Mata Kuliah : Biologi Sel dan Molekuler II (P)

Jenis Tugas : Individu

Dosen Pengampu : Mursalim, S.Pd.,M.Kes
Alfin Resya Virgiawan, S.ST.,M.Si

Kit Wantai SARS-CoV-2-RT-PCR

Oleh :

DIRA MAHARANI
NIM. PO714203191.013

KELAS 2A

PROGRAM SARJANA TERAPAN

JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
POLITEKKES KEMENKES MAKASSAR
2020
Kit Wantai RT-PCR SARS-CoV-2

Kit pendeteksi asam nukleat pada Virus Corona 2 (SARS-CoV-2) (Pemeriksaan fluorensensi
PCR)

Tujuan Penggunaan

Alat ini bertujuan untuk mendeteksi RNA Virus Corona 2 (SARS-CoV-2 ) penyebab sindrom
pernafasan akut secara kualitatif melalui ekstraksi swab orofaring, swab nasofaring, sputum,
spesimen cairan pernafasan endotrakhea dan bronchoalveolus dari pasien terduga terinfeksi
COVID-19. Gen target yang terdeteksi oleh pengujian tersebut adalah gen N dan ORF1ab dari
SARS-CoV-2. Amplifikasi untuk pengujian ini semi-otomatis menggunakan BIO-RAD CFX96
(Bio-Rad CFX Manager 3.1) atau ABI 7500 (7500 software v2.3) sedangkan ekstraksi dapat
dilakukan secara otomatis, semi-otomatis atau manual menggunakan instrumen ekstraksi yang
sesuai. Hasil untuk identifikasi SARS-CoV-2 RNA, yang umumnya terdeteksi pada spesimen
pernafasan selama fase akut infeksi. Hasil positif menunjukkan adanya SARS-CoV-2; korelasi
klinis dengan riwayat pasien dan informasi diagnostik lainnya diperlukan untuk menentukan
status infeksi pasien. Hasil positif tidak menutup kemungkinan infeksi bakteri atau infeksi
dengan virus lain. Agen yang terdeteksi mungkin bukan penyebab pasti penyakit. Kit ini hanya
untuk penggunaan diagnosis in vitro (IVD) untuk membantu diagnosis COVID-19 dan
dimaksudkan untuk digunakan oleh profesional laboratorium yang berkualifikasi di laboratorium
biosafety level 2 atau lebih tinggi.

Infeksi SARS-CoV-2 dapat menyebabkan penyakit saluran pernapasan COVID-19. Gejalanya

meliputi demam, lemas dan batuk kering, serta masalah pernapasan yang muncul secara
bertahap. Pada kasus yang parah, sindrom gangguan pernapasan akut (ARDS), syok septik,
asidosis metabolik yang sulit dikoreksi, gangguan koagulasi hingga kematian dapat terjadi.

Kit ini adalah PCR fluoresen real-time kualitatif di mana primer spesifik dan probe fluoresen
dirancang untuk mendeteksi daerah yang sangat konservatif dari gen ORF1ab dan gen N dari
virus. Kit ini memiliki kontrol kualitas terintegrasi (IC, human housekeeping gene) yang
dimaksudkan untuk memantau uji coba.

Prinsip Penggunaan Kit

 Hanya untuk penggunaan diagnostik in vitro (IVD).

