RS.

BHAYANGKARA

PROSEDUR EKSTRAKSI

Prosedur ekstraksi Manual Protocol :

1. Pindahkan 200 µl sampel kedalam tabung 1,5 ml. Jika sampel kurang
dari 200 µl tambahkan PBS hingga volume mencapai 200 µl.
2. Tambah 400 µl buffer Lysis VB ke tabung sampel dan vortex selama
beberapa detik.
3. Inkubasi selama 10 menit disuhu ruang.
4. Tambah 450 µl buffer AD (pastikan ethanol absolut sudah
ditambahkan sebelumnya kedalam buffer ini) ke lysat sampel.
5. Aduk (shake) tabung secara simultan untuk homogenisasi.
6. Letakkan tabung VB column ke tabung koleksi 2 ml.
7. Pindahkan 600 µl lysat kedalam VB column.
8. Sentrifugasi kecepatan 14000-16000 x g selama 1 menit.
9. Buang cairan yang terdapat ditabung koleksi 2 ml, kemudian gunakan
kembali dan taruh VB column ditabung 2 ml tersebut.
10. Pindahkan sisa lysat sampel kedalam VB column dan sentrifugasi
kecepatan 14000-16000 x g selama 1 menit.
11. Buang tabung koleksi 2 ml yang dipakai dan pindahkan VB column ke
tabung koleksi 2 ml yang baru.
12. Tambah 400 µl buffer W1 kedalam VB column dan sentrifugasi
kecepatan 14000-16000 x g selama 30 detik.
13. Buang cairan yang terdapat ditabung koleksi 2 ml, kemudian gunakan
kembali dan taruh VB column ditabung 2 ml tersebut.
14. Tambah 600 µl buffer Wash (pastikan ethanol absolut sudah
ditambahkan sebelumnya kedalam buffer ini) ke VB column.
Sentrifugasi kecepatan 14000-16000 x g selama 30 detik.
15. Buang cairan yang terdapat ditabung koleksi 2 ml, kemudian gunakan
kembali dan taruh VB column ditabung 2 ml tersebut.
16. Sentrifugasi kecepatan 14000-16000 x g selama 1 menit untuk
mengeringkan column matrix.
17. Letakkan VB column yang telah dikeringkan kedalam tabung 1,5 ml.
18. Tambah 50 µl RNAase-free water tepat ditengah VB column matrix.
19. Biarkan dalam posisi tegak lurus selama 3 menit untuk memastikan
RNAase-free water diserap oleh matrix.
20. Sentrifugasi dengan kecepatan 14000-16000 x g selama 1 menit
untuk elusi asam nukleat.
21. Setelah selesai, untuk penyimpanan hasil ekstraksi simpan pada suhu
-20oC sampai -80oC.
 RS.
BHAYANGKARA

PROSEDUR MIXING DENGAN mBiOCOV-19

( RT-PCR Kit )

A. Persiapan sebelum mengerjakan PCR:

a. Persiapakan Reaction Mix dengan menghitung jumlah sampel yang
akan dikerjakan ditambah kontrol (negatif dan positif) dan satuy
ekstram, kemudian dikalikan dengan volume masing-masing reagen.

B. Pembuatan PCR Mix dengan MbioCoV-19 (RT-PCR-19)

a. Cairkan Universal Probes Reaction Mix, Reverse Transcriptase, RNase
Inhibitor, Primer Probes Mix, dan Nuclease-free Water pada suhu ruang,
setelah itu simpan pada es.
b. Spin down kira-kira 15 detik.
c. Buat PCR Mix dalam tabung Microcentrifuge steril 1,5 ml, sesuai dengan
tabel di bawah:

Komponen Volume (μl)

 Universal Probes Reaction Mix 10 µl
 Reverse Transcriptase 0,2 µl
 RNase Inhibitor 0,4 µl
 Primer Probes Mix 1,5 µl
 Nuclease Free Water 2,9 µl
 Campurkan dengan perlahan, spindown dan tranfer
15 µl ke masing-masing well
 Tambahkan Sampel hasil ekstraksi RNA atau Kontrol
5 µl
setiap well
 Sehingga Total Volume setiap well sebannyak : 20 µl
 Tutup plate dan lakukan quick spin
d. Campur PCR mix sesuai jumlah sampel kecuali template (RNA hasil
ekstraksi/Positif kontrol/Negatif kontrol), kemudian distribusikan ke
dalam tabung PCR 0.2 ml masing-masing 15 μl.
e. Tambahkan 5 μl template (RNA hasil ekstraksi/Positif kontrol/Negatif
kontrol) ke dalam tabung PCR yang sudah berisi PCR Mix.
 RS.
BHAYANGKARA

PROSEDUR MIXING DENGAN mBiOCOV-19

( RT-PCR Kit )

f. Program mesin pcr sesuai dengan tabel di bawah.

Program Step RT Step Denaturation Cycling

Cycles 1 1 45

Target [oC] 45 95 95 60

Hold
00:10:00 00:02:00 00:00:03 00:00:20
[hh:mmss]

Ramp Rate Fastest

Acquisition FAM/GREEN,HEX/
Mode None None None
Yellow,Cy5/Red

g. Interpretasi hasil :
Amplifikasi dinyatakan positif apabila nilai CT dibawah 40.00(<40.00) dengan
interpretasi, sebagai berikut :
Interpretasi
Helicase RdRP RPP30 Laporan Aksi
Hasil
SARS-CoV-2 Positif Kirim laporan ke
+ + +/-
terdeteksi COVID-19 Kemenkes
Disarankan
untuk dilakukan
uji ulang untuk
Jika salah satu SARS-CoV-2 Positif
+/- konfirmasi,
Positif terdeteksi COVID-19
sebelum
dilaporkan ke
Kemenkes
SARS-CoV-2
Negatif Kirim laporan ke
- - tidak
COVID-19 Kemenkes
terdeteksi

Ulangi Ekstrasi
dan RT-PCR. Jika
Negatif
- Invalid Invalid masih invalid,
COVID-19
sampel perlu
diambil ulang