Booklet JUKNIS Biakan OK

Petunjuk Teknis
Pemeriksaan Biakan, Identifikasi, Dan

Uji Kepekaan Mycobacterium
tuberculosis pada Media Padat
KEMENTERIAN KESEHATAN RI
DIREKTORAT JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN
DIREKTORAT JENDERAL PENGENDALIAN PENYAKIT DAN
PENYEHATAN LINGKUNGAN
ii Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium
tuberculosis dengan Media Padat
2012
KATA PENGANTAR
Kekebalan Mycobacterium tuberculosis terhadap Obat Anti TB merupakan
permasalahan yang harus segera ditanggulangi di Indonesia. Laporan global ke-3
tentang surveilans resistensi OAT menunjukkan beberapa daerah di dunia menghadapi
endemi dan epidemi TB-MDR, dan di beberapa wilayah terdapat angka resistensi yang
sangat tinggi. Saat ini menurut WHO Indonesia menduduki peringkat ke delapan dari 27
negara dengan jumlah kasus MDR tertinggi.
Peran laboratorium dalam menegakkan mendiagnosis dan melakukan follow

up dengan pemeriksaan sensitifitas OAT lini pertama dan kedua sangat diperlukan,
sehingga laboratorium harus meningkatkan kemampuan pemeriksaan biakan dan DST.
Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis
pada media padat.
Pemeriksaan biakan, identifikasi dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis

terhadap OAT disusun untuk menjadi acuan laboratorium pemeriksa TB agar terjamin
mutunya, disamping untuk memudahkan perencanaan, pelaksanaan, pengawasan dan
pengembangan laboratorium.
Kami mengucapkan terima kasih kepada Kelompok Kerja Laboratorium TB dan

semua pihak yang telah bekerja sama untuk menyusun Pedoman Pemeriksaan Biakan
dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dari saluran pernapasan.
Harapan kami semoga petunjuk teknis ini bermanfaat bagi semua

laboratorium khususnya laboratorium pemeriksa biakan dan uji kepekaan M.TB dalam
menjamin mutu pemeriksaannya.
Katalog Dalam Terbitan. Kementerian Kesehatan RI
616.995 1
Ind Indonesia. Kementerian Kesehatan RI. Direktorat Jakarta, Desember 2011
p Jenderal Bina Upaya Kesehatan
Petunjuk teknis pemeriksaan biakan, indentifikasi, Direktur Jenderal Bina Upaya Kesehatan
dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis
pada media padat,-- Jakarta : Kementerian
Kesehatan RI. 20121
ISBN 978-602-235-144-3
1. Judul I. TUBERCULOSIS - DIAGNOSIS dr. Supriyantoro, SpP, MARS

II. TUBERCULOSIS - LABORATORY MANUALS
III. MICROSCOPY - LABORATORY MANUALS
IV. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium

i
KATA SAMBUTAN
Manajemen Terpadu Pengendalian TB Resisten Obat bertujuan untuk menemukan