 Hanya untuk Penggunaan Resep.
 Kit Wantai SARS-CoV-2 RT-PCR telah diotorisasi hanya untuk mendeteksi asam
nukleat dari SARS-CoV-2, bukan untuk virus atau patogen lain.
 Simpan produk sesuai dengan kondisi penyimpanan yang dijelaskan.
 Kit ini harus digunakan oleh seorang yang telah professional dalam laboratorium dan
berkualifikasi.
 Spesimen dan bahan sekali pakai yang tersisa setelah pengujian berpotensi
menularkan. Sebelum dibuang, buang ujung pipet bekas ke dalam wadah limbah
biologis yang berisi disinfektan. Setelah pengujian, untuk menghindari kontaminasi
laboratorium, gunakan etanol 75% untuk membersihkan meja kerja. Disinfeksi dengan
lampu ultraviolet. Penanganannya harus mengikuti pedoman yang ditetapkan untuk
biosafety laboratorium biomedis dan mikrobiologi, pengelolaan limbah medis, dan
pedoman normatif terkait lainnya.
 Setelah ekstraksi asam nukleat, segera melepas tabung beralur 8 selongsong dari
instrumen.
 Pelat ekstraksi harus disegel setelah digunakan untuk menghindari kontaminasi aerosol.
 Manajemen laboratorium harus mengikuti secara ketat standar manajemen laboratorium
biologi molekuler nasional dan standar manajemen laboratorium amplifikasi gen klinis.
 Alur kerja Kit Wantai SARS-CoV-2 RT-PCR harus dilakukan di area yang berbeda (area
persiapan kit, area persiapan spesimen, area amplifikasi dan analisis.) Setiap tahap
pengujian menggunakan instrumen dan peralatan khusus. Dilarang menggunakan
peralatan secara bergantian dari fase dan area yang berbeda. Staf dan sirkulasi udara
harus diatur dengan ketat. Hindari kontaminasi silang. Bahan uji sekali pakai harus
didesinfeksi dan diperiksa secara menyeluruh untuk menghindari kontaminasi atau hasil
negatif palsu yang disebabkan oleh penghambat reaksi amplifikasi
 Ikuti prosedur produsen untuk ekstraksi asam nukleat untuk kit ekstraksi yang divalidasi.
Jika tidak, mungkin ada perbedaan antara efisiensi ekstraksi mereka. Ikuti tindakan
pencegahan standar. Semua spesimen pasien dan kontrol positif harus dianggap
berpotensi menularkan dan ditangani dengan tepat. Jangan makan, minum, merokok,
menggunakan kosmetik atau memegang lensa kontak di area di mana reagen dan
spesimen manusia ditangani. Gunakan alat pelindung diri (APD) sesuai dengan
pedoman saat ini untuk penanganan spesimen yang berpotensi menular.
 Ikuti prosedur yang tertera untuk ekstraksi asam nukleat terhadap kit ekstraksi yang
telah divalidasi. Jika tidak, mungkin akan terjadi perbedaan pada efisiensi proses
ekstraksi.
  Ikuti tindakan pencegahan standar. Semua spesimen pasien dan kontrol positif harus
dianggap berpotensi menularkan dan ditangani dengan tepat.
 Jangan makan, minum, merokok, menggunakan kosmetik atau memegang lensa kontak
di area di mana reagen dan spesimen manusia ditangani.
 Gunakan alat pelindung diri (APD) sesuai dengan pedoman saat ini untuk penanganan
spesimen yang berpotensi menular.
 Jika sputum dan cairan lavage bronchoalveolar tidak jernih, coba lakukan hal berikut
terhadap spesimen:
o Setelah sentrifugasi (12000rpm / menit selama 5 menit), ekstrak bagian yang
diklarifikasi;
o Setelah sentrifugasi (12000rpm / menit selama 5 menit), dengan pengenceran
yang tepat tidak lebih dari 2x, ekstrak bagian yang telah diklarifikasi;
o Pengambilan sampel ulang

Komponen

Amplifikasi dan Campuran PT-PCR 1.25mL×1 Enzim dNTPs, rTth enzyme, UDG
Kontrol Mn(OAc)2 125μL×1 Larutan Mn(OAc)2
Primer dan probe 125μL×1 Larutan primer dan probe
Kontrol Positif 1 mL×1 Virus buatan yang mengandung
urutan target amplifikasi SARS-
CoV-2
Kontrol Negatif 1 mL×1 Normal bSaline

