02/11/2019

PURWANTO

Seminar Nasional ITPAI, 8-10 November 2019, Hotel IBIS, Bandung

 Potong beku adalah prosedur untuk melakukan analisis

mikroskopis histologi cepat dari suatu spesimen.

 Kualitas slide potong beku lebih rendah daripada blok

paraffin.

 Final diagnosis tetap lebih disukai dengan blok paraffin untuk

diagnosis yang lebih akurat.

1
 02/11/2019

 Konsultasi intraoperatif adalah nama yang diberikan untuk

seluruh intervensi oleh ahli patologi, yang tidak hanya potong

beku tetapi juga evaluasi gross spesimen, pemeriksaan sitologi
dan aliquoting spesimen

 Laporan yang diberikan oleh patolog biasanya terbatas pada

diagnosis ”Jinak" atau ”Ganas"

2
 02/11/2019

 Ketersediaan mesin cryostat

 Harus menerima formulir lengkap
 Apa yang ingin diketahui ahli bedah.?
 Apa yang telah dikirim ahli bedah?
 Bagaimana cara menghubungi mereka?

1. Pemilihan jaringan dan area yang representatif dari organ

/ jaringan yang dikirim

2. Jenis jaringan harus dipotong pada suhu yang tepat

3. Pertimbangan waktu

3
 02/11/2019

 Waktu pelaporan: 20 menit (Dalam 90% kasus)

 Spesimen harus dikirim segar; tanpa formalin.

 Dalam beberapa kasus, Patholog membuat imprint dari

spesimen yang diterima.

1. CRYOSTAT
 Mikrotom di dalam chamber

 Mikrotom dalam kontrol suhu yang stabil

2. FREEZING MICROTOME
 Jaringan di fiksasi terpisah

 Mikrotom tidak dalam kontrol suhu yang stabil

4
 02/11/2019

 Single compressor (chamber cooling only)

 Double compressor (chamber and object cooling)
 Manual sectioning
 Motorized sectioning

 Suhu kerja normal dari 0 ° C hingga -35 ° C.

 Cryosectioning pada suhu lebih rendah dari -35 ° C membutuhkan penggunaan
cryogen seperti nitrogen cair.

10

5
 02/11/2019

11

12

6
 02/11/2019

13

 Ukuran celah 50, 100, dan

150μm tersedia tergantung
pada ketebalan yang
diperlukan.
 Misalnya, jika microtomi
<5.0 μm, maka ukuran celah
50 μm akan cocok.

14

7
 02/11/2019

 Specimen holders or chucks. Specimen

holder of different sizes and shapes are
made to accommodate various
embedding tasks

15

 Cryostat handwheel.
 The arrow indicates the
locking mechanism

16

8
 02/11/2019

 Sisa potongan harus dibersihkan setelah digunakan.

 Baki limbah yang ada serpihan sampel ditempatkan ke dalam
kantong biohazard.
 Bersihkan dengan handuk kertas atau kain kasa yang direndam
dalam alkohol 70% atau pembersih komersial sbb:
A disinfectant spray system
Formaldehyde vapor
A combination of disinfectant spray and UV light
Ozone

All users should be responsible to ensure that the cryostat is kept clean, to minimize the risk of infection by inhalation
and to reduce the risk of cross contamination of a section or tissue sample.

17

 Harian:
Kunci handwheel mikrotom.
Buang semua sisa-sisa potongan, menggunakan handuk kertas yang
direndam alkohol atau sistem vakum yang sesuai.
Keluarkan semua spesimen.
Keluarkan semua pisau.
Lepaskan semua chuck dan rendam dalam air sabun hangat untuk
memastikan bahwa semua senyawa cryo dihilangkan; udara atau oven
kering.

 Mingguan:
Wadah limbah cair dibawah alat dikosongkan
Bersihkan secara menyeluruh permukaan tempat pisau.

18

9
 02/11/2019

 Bulanan:
Pelumasan spindel:
Pastikan bahwa handwheel microtome terkunci.
Dengan menggunakan pipet sekali pakai, taruh beberapa tetes
pelumas (disuplai dengan cryostat) ke belakang (dekat dengan wadah
mikrotom) permukaan atas spindle
Tarik spindel ke posisi awal. Masalah spindel dapat menyebabkan
potongan tidak merata dan bagian yang tebal dan tipis.
Pembersihan ventilasi kompresor samping untuk menghilangkan
semua debu dll.