sebanyak mungkin pasien TB MDR sehingga dapat pemutus rantai penularan pasien TB
MDR. WHO memperkirakan terdapat 440.000 kasus TB MDR pada tahun 2008 dengan
Bina Upaya Kesehatan tentang petunjuk teknis pemeriksaan angka kematian sekitar 150.000. Di Indonesia, diperkirakan terdapat 6.100 pasien TB
biakan, identifikasi dan uji kepekaan M.tuberculosis pada media MDR setiap tahunnya. Sesuai dengan data survei resistensi OAT yang dilaksanakan
padat; di Jawa Tengah, diperoleh data resistensi sebesar 1,9% untuk kasus baru dan 17,1%
untuk kasus dengan pengobatan ulang.
Mengingat : 1. Undang-Undang Nomor 29 Tahun 2004 tentang Praktik
Kedokteran (Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2004 Laboratorium TB merupakan unit terdepan dalam diagnosis dan evaluasi
Nomor 116, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia penatalaksanaan pasien TB MDR. Diagnosis pasien TB MDR dilakukan melalui
Nomor 4431); pemeriksaan biakan dan uji kepekaan kuman Mycobacterium tuberculosis. Laboratorium
yang melaksanakan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan harus mengikuti standar
2. Undang-Undang Nomor 36 Tahun 2009 tentang Kesehatan
internasional dan terpantau mutunya.
(Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2009 Nomor 144,
Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 5063); Saat ini terdapat banyak metode pemeriksaan biakan, identifikasi, dan uji kepekaan
Mycobacterium tuberculosis dengan keunggulan dan kelemahan masing-masing.
3. Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 411/Menkes/Per/III/ 2010
Pemeriksaan laboratorium yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian yang besar
tentang Laboratorium Klinik;
bagi pasien, keluarga, masyarakat, dan pemerintah.
4. Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 1144/Menkes/Per/ XI/2010
Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Identifikasi dan Uji Kepekaan
tentang Organisasi dan Tata Kerja Kementerian Kesehatan RI;
Mycobacterium tuberculosis dengan media padat ini disusun untuk memberikan panduan
5. Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 1647/Menkes/SK/ XII/2005 bagi laboratorium agar dapat melaksanakan pemeriksaan biakan, identifikasi dan uji
tentang Pedoman Jejaring Pelayanan Laboratorium Kesehatan; kepekaan Mycobacterium tuberculosis lini pertama sesuai standar.
6. Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 364/Menkes/SK/V/ 2009 Kami mengucapkan terima kasih kepada Kelompok Kerja Laboratorium TB dan
tentang Pedoman Penanggulangan Tuberkulosis; semua pihak yang telah bekerja sama untuk menyusun petunjuk teknis ini. Semoga
buku ini bermanfaat bagi semua laboratorium khususnya laboratorium yang melakukan
7. Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 831/Menkes/SK/IX/ 2009
pemeriksaan biakan dan uji kepekaan TB dalam menjamin mutu pemeriksaannya.
tentang Standar Reagen Ziehl Neelsen;
Jakarta, Agustus 2012
8. Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 835/Menkes/SK/IX/ 2009
Direktur Jenderal PP dan PL
tentang Pedoman Keselamatan dan Keamanan Laboratorium
Mikrobiologik dan Imunologik.
Prof Dr. Tjandra Yoga Aditama

NIP. 195509031980121001
vi Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium
iii
tuberculosis dengan Media Padat tuberculosis dengan Media Padat
TIM PENYUSUN
Prof. Dr. Agus Sjahrurachman, Sp.MK, PhD - Dept. Mikrobiologi FKUI

KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN
Dra. Ning Rintiswati, MSc - Bag. Mikrobiologi FK UGM
KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA
Dr. Tintin Gartinah, Sp.PK - BLK Provinsi Jabar NOMOR : HK.02.04/V/1808/2012
.
Drs. Isak Solihin - BLK Provinsi Jabar TENTANG
Dr. Endang Woro, Sp.PK - RS Persahabatan

PETUNJUK TEKNIS PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN
Dr. Renaldi Panjaitan, Sp.MK - RS Persahabatan UJI KEPEKAAN MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PADA MEDIA PADAT
Dr. Endriyana Soerjat, Sp.PK - BBLK Surabaya DENGAN RAHMAT TUHAN YANG MAHA ESA
DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN,
Dr. Koesprijanti, Sp.PK - BBLK Surabaya
Menimbang : a. bahwa penyakit Tuberkulosis merupakan penyakit menular
Dr. I Wayan Diantika - Subdit TB, Dit. P2ML yang masih menjadi masalah kesehatan masyarakat dan salah
satu penyebab kematian sehingga perlu dilaksanakan program
Dr. Irfan Ediyanto - Subdit TB, Dit. P2ML
pengendalian secara berkesinambungan;
Dr. Retno Kusuma Dewi - Subdit TB, Dit. P2ML
b. bahwa pelayanan laboratorium Tuberkulosis merupakan
Dr. Sri Widyastuti - Subdit MI, Dit. BPPM komponen kunci pengendalian Tuberkulosis yang
diselenggarakan oleh berbagai jenis laboratorium pada berbagai
Dr. A.W. Praptiwi - Subdit MI, Dit. BPPM tingkat pelayanan laboratorium;
Dr. Wiwi Ambarwati - Subdit MI, Dit. BPPM c. bahwa peran laboratorium dalam menegakkan diagnosis dan
melakukan follow up dengan pemeriksaan OAT lini pertama dan
Agus Susanto, SKM - Subdit MI, Dit. BPPM kedua sangat diperlukan;
Dr. Harini Janiar, Sp.PK - KNCV d. bahwa untuk menjamin mutu pelayanan laboratorium dalam
pemeriksaan biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tb perlu
Roni Candra, S.Si, M.Biomed - KNCV
adanya acuan yang bisa segera digunakan bagi petugas teknis
laboratorium dalam melakukan pemeriksaan;
e. bahwa berdasarkan pertimbangan sebagaimana dimaksud pada