Bahan yang Diperlukan Tetapi Tidak Tersedia

Wadah Kit ini tidak berisi bahan untuk pengumpulan, penyimpanan, dan
Penyimpanan pengangkutan spesimen orofaringeal dan nasofaring manusia. Kit
Spesimen VTM komersial yang divalidasi: "Wantai SARS-CoV-2 VTM" (katalog
No. ZCT1261) diproduksi oleh Beijing Wantai Biological Pharmacy
Enterprise Co. Ltd dan VTM & UTM (katalog No. MT0301) diproduksi
oleh Yocon biotechnology Co., Ltd.
Kit Ekstraksi Asam Kit ini tidak mengandung reagen ekstraksi RNA. Kit ekstraksi
Nukleat komersial yang tervalidasi: Kit Ekstraksi Asam Nukleat Wantai (No.
katalog ZCT1246), GenMagBio (No. katalog NA007-1) dan QIAGEN
 (No. katalog 57704). Volume spesimen awal yang divalidasi dari
200μL dan volume elusi 50μL
Tabung PCR dan Saat menggunakan amplifier BIO-RAD CFX96, perlu untuk
Tutup datar menyertakan Tabung PCR Profil Rendah (No. KatalogTLS0851) dan
Strip Optik 8-Tutup Datar untuk strip / pelat tabung 0,2ml (No.
KatalogTCS0803) dari BIO-RAD . Saat menggunakan amplificator
ABI7500, Anda perlu menyertakan PCR STRIP TUBES (PCR-0208-C)
dan PCR STRIP CAPS (PCR-2CP-RT-C) dari Axygen atau PCR
bahan habis pakai aksesori ABI.
Lainnya Kap PCR, sentrifuse Benchtop, Vortex mixer, Pipet tunggal dan
multisaluran yang dapat disesuaikan (1,00 µL hingga 1.000,0 µL),
Ujung pipet penghalang aerosol, Sarung tangan sekali pakai tanpa
bubuk, peralatan termostatik (penangas air) dan ABI 7500 Kalibrator
pewarna murni plus FPPM (nomor kucing 4409561).

Penyimpanan dan Batas Penyimpanan

 Simpan kit di bawah suhu -15 ° C. Hindari pemam\paran ke sinar matahari langsung.
Jangan menekan kemasannya.
 Dapat disimpan selama 12 bulan.
 Setelah dibuka, kit dapat disimpan pada suhu -15 ° C selama 6 minggu, freeze-thaw
tidak lebih dari 4 kali.
 Kit dapat dipindahkan pada suhu -15 ° C dikemas ke dalam kotak busa dengan kantong
es atau es kering.
 Lihat label untuk tanggal produksi dan tanggal kedaluwarsa.

Instrumen RT-PCR

Amplificator PCR dan versi perangkat lunak

QPCR fluoresen Versi Perangkat Lunak

BIO-RAD CFX96 Bio-Rad CFX Manager 3.1
ABI 7500 7500 software v2.3
 Ekstraktor Asam Nukleat

Model Ekstraktor Asam Produsen

Nukleat
Kingfisher Flex 96 Thermo
SLA-32 Taiwan Advanced Nanotech
Inc. (TANBead)

Persyaratan Spesimen

Spesimen saluran pernapasan bagian atas: Swab orofaring dan nasofaring. Alat swab yang
digunakan harus jenis alat swab khusus untuk mikroba (jangan gunakan alat swab biasa).
Kepala swab harus dari serat buatan medis, bahan pemegannya harus dari plastik.

Pengambilan Spesimen

Swab nasofaring: Gunakan swab mikroba untuk mengumpulkan spesimen di daerah

hidung. Putar perlahan dan dorong swab, masukkan kepala swab mikroba jauh ke dalam
nasofaring di akar rongga hidung, putar beberapa kali untuk mendapatkan spesimen.

Swab orofaring: Gunakan usap mikroba untuk menyeka dinding faring posterior dan tonsil
di kedua sisi dengan kekuatan sedang. Hindari menyentuh lidah.

Pemrosesan spesimen: Setelah mengumpulkan spesimen, masukkan swab mikroba ke

dalam tabung VTM yang disterilkan. Putar beberapa kali ke dinding bagian dalam tabung
untuk melarutkan spesimen dalam larutan sebanyak mungkin.