 Tahunan:
Instrumen di maintenance oleh teknisi kompeten dari vendor

19

 Verifikasi pelabelan spesimen dan identifikasi pasien

 Tinjau Informasi Klinis
 Periksa dan palpasi semua permukaan luar spesimen
dengan hati-hati dengan memperhatikan setiap
penyimpangan dari anatomi normal
 Memahami batas sayatan
 Beri tinta batas sayatan

20

10
 02/11/2019

 True resection margin .

 Gambar menunjukkan
mock-up dari jaringan
payudara (kuning) dengan
tumor (ungu) memanjang
ke margin tinta (hitam).

21

False positive margins.

 Margin yang sebenarnya tidak sengaja diinsisi selama
operasi atau saat grossing dan ditutupi oleh tinta.
 Slide di bawah ini akan secara keliru diartikan sebagai
tumor yang memanjang ke margin reseksi tinta di bawah
mikroskop.
 Tinta yang diterapkan pada permukaan non margin akan
menciptakan potensi untuk interpretasi positif palsu dari
margin spesimen
False negative margin
 Kegagalan karena tidak memberikan tinta hitam ke seluruh
permukaan margin.
 Slide di bawah ini menunjukkan bahwa margin positif
akan tidak terdeteksi karena tidak tercakup oleh tinta di
mana tumor bertemu permukaan

22

11
 02/11/2019

Mislabeled margin.
 Tinta merah dari batas superior
dioleskan ke batas medial.
 Slide di bawah ini diambil dari
batas medial menunjukkan tumor
memanjang ke tinta merah dan
akan disalah artikan sebagai batas
superior positif

23

The sausage trick. (a) Place the specimen on the diagonal in the center of a strong dry paper towel or absorbent pad.
(b) Fold the towel diagonally across the tissue. (c) Crimp the towel firmly to the tissue and roll the towel and tissue
into a firm sausage. (d) Slice the sausage into 3-mm slices. (e) Unroll the towel by gently pulling the corner
backward. (f) The sliced specimen is still mostly intact. (g) Lay out the specimen entirely in an orderly fashion. (h)
Examine each piece visually and by palpation

24

12
 02/11/2019

1. Touch prep – Cocok untuk kelenjar getah bening dan jaringan seluler
lainnya.
2. crape prep – Cocok untuk spesimen keras, berguna dalam menghasilkan
sel untuk tumor keras dan tumor seluler dan fibrosa yang
buruk
3. Crush preps – Persiapan dapat dibuat dari spesimen lunak kecil yang tidak
dapat dikikis atau dimanipulasi untuk imprint

25

Touch preparation
Scrape preparation

(a) after blotting the excess blood from a freshly cut surface; touch
the tissue to the slide and immediately fix the slide in 95% EtOH or
Air dry. (b) The slide with visible imprint. (c) Stained slide (Diff-
Quick stain)
(a) Scrape the edge of the slide on the tissue face. (b)
Smearing the scrapings on a second slide. (c) Stained
preparation (Diff-Quick stain)

26

13
 02/11/2019

 Crush preparation.

(a) Place a sample of tissue on the

slide. Tissue can be less than a
millimeter in diameter and not
larger than 2 mm.
(b) (b) Place the second slide in
smearing position. Gently apply
slight pressure to the tissue
watching the effect of the
crushing on the tissue and
being careful not to over crush
the tissue.
(c) (c) Smear the tissue and
immediately fix the slide in 95%
EtOH.
(d) (d) Smeared tissue on the slide.
(e) (e) Stained preparation (Diff-
Quick stain)

27

Face Up embedding.
In this example of face down embedding, the tissue is embedded
with its broad face down on the well floor of a well bar. Using
face up embedding the broad face is would be up; In both the
cases, the broad surface will be visible under the microscope.
(b) On-edge embedding. The illustration show the yellow tissue
Face down embedding
embedded by standing it on its nar rower surface. The cross
Tissue placed on the floor of the mold and covered
section of the edge will be visible under the microscope
with the embedding medium. A chuck placed on top of
the filled mold.

28

14
 02/11/2019

Apparatus of the Precision

Cryo embedding System :
(a) Well bars (from top to bottom):
a.1. 30 mm well bar
a.2. 24 mm well bar
a.3. 18 mm well bar
b) Chucks or specimen stages.
c) Over-chuck freezing block.
d) Dispensing slides

29

30

15
 02/11/2019

31

 Approximate freezing times

with bars and chucks at −24°C:

18-mm well – 20 s

24-mm well – 35 s

30-mm well – 60 s

32

16
 02/11/2019

 Artefak beku dihasilkan dari

fomasi kristal es ketika air
membeku dalam jaringan.
Artefak akan jauh lebih menonjol
pada jaringan yang memiliki
kadar air tinggi.
 Ada beberapa cara kita dapat
mengurangi artefak beku dengan
mempercepat proses pembekuan
menggunakan well bar untuk
membekukan jaringan.

