Sistem Deteksi

Langkah selanjutnya dalam ini prosedur adalah untuk mendeteksi apakah probe
telah terikat molekul target dan, jika telah terikat, lokasi relatif dari pengikatan.
Probe berlabel 32P asli menawarkan keunggulan deteksi sederhana dan sensitif.

Gambar 6-15 Probe DNA atau RNA berlabel

radioaktif
atom fosfor (32P atau 33P) dihibridisasi ke
target (homolog)
sekuens pada membran nitroselulosa. Fragmen
yang probe terikat dapat dideteksi oleh
mengekspos film autoradiografi ke membran.

Setelah hibridisasi, probe yang tidak terikat

dicuci, dan blot terkena film peka cahaya untuk mendeteksi fragmen yang dihibridisasi dengan
probe radioaktif (Gbr. 6-15). Kondisi pencucian harus diformulasikan sedemikian rupa sehingga:
hanya probe yang sepenuhnya hibridisasi yang tersisa di noda. Biasanya kondisi pencucian lebih
ketat dari itu digunakan untuk hibridisasi. Sistem deteksi nonradioaktif membutuhkan lebih
banyak melibatkan prosedur deteksi. Untuk sebagian besar nonradioaktif sistem, probe diberi
label dengan nukleotida secara kovalen melekat pada digoxygenin atau biotin. yang berlabel
nukleotida dimasukkan ke dalam rantai nukleotida dari penyelidikan dengan transkripsi in vitro,
terjemahan nick, ekstensi primer, atau penambahan oleh terminal transferase. Digoksigeninor
Probe berlabel biotin diinkubasi bersama dengan blot dengan sampel yang berisi urutan target
yang diinginkan memungkinkan terjadinya hibridisasi. Setelah hibridisasi, probe yang tidak
terikat terhanyut.
Kemudian, antibodi antidigoxygenin atau streptavidin, masing-masing, terkonjugasi menjadi
basa fosfatase (konjugat AP, Gambar 6-16) ditambahkan ke campuran reaksi untuk mengikat
digoxigenin- atau berlabel biotin penyelidikan: kompleks target. Konjugat Horseradish
peroxidase (HRP) dapat digunakan dalam prosedur ini. Setelah mengikat konjugat, membran
bermandikan
larutan substrat yang bila dioksidasi oleh HRP atau didefosforilasi oleh AP, menghasilkan sinyal.
Substrat sering digunakan adalah turunan pewarna dioxetane atau tetrazolium, yang
menghasilkan chemiluminescent (Gbr. 6-17) atau sinyal kromogenik (Gbr. 6-18), masing-masing
(Tabel 6.2).
Seperti halnya deteksi radioaktif, sinyal chemiluminescent yang dihasilkan oleh aksi enzim pada
dioxetane berkembang dalam gelap dengan autoradiografi. Cahaya dilepaskan oleh fosforilasi
dioxetane terjadi di lokasi pada membran di mana probe terikat dan menggelapkan film peka
cahaya. Chemiluminescent deteksi seringkali lebih kuat dan berkembang lebih cepat daripada
deteksi radioaktif. Kerugian dari chemiluminescent deteksi adalah lebih sulit untuk dikendalikan
dan terkadang menghasilkan latar belakang yang tinggi.
Untuk deteksi kromogenik, sinyal berwarna dihasilkan ketika enzim berinteraksi dengan turunan
pewarna tetrazolium dan dideteksi langsung pada filter membran. Keuntungan dari jenis deteksi
ini adalah bahwa warna dapat diamati saat berkembang dan reaksi berhenti pada saat ada sinyal-
ke-background yang optimal. perbandingan. Secara umum, deteksi kromogenik tidak sesensitif
deteksi chemiluminescent dan juga dapat menghasilkan latar belakang yang lebih tinggi,
terutama dengan probe yang diberi label dengan priming acak.
Kunci keberhasilan metode blotting adalah rasio signal-to-noise yang tinggi. Idealnya,
probe dan deteksi sistem harus menghasilkan sinyal yang spesifik dan kuat. Sinyal spesifik
tinggi, bagaimanapun, dapat disertai dengan latar belakang tinggi (noise). Oleh karena itu,
sensitivitas deteksi terkadang dikorbankan untuk menghasilkan sinyal yang lebih spesifik.

Interpretasi Hasil
Ketika probe tertentu mengikat targetnya dalam keadaan tidak bergerak pada membran,
pengikatan terdeteksi seperti yang dijelaskan di bagian sebelumnya, dengan hasil akhirnya
adalah visualisasi dari "pita" pada membran atau film. Sebuah band adalah hanya dilihat sebagai
garis yang melintasi lebar jalur. Analisis pita, yaitu, ada atau tidak adanya atau lokasi di jalur,
yang dihasilkan oleh Southern blot bisa langsung atau kompleks, tergantung pada sampel dan
desain prosedur. Gambar 6-19 merupakan penggambaran Hasil Southernblot. Pita yang
ditunjukkan dapat divisualisasikan pada membran atau pada film autoradiografi. Jika suatu lokus
gen memiliki pola restriksi yang diketahui, misalnya pada jalur 1, maka sampel dapat diuji untuk
membandingkan pola restriksinya. Pada gambar, sampel di jalur 3 memiliki pola yang identik,
yaitu, kedua jalur memiliki jumlah pita yang sama, dan pita-pita tersebut semuanya berada di
lokasi yang sama pada gel dan cenderung sangat mirip jika tidak identik secara berurutan.
sampel di jalur 1.
Southern blot tidak dapat mendeteksi penghapusan kecil atau penyisipan nukleotida atau
perbedaan nukleotida tunggal kecuali mereka mempengaruhi spesifik situs pembatasan. Untuk
beberapa pengujian, hibridisasi silang dapat membingungkan hasil. Artefak ini dapat
diidentifikasi dengan kehadiran mereka di setiap jalur dengan ukuran konstan.
Bercak utara (atau Barat) biasanya digunakan untuk analisis ekspresi gen, meskipun dapat juga
digunakan untuk menganalisis ukuran transkrip, pemrosesan transkrip, dan modifikasi protein.
Untuk analisis ini, terutama saat memperkirakan ekspresi, penting untuk menyertakan kontrol
internal untuk mengoreksi kesalahan dalam isolasi, pemuatan gel, atau transfer sampel. Jumlah
ekspresi kemudian ditentukan relatif terhadap pengendalian internal (Gbr. 6-20). Dalam contoh
yang ditunjukkan, transkrip target atau produk protein dinyatakan dalam jumlah yang meningkat,
dari kiri ke kanan. kontrol standar internal (pita bawah) memastikan bahwa sampel memiliki
ekspresi transkrip target produk protein yang rendah dan bahwa sinyal yang rendah bukan karena
kesulitan teknis.