Spesimen saluran pernapasan bagian bawah: Sputum, aspirasi endotrakeal, cairan

lavage bronchoalveolar. Tambahkan 4% NaOH dalam perbandingan 2:1 ke sputum yang
dikumpulkan atau spesimen pernafasan bagian trakea. Pusaran agar tercampur rata
kemudian tempatkan pada suhu kamar selama 20 menit hingga mencair. Waktu pencairan
dapat ditingkatkan jika terlalu banyak zat kental. Pindahkan 1 mL spesimen yang telah
dicairkan ke dalam tabung sentrifus 1,5 mL dan kemudian vortex kembali. Jika cairan
lavage bronchoalveolar jernih, dapat langsung digunakan untuk ekstraksi asam nukleat.

Penyimpanan dan pemindahan spesimen: Spesimen yang diuji dalam 12 jam setelah
pengumpulan dapat disimpan pada suhu 2-8°C. Untuk penyimpanan jangka panjang,
pertahankan di bawah -70°C. Hindari beberapa siklus freeze-thaw (tidak lebih dari 3 kali).
 Spesimen harus dipindahkan dalam suhu di bawah -15 ° C. Sebelum pengujian,
seimbangkan spesimen pada suhu kamar. Spesimen yang dibekukan harus dicampur
dengan baik sebelum pengujian.

Metode Pemeriksaan

Ekstraksi Asam Nukleat

 Ekstrak asam nukleat sesuai dengan IFU reagen ekstraksi yang sesuai.
 Kontrol positif dan kontrol negatif dalam kit WANTAI SARS-COV-2 RT-PCR
harus diekstraksi secara bersamaan dengan sampel.
Persiapan Reagen

Area Persiapan

LANGKAH. 1 - SIAPKAN REAGEN: Buka kit dan keluarkan komponen dari kotak. Cairkan
pada suhu kamar, kocok agar tercampur selama 1 menit kemudian segera di sentrifus.

Tempatkan campuran RT-PCR, Mn(OAc)2 dan primer & probe pada suhu 2-8 ℃ di dinginkan

untuk dbiigunakan nanti.

LANGKAH. 2 - SIAPKAN CAMPURAN REAKSI PCR: Satu pengujian membutuhkan 30µL

campuran reaksi PCR. Bergantung pada berapa banyak spesimen yang akan diuji, campurkan
volume reagen yang diperlukan sesuai tabel di bawah ini. Sentrifugasi dengan cepat setelah
tercampur rata. Disarankan untuk menyiapkan satu reagen uji tambahan setiap kali untuk
mencegah hilangnya campuran reaksi akibat pemisahan.

Komponen Volume Volume Volume Volume Volume

untuk 1 untuk 16 untuk 32 untuk 48 untuk n
reaksi (µL) reaksi (µL) reaksi (µL) reaksi (µL) reaksi (µL)
Campuran 25 425 825 12225 25×（n+1）
PT-PCR
Primer Probe 2.5 42.5 82.5 122.5 2.5×（n+1）

Mn(OAc)2 2.5 42.5 82.5 122.5 2.5×（n+1）

Total 30 520 990 1470 30×（n+1）

LANGKAH. 3 - TRANSFER KE TABUNG REAKSI PCR: Pipet 30µL campuran reaksi PCR ke
dalam tabung reaksi PCR (pilih tabung reaksi PCR yang cocok dengan instrumen ekstraktor).

LANGKAH. 4 - TAMBAHKAN TEMPLATE RNA: Tambahkan 10μL template RNA ke

amplifikasi PCR tabung. Tambahkan 10μL template atau kontrol RNA ke tabung amplifikasi
PCR. Tutup tabung dan sentrifugasi seketika. Transfer ke area amplifikasi dan analisis untuk
amplifikasi PCR. Kit ini tidak mengandung reagen ekstraksi RNA. Kit dan peralatan ekstraksi
yang disarankan: Beijing Wantai, GenMagBio atau QIAGEN dan kit reagen ekstraktor RNA
yang dikomersialkan dengan kualitas yang dapat diandalkan.)

