PROSEDUR PEMERIKSAAN rRT-PCR COVID-19

-Ektraksi RNA-

BADAN KEBIJAKAN DAN PEMBANGUNAN KESEHATAN

KEMENTERIAN KESEHATAN RI
 Tujuan dan Manfaat Ekstraksi

Prinsip Dasar Ekstraksi Asam Nukleat

SISTEMATIKA
Proses Ekstraksi RNA SARS Cov-2

Permasalahan dan Solusi (Troubleshooting)

2
TUJUAN

• Membebaskan Asam Nukelat dari sel atau dari bagian-bagian virion

• Memperoleh Asam Nukleat yang memiliki kualitas dan kuantitas yang baik
• Mengetahui kegunaan-kegunaan Asam Nukleat dan cara penyimpanan
Asam Nukleat yang baik

3
MANFAAT DAN APLIKASI

Merupakan tahapan awal dari berbagai Teknik Molekuler :

• Deteksi penyakit (Diagnostik)
• Forensik (Ante-post mortem, DNA fingerprinting)
• Rekayasa genetika (GMO, menciptakan bibit unggul)
• Mengidentifikasi Filogenetik dan keanekaragaman hayati
• Pengobatan (terapi gen, CRISPR, personalized medicine)
• Produksi Vaksin
• Senjata Biologi

4
PRINSIP DASAR EKSTRAKSI

• Lisis : Memecahkan (lisis) sel, virion, jaringan, dll.

• Fungsinya agar Asam Nukleat bisa dilepaskan/dibebaskan.
• Teknik-Teknik Lisis :
1. Teknik Kimia (Tris, MgCl2, EDTA, NaCl, SDS, CTAB, Triton X100)
2. Teknik Biologi (enzyme Lipase, proteinase atau proteinase K,)
3. Teknik Fisika (ultrasonic/sonikasi, liquid nitrogen-digerus)

5
PRINSIP DASAR EKSTRAKSI

• Presipitasi-Pencucian
• Memisahkan Asam Nukelat yang diinginkan
• Fungsinya :
1. Memisahkan Asam Nukleat yang diinginkan dari senyawa organic dan an
organic yang tidak diinginkan
2. Memurnikan Asam Nukleat dengan pencucian berulang.
3. Cth. Isopropanol, Ethanol, Methanol, Sodium Acetate, dll (Presipitasi);
Wash buffer, AW buffer dll (Pencucian)

6
PRINSIP DASAR EKSTRAKSI

• Elusi

• Fungsinya :

1. Mengkoleksi Asam Nukleat

2. Cth. Eluent Buffer, Nuclease

free water (NFW), AE buffer,

AVE buffer, TE Buffer dll

7
METODA EKSTRAKSI

Berdasarkan Bahan Ekstraksi :

1. Solution Based (metode konventional)
• Guanidin Tiosianat-fenol
• CTAB
• Alkaline
• EtBr-Cs CL

Kelebihan dan Kekurangan :

Biaya relatif lebih ekonomis; Pengerjaan manual; Prosesnya membutuhkan waktu yang lama;
Tekniknya komplek; Kemurniannya kurang optimal

Sumber : https://www.orcabiotek.com/post/konsep-ekstraksi-rna 8
 METODA EKSTRAKSI

Berdasarkan Bahan Ekstraksi :

2. Solid-phase based
• Silica kolom
• Partikel kaca
• Diatomaceous earth
• Magnetic Beads
• Anion exchange
Kelebihan dan Kekurangan :
Biaya relatif lebih mahal; Pengerjaan manual dan automatis; Prosesnya membutuhkan waktu realtif
cepat; Tekniknya sederhana; Kemurniannya umumnya lebih optimal

https://www.pngdownload.id/png-syzybb/ 9
METODA EKSTRAKSI
Manual
• Membutuhkan SDM yang terlatih
• Waktu umumnya lebih lama jika dibandingkan dengan
metode automatis
• Lebih efisien jika jumlah samplenya sedikit
• Khusus jika mengerjakan SARS Cov-2 maka harus
dilakukan dalam fasilitas BSL-2 dan membutuhkan
banyak peralatan lainnya spt Centrifuge, heat block,
incubator, dll
Automatis
• Waktu umumnya lebih cepat
• Mengurangi kesalahan akibat manusia (human erorr)
• Proses pengerjaan sample lebih aman bagi petugas
• Reproducible
• Harganya relative lebih mahal

