan pada Gel SDS-poliakrilamida (SDS-PAGE) atau isoelektrik gel fokus (IEF). Yang
pertama memecahkan protein menurut dengan berat molekul, dan yang terakhir menurut
mengenakan biaya. Dithiothreitol atau 2-mercaptoethanol juga dapat digunakan untuk
memisahkan protein menjadi subunit. Poliakrilamida konsentrasi bervariasi 5%-20%.
Tergantung kerumitannya protein dan jumlah target protein, 1–50 g atau protein dimuat per
sumur. Sebelum pemuatan, sampel diperlakukan dengan denaturan, seperti: sebagai
pencampuran 1:1 dengan 0,04 M Tris HCl, pH 6,8, 0,1% SD. Akurasi dan sensitivitas
pemisahan dapat ditingkatkan dengan menggunakan kombinasi gel IEF diikuti oleh SDS-PAGE
atau dengan menggunakan dua dimensi elektroforesis gel. Standar berat molekul yang ditentukan
dijalankan dengan sampel untuk mengarahkan membran setelah transfer dan untuk
memperkirakan ukuran protein setelah menyelidik. Standar mulai dari 11.700 d (sitokrom C)
hingga 205.000 d (myosin) secara komersial tersedia.
Sistem gel yang digunakan dapat mempengaruhi pemeriksaan selanjutnya dari protein
dengan antibodi. Secara khusus, gel denaturasi dapat mempengaruhi epitop (situs antigenik pada
protein) seperti: bahwa mereka tidak akan mengikat dengan antibodi berlabel. Gel pretreatment
dengan buffer ringan seperti 20% gliserol dalam 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, dapat mengubah
protein sebelumnya transfer.
Setelah elektroforesis, protein dapat dioleskan ke membran melalui transfer kapiler atau
elektroforesis. Nitroselulosa memiliki afinitas tinggi terhadap protein dan mudah diperlakukan
dengan deterjen (0,1% Tween 20 dalam 0,05 M Tris dan 0,15 M natrium klorida, pH 7,6) untuk
mencegah pengikata antibodi primer terhadap membran itu sendiri (pemblokiran) sebelum
hibridisasi. Pengikatan protein dengan nitroselulosa mungkin hidrofobik seperti deterjen
nonionik dapat mengeluarkan protein dari membran. membran lainnya jenis yang dapat
digunakan untuk protein blotting adalah PVDF dan anion (DEAE) atau kation (CM) menukar
selulosa.