Amplifikasi

Area Amplifikasi dan Analisis

 Tempatkan tabung amplifikasi PCR ke dalam instrumen RT-PCR.

 Label untuk menunjukkan kontrol dan posisi spesimen.
 Pilih FAM untuk gen ORF1a, VIC / HEX untuk gen N, dan ROX untuk IC.
 Atur volume campuran reaksi PCR ke 40µL
 Atur siklus sesuai dengan tabel di bawah ini:
No Tahapan Suhu Watu Siklus
1 Aksi enzim UDG 370C 2 menit 1
2 Denaturasi RNA 900C 30 detik 1
3 Transkripsi terbalik RNA 610C 15 menit 1
0
4 Denaturasi 95 C 3 detik 45
0
Anil, pengumpulan sinyal 60 C 10 detik
fluoresens
Catatan: Saat menggunakan instrumen amplifikasi seri ABI 7500, waktu untuk
langkah 4 (anil, pengumpulan sinyal fluoresensi) harus disetel sebagai 30 detik. dan
pilih "Tidak Ada" dalam pengaturan koreksi pewarnaan ROX.

Analisis Hasil

 Pengaturan dasar: Optimisasi otomatis instrumen untuk BIO-RAD CFX96. Diatur secara
manual untuk ABI7500: Buka Analisis Plot → Pengaturan Plot PILIH Jenis Grafik, Linear
→ Pilihan PILIH Target, N, ATUR secara manual Threshold dan Baseline, Target Awal
 Baseline dan Target Akhir Baseline ke 3 ~ 8 Siklus dan 24 -30 Siklus → Target SELECT
ORF1ab dan IC, SET sama seperti di atas.
 Pengaturan ambang batas: Secara otomatis dengan instrumen, atau sesuaikan secara
manual sesuai dengan garis dasar yang baru saja melampaui titik tertinggi dari kurva
amplifikasi dari kontrol negatif. Atur garis ambang secara manual pada sekitar 1/10 dari
nilai fluoresensi titik akhir.
 Analisis masing-masing kurva SARS-CoV-2 dan pengendalian internal.

Uji Coba Kriteria

Saluran Target uji Kontrol negatif Kontrol positif

FAM ORF1ab Tanpa Ct atau Ct=45 Ct≤40
VIC N Tanpa Ct atau Ct=45 Ct≤40
ROX Kontrol internal Tanpa Ct atau Ct=45 Tanpa Persyaratan
Kriteria di atas harus dipenuhi, jika tidak, uji coba tidak valid.

Interpretasi Hasil

No FAM( ORF1ab) VIC(N) ROX(IC) Penentuan hasil dan tindakan

1 Ct≤40 Ct≤40 Tanpa Positif SARS-CoV 2
persyatatan
2 Tanpa Ct atau Ct=45 Tanpa Ct atau ≤35 Positif SARS-CoV 2
 Ct=45
3 Ct＞40 atau Tanpa Ct＜45 Tanpa Diperlukan ekstraksi ulang dan
persyatatan pengujian ulang. Selama
Ct
pengujian ulang, jika ada target
4 Ct＜45 Ct＞40 atau Tanpa yang memiliki Ct 35, maka nilai
persyatatan
Tanpa Ct hasilnya menurut No. 5.
5 Tanpa Ct atau Ct=45 Tanpa Ct atau >35 atau Tes tidak valid. Diperlukan
Ct=45 Tanpa Ct ekstraksi ulang dan pengujian
ulang. Jika hasil tes ulang
masih> 35 (atau Tidak Ada Ct),
maka dinilai sebagai
penghambatan Spesimen.

Batasan

 Kit ini hanya digunakan untuk deteksi kualitatif SARS-CoV-2 RNA.

