PEMERIKSAAN LABORATORIUM VIRUS HIV

(METODE PCR)

Disusun Oleh :
Muhamad Nabiel Syauqi
Nim. 711345319079

PRODI D-III TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES MANADO
2021
 BAB 1
PENDAHULUAN
a. PERMASALAHAN

 Apakah pemeriksaan laboratorium pada pasien dengan infeksi virus HIV

 Bagaimana cara melakukan tentang pemeriksaan laboratorium infeksi virus HIV

 Bagaimana hasil pemeriksaan laboratorium infeksi virus HIV

b. TUJUAN

 Mahasiswa mampu mengetahui tentang pemeriksaan laboratorium infeksi virus

HIV
 Mahasiswa mampu melakukan tentang pemeriksaan laboratorium infeksi virus
HIV
 Mahasiswa mampu menjelaskan tentang hasil pemeriksaan laboratorium infeksi
virus HIV
 BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA

A. PATOGENESIS HIV

Dasar utama patogenesis HIV adalah kurangnya jenis limfosit Th yang mengandung
marker CD4 (sel-T).limfosit-T merupakan pusat dan sel utama yang telibat secara langsung
maupun tidak langsung dalam menjalankan fungsi imunologik (Siregar, 2004). Virus HIV
yang masuk ke dalam tubuh akan mengikat sel-sel dari sistem imun seperti monosit,
makrofag, dan sel T-limfosit (CD4, sel T) untuk memperbanyak diri, hal inilah dapat
menyebabkan orang yang terinfeksi HIV rentan terhadap berbagai penyakit dan dapat
menyebabkan kematian (Dumond dan Kashuba, 2009). Partikel virus HIV akan melalui
proses infeksi yang biasanya terdapat dalam darah, sperma atau cairan tubuh lain. Cara
penularan paling umum adalah transmisi seksual melalui mukosa genital (Suhaimi dkk,
2003).Transmisi virus HIV tergantung pada viral load individu yang trinfeksi. Viral load
adalah perkiraan jumlah copy RNA per mililiter serum atau plasma penderita. Orang yang
terinfeksi HIV didalam tubuh mengadung partikel virus, dimana sebagian pasien akan
memperlihatkan gejala tidak khas seperti demam, nyeri menelan, pembengkakan kelenjar
getah bening, ruam, diare, atau batuk 3-6 minggu setelah terinfeksi (Nursalam, 2007 :45).

B. JENIS-JENIS PEMERIKSAAN HIV

Menurut Meliani (2013), terdapat 7 jenis tes HIV/AIDS, yaitu :

1) ELISA

ELISA (Enzym-Linked Immunosorbent Assay), tes ini mendeteksi antibody yang

dibuat tubuh terhadap virus HIV. Antibody tersebut biasanya diproduksi mulai minggu ke-
2, atau bahkan minggu ke-12 setelah terpapar virus HIV. Karena alasan inilah maka para
ahli menganjurkan pemeriksaan ELISA dilakukan setelah minggu ke-12 sesudah
melakukan aktivitas hubungan seksual berisiko tinggi atau tertusuk jarum suntik yang
terkontaminasi.
Tes ELISA dapat dilakukan dengan sampel darah vena, air liur, atau air kencing.
Hasil positif pada ELISA belum memastikan bahwa orang yang diperiksa telah terinfeksi
HIV.
2) Western Bolt

Sama halnya dengan etes ELISA, Western Bolt juga mendeteksi antibody terhadap
HIV. Western bolt menjadi ters konfirmasi bagi ELISA karena pemeriksaan ini lebih
sensitive dan lebih spesifik, sehingga kasus yang tidak dapat disimpulkan sangat kecil.
Walaupun demikian, pemeriksaan ini lebih sulit dan butuh keahlian lebih dalam
melakukannya.
3) Rapid Tes

Saat ini telah tersedia tes HIV cepat (Rapid HIV Test). Pemeriksaan ini sangat mirip
dengan ELISA. Ada dua macam cara yaitu menggunakan sampel darah jari dan air liur.
4) IFA (Indirect Fluorescent Antibody)

IFA atau indirect fluorescent antibody juga merupakan pemeriksaan konfirmasi

ELISA positif. IFA juga mendeteksi antibody terhadap HIV. Salah satu kekurangan dari
pemeriksaan ini adalah biayanya yang mahal.
5) PCR Test