33

Teknik potong margin ureter.

a) Basahi permukaan jaringan dengan
media.
b) Pegang jaringan dengan pinset
dimana target kearah dasar well bar
c) Sambil memegang jaringan dengan
pinset, jaringan dipotong dengan
pisau bedah.
d) Isi well bar dengan media dan
tempelkan chuck

34

17
 02/11/2019

a) Teknik memotong
seperempat serviks dengan
batas vagina terlampir
(panah).
b) Margin yang diinginkan
ditempatkan menghadap
dasar well bar.
c) Potong jaringan
menggunakan pinggiran well
bar sebagai panduan.
d) Bagian yang dipotong setelah
dipotong.

35

Teknik plesteran dan

pengangkatan jarum jahitan.
a) Keluarkan jarum jahit dengan
memegang jahitan dengan
hemostat atau forsep.
b) Oleskan media kebagian
berlubang.
c) Tekan blok dengan over-chuck
ke permukaan chuck untuk
membekukan media.
d) Blok tertutup sempurna
kembali

36

18
 02/11/2019

 Teknik penyisipan menggunakan selembar

kertas lensa untuk memindahkan jaringan ke
well bar pada posisi yang tepat.
 Hal ini memungkinkan orientasi akurat
menggunakan jaringan yang paling tipis atau
pengaturan jaringan yang kompleks(Peters,
Fitzgerald et al 2003).

37

38

19
 02/11/2019

39

PM1

 Pembekuan spesimen dilakukan secepat mungkin untuk menghilangkan formasi kristal es

(artefak beku).
 Untuk mencapai pembekuan cepat ukuran spesimen harus dikontrol, rekomendasi ukuran
specimen adalah 2 cm × 2 cm × 2mm.
 Spesimen beku dipasang pada chuck dengan cryocompound
dan ditempatkan di rak pembekuan
 Ekstraktor panas dapat digunakan untuk membantu pembekuan
dan permukaan blok yang rata.
 Ekstraktor panas adalah baja stainless yang didukung pada
lengan berengsel yang biasanya dipasang di atas rak
pembekuan
 Semua aksesori; microtome blade, antiroll, brush, dll. harus
ditempatkan ke dalam cryostat sebelum instrumen dinyalakan.

Heat extractor mechanism

40

20
Slide 40

PM1 Purwanto MBS, 29/10/2019

 02/11/2019

Sebelum memulai, periksa dan konfirmasi hal-hal berikut:

1. Konfirmasikan bahwa suhu ruang (dan 8. Buka kunci hand wheel dan mulai memotong.
suhu objek) sudah diatur;
2. Suhu awal adalah −20 ° C. 9. Ketika selesai, KUNCI handwheel.
3. Pastikan handwheel TERKUNCI. 10. Lepaskan spesimen dari holdernya

4. Pastikan sudut jarak tempat pisau telah 11. Simpan atau fiksasi untuk proses lanjutan
diatur dengan benar.
12. Lepaskan pisau mikrotom.
5. Masukkan pisau mikrotom baru dan
periksa apakah telah dijepit dengan 13. Bersihkan limbah spesimen.
kuat. 14. Pastikan cryostat dibiarkan dalam kondisi
6. Masukkan spesimen dan pastikan benda bersih dan aman.
itu dijepit dengan kuat ke dalam
dudukan benda.
7. Konfirmasikan bahwa ketebalan yang
diinginkan telah ditetapkan.

41

 Atur triming15 μm
 Potong tipis dengan mikrometer 5 μm.
 Bersihkan sisa trimming lalu dengan
hati-hati turunkan antiroll dan lanjutkan
pemotongan.
 Angkat antiroll dengan hati-hati dan
dengan brush atur posisi potongan.
 Ambil kaca slide dan pegang dengan
sudut yang lebih rendah turunkan ke
bagian seperti yang ditunjukkan pada
Gambar.
 Bagian jaringan beku segar akan
melekat pada slide kaca biasa karena
adanya protein dan lipid.

42

21
 02/11/2019

 Segera fiksasi kecuali jika akan disimpan untuk studi selanjutnya.