 Jangan hanya mengandalkan hasil kit ini untuk diagnosis. Untuk diagnosis akhir, hasil kit
ini harus dipertimbangkan sehubungan dengan gejala pasien, tanda fisik, riwayat
kesehatan, pemeriksaan laboratorium lain, dan reaksi terhadap perawatan.
 Primer & probe telah dirancang untuk mendeteksi daerah yang sangat konservatif dari
gen ORFlab dan N pada virus. Namun, karena tingkat mutasi virus RNA yang tinggi,
kemungkinan mutasi yang rendah di wilayah konservatif masih ada, yang dapat
menyebabkan hasil negatif palsu dengan kit ini.
 Pengambilan sampel, transportasi, penyimpanan dan penanganan yang tidak tepat
dapat menyebabkan kesalahan dalam hasil.
 Laboratorium klinis harus secara ketat mengikuti peraturan dan pedoman uji diagnostik
molekuler klinis terkait. Ikuti dengan ketat manual saat melakukan tes.
 Kit ini terbatas pada deteksi swab orofaringeal, usap nasofaring, sputum, aspirasi
endotrakeal dan spesimen cairan lavage bronchoalveolar.
 Aspirasi nasofaring atau aspirasi nasal dapat diterima untuk pengujian tetapi kinerja
dengan pengujian kami belum divalidasi.
 Kit ini hanya berlaku untuk instrumen tertentu.
 Karena pengendalian internal digunakan untuk memantau proses lengkap pengambilan
sampel, ekstraksi asam nukleat, dan amplifikasi, tidak mungkin untuk menentukan letak
 kesalahan jika terdapat hasil pengendalian internal yang abnormal, sehingga perlu
dilakukan proses lengkap lagi. Jika hasil masih tidak normal setelah ini, hasil tes perlu
dilaporkan sebagai "Penghambatan spesimen".

Indikator Kinerja

 Validasi kinerja kit telah dilakukan dengan sistem Applied Biosystem® 7500 Real-Time
PCR dan instrumen Bio-Rad CFX 96. Untuk ekstraksi spesimen, Kit Ekstraksi Asam
Nukleat Wantai dengan volume spesimen awal 200μL dan volume elusi 50μL telah
digunakan.
 Kepekaan: Sensitivitas analitik ditentukan dengan spiking spesimen orofaring negatif
dengan template RNA. 4 tingkat kontrol disiapkan. Hasil pengujian menunjukkan bahwa
sensitivitas analitik kit adalah 50 eksemplar / ml SARS-CoV-2 RNA (CI ≥95%).
Sensitivitas analitik selanjutnya divalidasi dengan menguji ulang masing-masing dari 20
ulangan dari 50 tingkat kontrol salinan / ml pada 3 lot kit.

Penetapan sensitivitas analitik kit menggunakan reagen ekstraksi asam nukleat Wantai.
Level Salinan/ml Gen ORF1ab Gen N
Deteksi Mean Cq Cq SD Deteksi Mean Cq Cq SD
1 100 100% 37.06 0.63 100% 35.14 0.51
2 50 95% 38.39 0.94 100% 35.91 0.51
3 25 90% 38.48 0.88 70% 38.65 1.11
4 10 25% 40.42 0.79 30% 39.23 1

Hasil validasi sensitivitas analitik pada sistem Applied Biosystem® 7500 Real-Time
PCR, Lot-1,2,3 menggunakan reagen ekstraksi asam nukleat Wantai
Spesimen Lot 1
Gen ORF1ab Gen N
Deteksi Mean Cq Cq SD Deteksi Mean Cq Cq SD
1 100% 35.74 0.54 100% 34.44 0.32
2 100% 35.95 0.51 100% 34.17 0.37
3 100% 36.18 0.51 100% 34.23 0.37
4 100% 36.06 0.54 100% 34.76 0.312
5 100% 35.57 0.54 100% 34.29 0.37
 6 100% 36.20 0.52 100% 34.26 0.32
7 100% 35,80 0.55 100% 34.52 0.32
8 100% 36.04 0.54 100% 34.72 0.31
9 100% 36.05 0.51 100% 34.38 0.37
10 100% 36.12 0.54 100% 34.82 0.31