huruf a, b, c dan d perlu ditetapkan Keputusan Direktur Jenderal
iv Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium
v
VI. ALUR KERJA BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN
Mycobacterium tuberculosis ..............................................................................43
VII. PRAKTEK LABORATORIUM .............................................................................51
A. Pengambilan, Pengiriman dan Penerimaan Spesimen .................................51
B. Pembuatan Media Lowenstein-Jensen...........................................................54
MEMUTUSKAN :
C. Biakan Mycobacterium tuberculosis ..............................................................57
Menetapkan :
D. Pembacaan Hasil Biakan .................................................................................62
Kesatu : KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN
E. Subkultur Isolat Mycobacterium tuberculosis ..............................................63 TENTANG PETUNJUK TEKNIS PEMERIKSAAN BIAKAN,
F. Identifikasi Mycobacterium tuberculosis .......................................................69 IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN MYCOBACTERIUM
G. Pembuatan Media untuk Uji PNB dan Resistensi .........................................75 TUBERKULOSIS PADA MEDIA PADAT.
Kedua : Petunjuk Pelaksanaan sebagaimana dimaksud dalam Diktum
H. Pembuatan Suspensi Kuman untuk Uji Kepekaan........................................79
Kesatu sebagaimana terlampir dalam Lampiran Keputusan ini.
I. Uji Resistensi Mycobacterium tuberculosis Cara Proporsi ..........................81 Ketiga : Petunjuk Pelaksanaan sebagaimana dimaksud dalam Diktum Kedua
J. Interpretasi Hasil Uji Kepekaan .......................................................................84 agar digunakan sebagai acuan bagi petugas teknis laboratorium
K. Preservasi Kuman pada Suhu -70oC..............................................................87 yang terkait dalam melakukan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan
Mycobacterium tuberculosis.
L. Resusitasi Mycobacterium tuberculosis dari -70oC .....................................89
Keempat : Pembinaan dan pengawasan pelaksanaan Keputusan ini dilakukan
M. Pengiriman Isolat ke Laboratorium Rujukan .................................................89 oleh Direktur Jenderal Bina Upaya Kesehatan, Direktur Jendaral
N. Pengelolaan Limbah.........................................................................................90 Pengendalian Penyakit dan Penyehatan Lingkungan, Dinas
VIII. PEMANTAPAN MUTU BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN .....................................93 Kesehatan Provinsi dan Dinas Kesehatan Kabupaten/ Kota sesuai
tugas dan fungsinya masing-masing.
A. Tujuan Pemantapan Mutu ................................................................................93
Kelima : Keputusan ini mulai berlaku pada tanggal ditetapkan.
B. Komponen Pemantapan Mutu Laboratorium Tuberkulosis .........................93
IX. PENCATATAN DAN PELAPORAN .....................................................................103
Ditetapkan di : Jakarta
Pada tanggal : 27 September 2012
DIRJEN BINA UPAYA KESEHATAN;
SUPRIYANTORO
x Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium
vii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR .......................................................................................................i

KATA SAMBUTAN .......................................................................................................iii
TIM PENYUSUN ..........................................................................................................iv
KEPUTUSAN DIRJEN BINA UPAYA KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN
REPUBLIK INDONESIA NOMOR : HK.02.04/V/1808/2012 ......................................v
DAFTAR ISI .................................................................................................................ix
DAFTAR TABEL ..........................................................................................................xi
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................xii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................xiii
DAFTAR SINGKATAN ...............................................................................................xiv
I. PENDAHULUAN .......................................................................................................1
A. Latar Belakang ....................................................................................................1
B. Tujuan Petunjuk Teknis ......................................................................................4
II. MANFAAT PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN
PADA PROGRAM PENGENDALIAN TB .................................................................5
A. Biakan Mycobacterium tuberculosis ................................................................7
B. Uji kepekaan ( Drug Susceptibility Test/ DST) .................................................9
III. KARAKTERISTIK MYCOBACTERIA .................................................................... 11
IV. SUMBER DAYA LABORATORIUM .......................................................................15
A. Ruang laboratorium .........................................................................................15
B. Peralatan dan penjaminan kinerja alat, termasuk kalibrasi .........................23
V. KEAMANAN KERJA UNTUK BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN ............................29
A. Desain Laboratorium........................................................................................29
B. Pedoman Umum Keamanan Laboratorium ....................................................29
C. Pedoman Khusus .............................................................................................32
D. Penanganan Limbah. .......................................................................................38
E. Penanganan Tumpahan Infeksius ...................................................................39
viii Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium
ix
DAFTAR SINGKATAN DAFTAR TABEL
AKMS : Advokasi, Komunikasi, Mobilisasi Sosial

