PROSEDUR PELAKSANAAN KERJA Biotephy SARS-CoV-2 Real Time PCR Detection

Kit
Komponen Bahan
Biotephy SARS-CoV-2 Real Time PCR Detection Kit Penyimpanan : -20°C - 25° C

 Informasi Singkat tentang Covid-19

Coronavirus merupakan virus dengan komponen RNA-utas positif sebagai molekul
genetiknya, dan termasuk kelompok keluarga Coronaviridae diantaranya 6 jenis spesies
Coronavirus dapat menyebabkan penyakit pada manusia. Empat spesies (229E, OC43, NL63,
dan HKU1) dapat menyababkan sakit flu biasa sedangkan 2 spesies lainnya (SARS-CoV, dan
MERS-CoV) dapat menyebabkan infeksi saluran pernapasan akut dengan implikasi medis yang
berbahaya.
Pada Desember 2019, beberapa pekerja di Wuhan, Provinsi Hubei, Cina dilaporkan
mengalami pneumonia dengan kasus tidak diketahui. Analisis sekuensing genetik patogen
melaporkan adanya varian virus Corona baru yang dinamakan SARS-CoV-2 atau Covid-19.
Diagnosis SARS-CoV-2 dideteksi dan diidentifikasi menggunakan metode Real Time PCR untuk
penanganan gejala pneumonia awal. Beberapa gen target Covid-1 9 yang disarankan oleh
WHO diantaranya merujuk kepada protokol beberapa lembaga kesehatan di dunia diantaranya
CDC Cina (ORF1ab, dan N), Charite-Jerman (RdRp, dan E), dan CDC Amerika Serikat (3 gen
target N).

 Prinsip DeteksiCovid-19
Biotephy SARS-CoV-2 Real Time PCR Detection Kit diperuntukkan untuk diagnosis SARS-
CoV-2 pada sampel saluran pernapasan. Tahap deteksi dilakukan dengan format satu tahap—
di mana tahap reverse transkripsi dilanjutkan amplifikasi gen target pada tabung reaksi dan
protokol yang sama. Sampel RNA akan membentuk DNA komplemen (cDNA) oleh reverse
transkriptase dan amplifikasi pada gen ORF1ab (dideteksi dengan FAM), gen N (dideteksi
dengan HEX), dan internal kontrol (dideteksi dengan CY5) menggunakan primer dan probe-
flurosens spesifik.
Biotephy SARS-CoV-2 Real Time PCR Detection Kit menggunakan prinsip aktivitas 5-
eksonuklease DNA polimerase—selama proses amplifikasi DNA, enzim akan memecah probe
yang terikat pada sekuen DNA komplemen dan memisahkan pewarna quencher dengan
reporter dye untuk membentuk sinyal flurosens yang sebanding dengan jumlah RNA target
pada sampel.
PROSEDUR PELAKSANAAN KERJA Biotephy SARS-CoV-2 Real Time PCR Detection
Kit
Perhatian : Semua sampel diperlakukan sebagai bahan bahaya biologis.

A. Penyimpanan Sampel
Sampel serum, plasma swab, dan darah disimpan pada suhu 2-8° C maksimum 4 hari,
sedangkan untuk penyimpanan jangka panjang sampel dapat disimpan pada suhu -80°C dalam
alikuot untuk mencegah pembekuan dan pencairan berulang. Sampel ekstraksi RNA disimpan
pada suhu -20°C (short time) atau -80°C untuk jangka panjang mencegah degradasi RNA.

B. Substansi Pengganggu
Heparin (≥ 10 IU/mL) merupakan inhibitor reaksi PCR yang berikatan dengan protein DNA.
Untuk efisiensi reaksi, inhibitor PCR dapat dibuang selama proses ekstraksi dan pemurnian
RNA. Penghilang substansi heparin dapat menggunakan Heparinase I atau LiCl-etanol.