Spesimen Lot 2
Gen ORF1ab Gen N
Deteksi Mean Cq Cq Deteksi Mean Cq Cq
Replikasi Standard Replikasi Standar
Deviaton Deviation
1 100% 35.18 0.53 100% 34.52 0.32
2 100% 35.86 0.57 100% 34.28 0.36
3 100% 36.07 0.58 100% 34.33 0.36
4 100% 35.69 0.53 100% 34.80 0.36
5 100% 35.22 0.53 100% 34.37 0.38
6 100% 36.11 0.54 100% 34.34 0.36
7 100% 35.44 0.54 100% 34.58 0.36
8 100% 35.67 0.53 100% 34.77 0.36
9 100% 36.95 0.53 100% 34.48 0.36
10 100% 36.75 0.58 100% 34.86 0.36

Spesimen Lot 3
Gen ORF1ab Gen N
Deteksi Mean Cq Cq Deteksi Mean Cq Cq
Replikasi Standard Replikasi Standar
Deviaton Deviation
1 100% 35.65 0.45 100% 34.51 0.51
2 100% 35.12 0.38 100% 34.34 0.55
3 100% 36.36 0.38 100% 34.40 0.55
4 100% 35.97 0.45 100% 34.82 0.49
5 100% 35.48 0.45 100% 34.35 0.52
6 100% 36.34 0.40 100% 34.46 0.53
 7 100% 35.71 0.45 100% 34.59 0.51
8 100% 35.95 0.45 100% 34.79 0.49
9 100% 36.03 0.38 100% 34.56 0.53
10 100% 36.75 0.46 100% 34.89 0.49

Hasil validasi sensitivitas analitik pada sistem CFX 96 (Bio-Rad®) Real-Time PCR, Lot-
1,2,3 menggunakan reagen ekstraksi asam nukleat Wantai
Spesimen Lot 1
Gen ORF1ab Gen N
Deteksi Mean Cq Cq Deteksi Mean Cq Cq
Replikasi Standard Replikasi Standar
Deviaton Deviation
1 100% 35.80 0.39 100% 34.39 0.47
2 100% 35.85 0.39 100% 34.59 0.46
3 100% 36.36 0.38 100% 34.40 0.55
4 100% 35.97 0.45 100% 34.82 0.49
5 100% 35.48 0.45 100% 34.35 0.52
6 100% 36.34 0.40 100% 34.46 0.53
7 100% 35.71 0.45 100% 34.59 0.51
8 100% 35.95 0.45 100% 34.79 0.49
9 100% 36.03 0.38 100% 34.56 0.53
10 100% 36.75 0.46 100% 34.89 0.49

Spesimen Lot 2
Gen ORF1ab Gen N
Deteksi Mean Cq Cq Deteksi Mean Cq Cq
Replikasi Standard Replikasi Standar
Deviaton Deviation
1 100% 35.65 0.45 100% 34.51 0.51
2 100% 35.12 0.38 100% 34.34 0.55
3 100% 36.36 0.38 100% 34.40 0.55
4 100% 35.97 0.45 100% 34.82 0.49
 5 100% 35.48 0.45 100% 34.35 0.52
6 100% 36.34 0.40 100% 34.46 0.53
7 100% 35.71 0.45 100% 34.59 0.51
8 100% 35.95 0.45 100% 34.79 0.49
9 100% 36.03 0.38 100% 34.56 0.53
10 100% 36.75 0.46 100% 34.89 0.49

Spesimen Lot 3
Gen ORF1ab Gen N
Deteksi Mean Cq Cq Deteksi Mean Cq Cq
Replikasi Standard Replikasi Standar
Deviaton Deviation
1 100% 35.18 0.53 100% 34.52 0.32
2 100% 35.86 0.57 100% 34.28 0.36
3 100% 36.07 0.58 100% 34.33 0.36
4 100% 35.69 0.53 100% 34.80 0.36
5 100% 35.22 0.53 100% 34.37 0.38
6 100% 36.11 0.54 100% 34.34 0.36
7 100% 35.44 0.54 100% 34.58 0.36
8 100% 35.67 0.53 100% 34.77 0.36
9 100% 36.95 0.53 100% 34.48 0.36
10 100% 36.75 0.58 100% 34.86 0.36