PCR atau polymerase chain reaction adalah uji yang memeriksa langsung
keberadaan virus HIV di dalam darah. Tes ini dapt dilakukan lebih cepat yaitu sekitar
seminggu setelah terpapar virus HIV. Tes ini sangat mahal dan memerlukan alat yang
canggih. Oleh karena itu, biasanya hanya dilakukan jika diuji antibody diatas tidak
memberikan hasil yang pasti. Selain itu, PCR test juga dilakukan secara rutin untuk uji
penapisan (screeing test) darah atau organ yang akan didonorkan.
6) Tes CD4

Satu akibat dari infeksi HIV adalah kerusakan pada sistem kekebalan tubub kita.
HIV membunuh satu jenis sel darah putih yang disebut sel CD4. Sel ini bagian penting dari
sistem kekebalan tubuh, dan jika ada jumlahnya yang kurang, sistem tersebut menjadi
terlalu lemah untuk melawan infeksi. Jumlah sel CD4 dapat diukur melalui tes darah
khusus. Jumlah normal pada orang sehat antara 500 sampai 1.500. setelah terinfeksi HIV,
jumlah ini biasanya turun terus. Jadi jumlah ini mencerminkan sistem kekebalan tubuh kita
: semakin rendah, semakin rusak sistem kekebalan. Jika jumlah CD4 turun dibawah 200,
ini menunjukkan bahwa sistem kekebalan tubuh cukup rusak sehingga infeksi oportunistik
dapat menyerang tubuh. Ini berarti sudah sampai masa AIDS.
7) Tes TLC

Karena sel CD4 adalah anggota golongan sel darah putih yang disebut limfosit,
jumlah limfosit total juga dapat memberi gambaran tentang kesehatan sistem kekebalan
tubuh. Tes ini yang disebut sebagai lymphocyte count atau TLC, adalah murah dan bisa
dilaksanaan pada hampir semua laboratorium. Seperti jumlah CD4, semain rusak sistem
kekebalan, semakin rndah TLC. Pada orang sehat, TLC normal adalah kurang lebih 2000.
TLC 1.000-1.250 biasanya serupa dengan CD4 kurang lebih 200.
 BAB 3
METODELOGI PEMERIKSAAN
a) Pra Analitik

1. Persiapan Sampel

RNA yang dimurnikan adalah bahan awal untuk Kit RT-PCR Kuantitatif HIV
Norgen. Kualitas template RNA akan berdampak besar pada kinerja tes diagnostik.
Pengguna harus memastikan bahwa metode yang digunakan untuk pemurnian RNA
kompatibel dengan teknologi RT-PCR. Kami merekomendasikan penggunaan kit
pemurnian Norgen untuk isolasi RNA, termasukKit Pemurnian RNA Total Norgen (Cat#
17200), RNA Sirkulasi Plasma/Serum, dan Kit Pemurnian Eksosom (Cat# 42800), Kit
Pemurnian RNA Plasma/Serum (Cat#55000). Jika menggunakan prosedur preparasi
sampel berbasis kolom spin yang berbeda yang mencakup buffer pencuci berbasis etanol,
langkah pengeringan kolom yang terdiri dari sentrifugasi selama 10 menit pada 14.000 xg
(~14.000 RPM), menggunakan tabung pengumpul baru, sangat disarankan sebelum elusi
RNA. Ini akan membantu mencegah terbawanya etanol apa pun ke dalam RNA yang
dimurnikan, karena etanol dikenal sebagai penghambat kuat PCR.Pastikan bahwa setiap
jejak etanol dari langkah persiapan sampel dihilangkan sebelum elusi RNA.
2. Alat dan bahan

Kit Pemurnian RNA Instrumen PCR Titik Akhir atau Real-Time yang sesuai. Kit ini
kompatibel dengan semua kit pemurnian RNA yang menghasilkan kualitas tinggi,
inhibitor- DNA bebas. Kit Pemurnian yang Direkomendasikan: Kit pemurnian Norgen
Biotek untuk RNA isolasi, antara lain: Kit Pemurnian RNA Total - Cat# 17200 Plasma
/Serum Circulating RNA dan Kit Pemurnian Eksosom - Cat# 42800 Kit Pemurnian RNA
Plasma/Serum - Cat#55000, Sarung tangan sekali pakai, Benchtop microcentrifuge
Micropipettors, Ujung pipet steril dengan filter, tabung PCR Pengaduk pusaran Alat
elektroforesis gel agarosa (End-Point PCR), Transilluminator UV dengan sistem
dokumentasi gel yang sesuai (End-Point PCR).
 Kontrol kualitas