 Bagian jaringan beku segar akan cepat kering jika terkena udara hangat,
dan ini akan menghasilkan artefak seluler.
 Jika slide unstain akan disimpan untuk studi di masa depan, slide harus
segera ditempatkan ke dalam kotak slide yang telah didinginkan.
 Kotak slide harus ditutup dan dibungkus dengan aluminium foil ganda,
diberi label, dan masukan ke dalam freezer −80 ° C. Jaringan tidak akan
rusak selama disimpan pada suhu −80 ° C atau lebih rendah.
 Spesimen sisa setelah di potong dapat disimpan untuk digunakan di masa
depan dengan secara hati-hati dikeluarkan dari chuck dengan
menggunakan spatula, atau dengan menghangatkan chucknya. Buang
cryocompound sebanyak mungkin dari sekitar spesimen; bungkus
dengan lapisan ganda aluminium foil; beri label dan simpan di −80 ° C.

43

Anti Roll

The Blade

Holding the Brush

Trimming the Block

Retrieving the Section

44

22
 02/11/2019

 Perangkat antiroll (panah) pada

posisinya tepat berada di tepi pisau.
 Saat bagian tersebut dipotong
(panah) ia lewat di bawah perangkat
antiroll membantu bagian tersebut
tetap rata

45

 Changing the blade on every case

 Listen to the Blade
here is almost no sound at all
When a block is too cold, there is a distinct sound as the blade
scratches the icy block
 Blade Angle

 low-profile disposable blades, the blade

angle is between 3° and 5°
 High-profile blades it is between 5° and
7°
 Reusable blades it is between 5° and 7°.

46

23
 02/11/2019

 The brush is held at approximately a 45

degree angle to the block face and a 45 degree
angle to the stage. The ultimate position will be
dictated by what is comfortable for the operator
in a particular cryostat.

47

Continuous motion brush technique.

a. The frozen section brush at the starting position, home

plate, gently resting on edge of the block in its up
position. The white arrows show the elliptical path that
the brush will travel in continuous motion. From this
point the brush will ride the block to the blade.
b. The block and brush have now descended to the
blade. Upon reaching the blade, the brush gently lifts
up as it crosses the blade while holding onto the edge
of the curl of the forming section. The brush now
changes to a horizontal path to carry the section
across the stage.
c. The brush gently glides the section across the stage
without pressing the tissue to the stage. The brush
follows the path of the arrows in continuous motion to
return to the block in the up position

48

24
 02/11/2019

 Cuci dengan Sabun dan air

keringkan dengan kain kasa
 Celupkan dalam ETOH dan
keringkan dengan kain kasa
 Celupkan dalam xylene dan
keringkan dengan kain kasa
 Dinginkan sikat dengan
menekannya ke permukaan
dingin di cryostat selama
beberapa

49

 Reading the block. The pictures illustrate a trimmed

frozen section block of skin embedded as a block face.
Figure (a) shows a premature face. The arrows show an area
from 7:00 to 2:00 which has not yet been reached by the
knife. The haziness of the overlying embedding medium is
clearly visible from 9:00 to 12:00, but much less apparent at
the periphery of these zones. Figure (b) shows the mature
face. The block is fully trimmed. All of the tissue is clearly
visible and margins are sharp opaque lines

50

25
 02/11/2019

51

A. Temperature of the Block

B. Cutting of Specific Tissues
C. Curling Away
D. Thickness of the Section
E. Stripes and Chatter

52

26
 02/11/2019

 Rentang suhu −16 hingga −20 ° C.

 Saat suhu turun di bawah sekitar −25 potongan mudah
keriting dan pecah
 Dengan turunnya suhu, jaringan menjadi lebih keras,
menghasilkan peningkatan tekanan pada mata pisau.
 Blok yang sangat dingin dapat menimbulkan masalah baru
seperti bagian tebal dan tipis

53

54

27
 02/11/2019

Shattering.
(a–d) Examples of shattering artefact in frozen sections of liver
tissue as temperatures from very cold to warmer and closer to
optimal temperature.
(a) A frozen section block of liver cut at approximately −35°C.
There is severe shattering.
(b) is cut at approximately -25°C. Shattering is still quite
obvious.
(c) (c) and (d) More subtle examples of shattering as the
block gets closer to ideal temperature. Such subtle
artefacts may go undetected unless carefully looked for.
(d) A 40× photomicrograph of figure d. The shattering artefact
which is so subtle in figure d is visible as the white liner
clefts.
(e) (f) Illustration of differential shattering within a single
section. This 40× micrograph shows a kidney tumor on the
left which is showing a greater tendency to shatter than
the neighboring normal kidney on the right. Presumably
this tissue contains higher water content increasing its
tendency to shatter