 Analisis Spesifisitas : Tidak ada reaktivitas silang yang diamati setelah pengujian
spesimen dari individu yang terinfeksi virus influenza dan parainfluenza, H1N1, HN1
(2009), H3N2, H5N1, H7N9, EBV, CMV, Adenovirus 1,2,3,4,5,7, RSV A, RSV B, HCoV-
229E, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, MERS, Rotavirus, Norovirus,
Mycoplasma pneumoniae dan Chlamydia.
 Presisi: Ketepatan kit dievaluasi dengan pengujian spesimen orofaringeal negatif RNA-
spiked. 2 teknisi laboratorium menguji 3 lot kit dengan 10 ulangan dari 3 konsentrasi
berbeda (positif 1000 eksemplar / ml, positif rendah 150 eksemplar / ml dan negatif 0
eksemplar / ml) selama 5 hari. Penelitian dilakukan dengan menggunakan instrumen
ABI7500 dan CFX-96 PCR. Hasil dari penelitian menunjukkan presisi kit yang sangat
baik dengan CV <5%.
 Akurasi : Nasofaring dan Orofaring dari individu yang sehat, 100 masing-masing
diuji pada 3 lot untuk memvalidasi spesifisitas kit dan reaktivitas silang DNA
manusia. Hasil dari studi yang diberikan di bawah ini menunjukkan spesifisitas yang
sangat baik dari kit tanpa reaktivitas silang karena keberadaan DNA manusia.

 Studi klinis: Kit ini telah dievaluasi di Rumah Sakit Ditan Beijing (Universitas
Kedokteran Ibu Kota), Rumah Sakit Beijing Youan (Universitas Kedokteran Ibu Kota)
dan Institut Epidemiologi Mikroba (Akademi Ilmu Kedokteran Militer). Sebanyak 296
kasus dipelajari dan reagen yang dievaluasi serta hasil yang dikonfirmasi /
dikeluarkan secara klinis dibandingkan. Sensitivitas 101/107 = 94,39% (95% CI
88,10% ~ 97,91%) dan spesifisitas 189/189 = 100% (95% CI 98,07% ~ 100%).
Secara keseluruhan, presisi 290/296 = 97,97% (95% CI 95,64% ~ 99,25%). Ketika
kinerja kit dibandingkan dengan kit deteksi asam nukleat lain yang tersedia secara
komersial (uji yang disetujui CFDA China-EUA), Wantai SARS-CoV-2 RT-PCR
menunjukkan kesepakatan positif dan negatif dengan uji perbandingan 106/106 =
100% (95% CI 96.58% ~ 100%) dan 195/195 = 100% (95% CI 98.13% ~ 100%)
masing-masing. Total tingkat kesepakatan adalah 301/301 = 100 (95% CI 98,78% ~
100%). Dalam ruang lingkup penelitian ini, Wantai SARS-CoV-2 RT-PCR
menunjukkan sensitivitas yang lebih baik daripada uji perbandingan dan juga tingkat
deteksi yang sangat tinggi pada spesimen dari pasien yang secara klinis
terkonfirmasi COVID-19.
 Zat yang mengganggu: Zat berikut tidak mempengaruhi hasil tes. 0.2mg / L
beclomethasone, 0.15mg / L deksametason, 12mg / L triamcinolone, 0.4mg / L
budesonide, 0.05mg / L mometasone, 0.5mg / L fluticasone, 75mg / L benzocaine,
5mg / L zanamivir, 37.5mg / L oseltamivir, 75mg / L tobramycin, 50mg / L
amantadine, 75mg / L sulfur, 150mg / L thryallis, 50mg / L metiljinamin, 0.125mg / L
adrenalin, 25mg / L mentol, 0,05% hidroksimetazolin, 500mg / L flunisolide, 500mg /
L mupirocin, 400mg / L musin murni, 200μl darah hemolitik.