Sesuai dengan Sistem Manajemen Mutu bersertifikasi ISO 9001 dan ISO 13485 dari
Norgen, setiap lot Kit RT-PCR Kuantitatif HIV Norgen diuji terhadap spesifikasi yang
telah ditentukan untuk memastikan kualitas produk yang konsisten.

b) Aspek Analitik
Prosedur pemeriksaan :
1. Untuk setiap set RT-PCR, siapkan satu tidak ada template control RT-PCR seperti
terlihat pada Tabel 1 di bawah ini:

2. Siapkan reaksi RT-PCR untuk deteksi sampel seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2
di bawah ini. Jumlah sampel RNA yang direkomendasikan untuk digunakan adalah
2,5 L. Namun, volume antara 1 dan 5 L sampel RNA dapat digunakan sebagai
cetakan. Sesuaikan volume akhir reaksi RT-PCR menjadi 20 L menggunakan Air
Bebas Nuklease yang disediakan.
 3. Untuk setiap set RT-PCR, siapkan seri pengenceran Kontrol Positif seperti yang
ditunjukkan pada Tabel 3 di bawah ini:

4. Dengan menggunakan seri pengenceran Kontrol Positif yang disiapkan di atas,

siapkan PCR kontrol positif seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4 di bawah ini:

Pemrograman Pengujian RT-PCR HIV

1. Program thermocylcer sesuai dengan program yang ditunjukkan pada Tabel 5 di bawah
ini. 2. Jalankan satu langkah RT-PCR.
c) Pasca Analitik
Interpretasi Hasil

Untuk analisis waktu nyata, gunakan perangkat lunak analisis thermocycler untuk
menghasilkan kurva standar menggunakan nilai Ct dari Seri Pengenceran Kontrol Positif.
Kurva standar kemudian dapat digunakan untuk menentukan jumlah awal sampel yang
diinginkan. Untuk analisis data RT-PCR titik akhir, seluruh reaksi RT-PCR 20 L harus
dimuat pada gel DNA Agarose 1X TAE 2% bersama dengan 10 L Penanda DNA Norgen
(disediakan). Produk RT-PCR harus diselesaikan pada 1X TAE, 2% Agarose gel pada 150V
selama 30 menit ( Gel waktu berjalan akan bervariasi tergantung pada peralatan
elektroforesis).
Uji Coba yang Valid

Sampel Positif: Suatu sampel dinyatakan positif hanya jika: Jalur sampel menunjukkan pita
142 bp yang sesuai dengan amplikon target HIV Hai Kontrol Positif menunjukkan pita 142
bp. Kontrol Positif menunjukkan pita 142 bp bahkan diencerkan hingga sedikitnya 20
eksemplar per L. Kontrol Negatif tidak menunjukkan pita.
Sampel Negatif: Suatu sampel dinyatakan negatif hanya jika: Hai Jalur sampel tidak
mengandung pita. Kontrol Positif menunjukkan pita 142 bp Hai Kontrol Negatif tidak
menunjukkan pita.
Uji Coba Tidak Valid

Uji coba tidak valid jika: Jika belum selesai Kontrol Positif tidak menunjukkan pita 142
bp. Kontrol Negatif menunjukkan amplifikasi apa pun.
 BAB 4

HASIL PEMERIKSAAN DAN PEMBAHASAN

Gel agarosa 1X TAE 2% yang representatif menunjukkan amplifikasi HIV. Ukuran amplikon
target HIV sesuai dengan pita 142 np bp yang diwakili oleh Penanda DNA (M) yang disediakan.
Tidak ada amplifikasi target yang diamati dengan Kontrol Negatif

Pembahasan :