Catridge Based Non-catridge

10
 METODA EKSTRAKSI

11
Ali, etal, 2017
PROSES EKSTRAKSI SARS-COV-2
Tahap Pertama : Persiapan

1. Siapkan Petugas yang sudah terlatih

2. Gunakan APD yang telah disesuaikan dengan analisis resiko (Risk Assessment)
3. Siapkan alat dan bahan serta kit yang akan digunakan (pastikan tidak menggunakan kit
yang salah dan telah kadaluarsa) serta pahami SOPnya
4. Bersihkan semua permukaan (bench), BSC, dan semua peralatan yang akan digunakan.
5. Cek semua alat dalam kondisi yang prima (terkalibrasi, tidak ada bunyi alarm, atau
muncul kode error, dll)
6. Pastikan spil kit dan kotak P3K dalam kondisi yang mudah dijangkau dan tersedia

12
PROSES EKSTRAKSI SARS-COV-2
Tahap Kedua : Proses Pengerjaan

1. Ikuti petunjuk SOP yang telah disesuaikan dengan kit yang digunakan (JANGAN
melakukan modifikasi)
2. Pisahkan area bersih, area bekerja, dan area kotor serta bekerja dengan Good
Laboratory Practice / GLP. (cth. Consumable yang bersih diletakkan di area bersih
sedangkan Tempat sampah diletakkan di area kotor)
3. Bekerja dengan rencana kerja yang baik dan efisien (JANGAN terlalu lama bekerja di
ruangan infeksius)
4. Bersihkan area kerja setelah digunakan dengan dekontaminasi yang disesuaikan
dengan analisis resikonya dan jangan lupa bersihkan limbahnya

13
PROSES EKSTRAKSI SARS-COV-2
Tahap Ketiga : Proses Penyimpanan

1. Laporkan hasil pengerjaan pada petugas atau dokter yang bertanggung jawab dan lakukan
pencatatan pada log book (log book manual atau data digital)
2. Simpan RNA hasil ektraksi pada suhu yang sesuai dan tempat yang aman.

https://www.dell.com/en-us/work/
shop/dell-laptops-and-notebooks/
https://www.bukalapak.com/p/olahraga/renang/renang-lainnya/
latitude-3320-laptop/spd/latitude-
ixon1v-jual-harga-hemat-scuba-diving-logbook-log-book
13-3320-laptop

14
PENYIMPANAN RNA

1. Jangka panjang: dried or lyophilized (+Stabilizing

agent)
• Trehalose
• Commercially available stabilizers
• DNAstable (Biomatrica)
• QIAsafe DNA (Qiagen)
• GenTegra DNA (integenX)
2. Jangka pendek/dilution needed: in solution
• Nuclease free water https://remi.com.my/Product/Details/69/-10c-to-25c-low-
temperature-medical-freezer-dw-yw508a

• TE-Buffer 15
SUHU OPTIMAL PENYIMPANAN RNA

• Hasil esktraksi RNA tidak disimpan di suhu ruang untuk

menghindari kerusakan RNA.
• suhu 4℃  jika langsung digunakan untuk PCR
• suhu -20℃  jika akan digunakan dalam waktu 24 - 48 jam
• suhu -80℃  jika akan disimpan dalam jangka waktu 1-6
bulan
• suhu liquid nitrogen  jika akan disimpan lebih dari 6
bulan

https://biovalmed.com/dw-86l388j/

16
UJI KUALITAS DAN KUANTITAS HASIL EKSTRAKSI

1. Uji kuantitas konsentrasi DNA/RNA  spektrofotometer

dengan beberapa panjang gelombang :
• Asam nukelat (DNA, RNA, nukleotida): 260 nm

• Protein: 280 nm

• Kontaminan lain: 230 nm

2. Uji kualitas  kemurnian asam nukleat.

• DNA: A260/A280≥1,8

• RNA: A260/A280≥2
https://id.pinterest.com/pin/521362094332702238/,
Fatchiyah et al. 2011; Sambrook et al. 2001

• DNA/RNA: A260/A230≥2
17
HAL-HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN

1. Lakukan analisis resiko dari setiap pekerjaan yang akan dilakukan. Sesuaikan
hazard level, jenis kegiatan yang akan dilakukan dan Teknik pengerjaannya.
2. Ikuti setiap SOP yang sudah dibuat. Lakukan revisi secara berkala jika
diperlukan.
3. Gunakan APD yang sesuai dengan hazard yang akan dikerjakan
4. Menerapkan GLP dengan baik
5. Lakukan pencatatan setiap kegiatan yang dilakukan

18
HAL-HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN

19
TERIMA KASIH