55

Menghangatkan blok

a) Hangatkan blok dengan ibu jari ditekan

ke permukaan jaringan untuk waktu yang
lama.

b) Jaringan sedikit lebih hangat dan kusut

saat dipotong.

c) Dinginkan blok secara perlahan dengan

over-chuck.

d) Pada suhu ideal, jaringan akan

membentuk lembaran potongan yang
rata

56

28
 02/11/2019

 Various types of tissue will exhibit different properties when cutting a frozen section.

a) Softer Non-fatty Tissues

b) Watery Tissues (sectioned at the warm temperature to minimize shattering)
c) Tough Collagenous Tissues (generally cut well in small pieces)
d) Bony Hard Tissues (first trim the block and then change to a new section of blade)
e) Necrotic and Liquifactive Tissues (The tissue samples should be taken grossly to include both
viable and necrotic tissues if available so, at least a portion of the tissue will have the structural
integrity to yield interpretable tissue. A handle of embedding medium will help support the
section)
f) Fatty Tissues (Dissect off any unessential fat, Start with a sharp blade, a very cold block and a
clean stage)

57

Embedding fatty breast tissue

a) Jaringan payudara dengan
jaringan tumor di sebelah kiri dan
margin tinta berlemak di sebelah
kanan.
b) Blok dipotong mengenai tumor
dahulu tanpa gangguan dari
jaringan lemak di sebelah kanan.
c) Bagian utuh dengan lubang halus
dari jaringan adiposa

58

29
 02/11/2019

Cutting a block without a

handle.

a) A block with pure fat

without a handle of
medium to first hit the
blade. Figure
b)That the fat immediately
smears upon hitting the
blade. Without the medium
completely framing, the
section will not maintain its
shape and simply smears

59

a) Jaringan kulit tertanam dilipat

dua sehingga epidermis
mengelilingi seluruh permukaan
luar (panah).
b) Ketika jaringan dipotong, ada
kecenderungan alami untuk
epidermis untuk terpisah dari
media embedding. Akibatnya,
bagian jaringan mrnggulung
menjauh dari media embedding
karena sifat jaringan yang
berbeda menyebabkannya
melengkung ke tingkat yang
lebih besar daripada medium.
c) Menghangatkan blok dengan
ibu jari mengurangi keriting
pada medium dan jaringan.

60

30
 02/11/2019

Mengenali ketebalan bagian.

 Gambar (a, c, e) jaringan hati ketebalan 3,
6 dan 10μ. Dengan meningkatnya
ketebalan, jaringan akan menunjukkan
warna gelap dan akan memiliki
penampilan yang kurang fleksibel dan
menunjukkan peningkatan
kecenderungan hancur.
 Gambar (b, d, f) potongan blok kosong
ketebalan 3, 6, dan 10 μ. Cryocompound
menjadi semakin buram, dan tepi yang
lebih kaku dan tampak kurang fleksibel

61

62

31
 02/11/2019

Drying artifact.
 Gambar kiri dilakukan fiksasi segera dalam
Alkohol 95%.
 Gambar kanan dilakukan penundaan fiksasi 15
detik setelah potong beku
Hasil:

 Gambar (a) dan (c) menunjukkan detail sitologi

yang tajam termasuk kromatin inti dan batas
sitoplasma yang terdefinisi dengan baik.

 Sebaliknya bagian dengan fiksasi tertunda

menunjukkan kromatin yang tercoreng dan
membran inti yang tidak terdefinisi dengan baik.
Batas sitoplasma kabur

63

1. Hematoxalin 60 s
2. Rinse in water
3. Bluing 10 s
4. Rinse in water
5. Eosin 15 s
6. 95% ETOH 10 s
7. 100% ETOH 10 s
8. 100% ETOH 10 s
9. Xylene 10 s
10. Xylene 10 s
11. Apply cover slip with mounting
medium.

64

32
 02/11/2019

REFERENSI :
 Peters S (2003) The art of embedding tissues for Frozen section.
Part I – A system of precision face down cryoembeding of
tissues using freezing temperature embedding wells. J
Histotechnol 26:11–19
 Peters S (2003b) The art of embedding tissues for Frozen
section. Part II – Frozen block cryoem- bedding. J Histotechnol
26:23–28
 Peters S, Fitzgerald S, Green K, Nunnciato T (2003) Paper
cryoembedding. J Histotechnol 26:173–178
 S.R. Peters (ed.), A Practical Guide to Frozen Section Technique

65

33