Hasil negatif yang ditunjukkan dengan tidak didapatkannya pita pada hasil elektroforesis.
Hasil negatif yang didapat bukan berasal dari kesalahan teknis laboratorium karena peneliti telah
mengulang pemeriksaan dan telah menggunakan kontrol amplifikasi eksternal. Kontrol
amplifikasi eksternal menggunakan sampel yang sudah diketahui HIV positif dengan
menggunakan kit dan metode deteksi yang sama menunjukkan hasil positif pada PCR dan
elektroforesis. Selain itu, dalam deteksi molekuler HIV juga dilakukan deteksi gen pol
menggunakan kit dan sampel yang sama namun tetap memberikan hasil negatif meskipunkontrol
ekternal untuk amplifikasi gen HIV pol memberikan hasil positif. Hal tersebut menunjukkan tidak
ada kesalahan dalam teknik, kit, dan primer yang digunakan dalam penelitian Hasil negatif pada
deteksi molekuler kemungkinan besar disebabkan virus yang tidak terambil saat pengambilan
darah intravena karena jumlah RNA virus yang sedikit. Sedikitnya jumlah virus bisa disebabkan
sifat virus yang kurang patogen sehingga mudah ditangani oleh sistem imun yang relatif lebih kuat
(Cao et al., 1995; Pantaleo et al., 1995). Sistem imunitas yang berperan dalam hal ini adalah CD8+
yang mampu menekan replikasi virus sehingga mengurangi
jumlahnya (Simon et al., 2006). Jumlah CD8+ yang telah diketahui meningkat dapat menghambat
replikasi virus sampai 90 % (Cao et al., 1995). Sedangkan, monitor jumlah CD4+ lebih dari 600
sel/mm3 secara berkelanjutan dapat menetapkan individu tersebut temasuk kasus HIV non
progresif (Pantaleo et al., 1995). Sayangnya, dalam penelitian ini tidak dilakukan pemeriksaan
jumlah CD4 dan CD8.

Kemungkinan yang mengakibatkan hasil negatif deteksi molekuler dapat dikarenakan

jumlah RNA virus di bawah batas deteksi untuk mampu memberikan tanda (pita) saat
dielektroforesis yaitu 104 kopi/ml (Promega, 2011). Perjalanan penyakit yang lambat pada
individu tersebut, sistem imun yang relatif kuat, adanya delesi pada gen gag yang membuat virus
tersebut kurang patogen, atau terinfeksi oleh HIV subtipe lain yang belum bisa terdeteksi juga
mengakibatkan hasil deteksi molekuler negatif (Kovacs, 2001). Tidak menutup kemungkinan
adanya resistensi terhadap virus HIV pada responden, seperti kasus HIV non progresif yang sudah
pernah dilaporkan sebelumnya akibat adanya polimorfisme atau variasi genetik dari koreseptor C-
C Chemokine Receptor type 5 (CCR5) berupa delesi sebanyak 32 bp pada gen CCR5 yang dikenal
dengan nama CCR5Δ32 (atau CCR5delta32 atau CCR5-D32).
 BAB 5
KESIMPULAN
Deteksi molekuler dengan RT PCR HIV gag memberikan hasil negative tidak

didapatkannya pita pada hasil elektroforesis.

 DAFTAR PUSTAKA

- http://repository.unimus.ac.id/2643/3/BAB%20II.pdf

- http://eprints.poltekkesjogja.ac.id/2238/3/BAB%20II.pdf

- http://eprints.poltekkesjogja.ac.id/2238/3/BAB%20II.pdf

- https://digilib.uns.ac.id/dokumen/download/23411/NTA5NzI=/Deteksi-Hiv-Pada-

Komunitas-Gigolo-Surakarta-Menggunakan-Determine-Hiv-12-Dan-Nested-PCR-

HIV-GAG-abstrak.pdf

- https://norgenbiotek.com/sites/default/files/resources/HIV-Quantitative-RT-PCR-Kit-

Insert-PI33740-1.pdf
 CURICULLUM VITAE

Nama : Muhamad Nabiel Syauqi

Jenis Kelamin : Laki-laki
Umur : 19 Tahun
Tempat/tanggal Lahir : Amurang, 11-12-2001
Alamat : Amurang, Minahasa Selatan.
Agama : Islam
Warga Negara : Indonesia
No HP : 0813-1945-6394
Alamat E-mail : nabielsyauqi808@gmail.com

Riwayat Pendidikan
2007 – 2013 : Madrasah Ibtidaiyah Amurang
2013 – 2016 : Madrasah Tsanawiyah Alkhairat Amurang
2016 – 2019 : SMA N 1 Amurang
2019 – Sekarang : Politeknik Kesehatan Kemenkes Manado Jurusan
Teknologi Laboratorium Medik