INSTRUKSI KERJA
 Keluarkan Biotephy SARS-CoV-2 Real Time Detection Kit, lalu siapkan tabung premix sesuai
dengan jumlah sampel dan kontrol. Komposisi jumlah reaksi untuk setiap pemeriksaan
adalah 2 + n; n jumlah sampel ditambah 2 kontrol (kontrol negatif dan kontrol positif).
 Resuspensi kontrol positif dengan menambahkan 100 𝜇L PCR Grade Water (tabung putih) ke
dalam tabung kontrol positif SARS-CoV-2, kemudian medium vorteks 15 detik dan spin down
30 detik (tahap ini dilakukan hanya pada saat pertama kali menggunakan kit. Kontrol
Positif yang sudah diresuspensi disimpan pada suhu -20°C, sebaiknya membuat alikuot
untuk menghindari freezing/thawing)
 Resuspensi premix dengan menambahkan 800 𝜇L Rehydration Buffer (tabung biru) ke
dalam masing-masing vial mix (satu vial = 50 test), kemudian vortex medium 15 detik dan
spin down 30 detik. Selanjutnya bagi 15 𝜇L mix yang telah disuspensi ke dalam masing-
masing tabung PCR. (Apabila terdapat sisa pada premix yang sudah diresuspensi,
sebaiknya mix disimpan pada suhu -20°C).
 Tambahkan 5 𝜇L sampel RNA, dan kontrol positif SARS-CoV-2 (tabung merah), dan kontrol
negatif (tabung hijau) pada tabung PCR, kemudian tutup tabung dengan penutup tabung
yang sudah disediakan.
 Vorteks tabung PCR untuk homogenisasi.
catatan : pengaturan spinner (2500 rpm 15 detik, low vorteks 20 detik).
 Masukkan tabung PCR ke mesin Real-Time PCR. Pengaturan PCR pada program adalah
sebagai berikut,

Siklus Tahap Waktu Suhu

1 Reverse transkripsi 10 menit 50° C
1 Denaturasi awal 3 menit 95° C
45 Denaturasi 10 detik 95° C
Ekstensi dan pengambilan data 30 detik 60° C
(FAM, HEX, CY5)
Go to: 3; 45 cycle
Inkubasi: 20° C 1 menit
PROSEDUR PELAKSANAAN KERJA Biotephy SARS-CoV-2 Real Time PCR Detection
Kit

INTREPRETASI DATA
Suatu sampel dikatakan sinyal positif jika mempunyai nilai Ct≤40, dan kontrol internal
bisa menunjukan sinyal positif maupun negatif. Beberapa pemeriksaan, deteksi kontrol
internal tidak diperlukan karena adanya konsentrasi sampel tinggi sehingga dapat
menyebabkan kompetisi reagen selama proses reaksi. Suatu sampel dikatakan sinyal negatif
jika tidak memiliki kurva amplifikasi, dan kontrol internal positif (terdapat sinyal deteksi).
Kriteria penentuan positif dan negatif berdasarkan pada analisis Ct pada sinyal FAM dan
HEX. Berikut adalah Tabel Interpretasi.
Sinyal Nilai Ct Nilai Interpretasi
Probe
FAM Ct ≤40 Penentuan gen ORF1ab nCOV—2019
HEX Ct ≤40 Penentuan gen N Sarbecorona
CY5 Ct ≤40 Kontrol Internal

ORF1ab N Kontrol Kontrol Kontrol Interpretasi

(FAM) (HEX) Internal negatif positif
(CY5)
+ + +/- - + Positif SARS-CoV-2
- - + - + Negatif SARS-CoV-2
+ - +/- - + Positif SARS-CoV-2
- + +/- - + Positif SARS-CoV-2
+ + + + + Invalid—pengujian ulang
- - - - - Invalid—pengujian ulang
Catatan:

(*) : amplifikasi sinyal hanya pada satu gen dapat disebabkan oleh jumlah sampel RNA yang kurang dibawah
batas deteksi reaksi, terjadi mutasi pada gen target, dan terdapat sedikit perbedaan nilai amplifikasi pada gen
target.