Tabel 1 Jumlah BTA apusan, konsentrasi basil dalam spesimen dahak, dan
Am : Amikasin
APD : Alat Pelindung Diri kemungkinan mendapatkan hasil positif................................................
5
BSC : Biological Safety Container
Tabel 2 Mycobacteria yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia.......... 13
BTA : Bakteri Tahan Asam
CPC : Cetyl Piridium Chloride Tabel 3 Kisi-kisi hubungan antar ruang di laboratorium dan laboratorium My-
DOTS : Directly Observed Treatment Shortcourse cobacterium tuberculosis………………..….......................................
18
DST : Drug Susceptibility Test
E : Ethambutol Tabel 4 Peralatan laboratorium biakan dan uji kepekaan dengan media padat
EQA : External Quality Assurance untuk beban kerja 6000 uji/tahun ……………………………...................
24
Fasyankes : Fasilitas Pelayanan Kesehatan
Gerdunas TB : Gerakan Terpadu Nasional TB Tabel 5 Alat pendukung (beban kerja 6000 uji/tahun) ………………………....... 25
HEPA : High Efficiency Particulate Air Tabel 6 Bahan habis pakai untuk Biakan dan uji kepekaan Mycobacterium
HIV : Human Immunodeficiency Virus tuberculosis ………………………………………….................................
ISTC : International Standar for TB Care 27
INH (H) : Isoniazid Tabel 7 Diferensiasi diantara Mycobacterium tuberculosis complex .................. 45
Km : Kanamisin Tabel 8 Pendugaan Spesies Mycobacteria ……………………………………..... 46
LJ : Lowenstein Jensen Tabel 9 Pembuatan larutan sesuai dengan kebutuhan ……………………........ 60
MDR : Multiple Drugs Resistance
MGIT : Mycobacteria Growth Indicator Tube
MODS : Mycroscopic Observation of Drug Susceptibility
MOTT : Mycobacterium Other Than Tuberculosis
NASBA : Nucleic Acid Sequence Based Amplification
NRA : Nitrate Reduction Assay
NTM : Non Tuberculosis Mycobacteria
OAT : Obat Anti Tuberkulosis
PCR : Polymerase Chain Reaction
PME : Pemantapan Mutu Eksternal
PMI : Pemantapan Mutu Internal
PMO : Pengawas Menelan Obat
PNB : Para Nitro Benzoic Acid
PPE : Personal Protective Equipment
R : Rifampisin
RAN : Rencana Aksi Nasional
S : Streptomisin
SDA PCR : Strand Displacement Amplification
TB : Tuberkulosis
WHO : World Health Organization
XDR : Extremely Drugs Resistance
Z : Pyrazinamid
xiv Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium
xi
DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN
Gambar 1 Contoh denah laboratorium sederhana untuk biakan dan uji Lampiran 1 Log Book Pembacaan Uji Kepekaan ………………………. 104
kepekaan Mycobacterium tuberculosis ( WHO 1998).. Lampiran 2 Format Pembacaan Hasil Uji Resistensi ........................... 105
16
Lampiran 3 Form TB.05 MDR (Permohonan Lab TB MDR) ................. 106
Gambar 2 Contoh lay out laboratorium pemeriksaan Mycobacterium tu-
Lampiran 4 Form TB 04 MDR (Register Laboratorium TB MDR) ......... 107
berculosis dengan fasilitas biomolekuler…..……….…..
20 Lampiran 5 Form TB.06 MDR (Register Suspek TB MDR) .................. 108
Gambar 3 Tanda baku biohazard international ……………………… 30 Lampiran 6 Rekapitulasi hasil biakan ................................................... 109
Gambar 4 Skema wadah spesimen rujukan …………………………. 34 Lampiran 7 Rekapitulasi hasil uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis ..... 110
Gambar 5 Skema aliran udara pada BSC Kelas II …………………. 36 Lampiran 8 Tabel Pemeliharaan dan Kalibrasi Alat ...................................... 111
Gambar 6 Alur Biakan dan Identifikasi Mycobacterium tuberculosis 43 Lampiran 9 Formulir Pemantapan Mutu Internal .......................................... 113
Gambar 7 Alur Kerja Identifikasi Rutin ………………………………… 47
Gambar 8 Alur Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis …………. 48
xii Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium
xiii
pemeriksaan biakan dan uji kepekaan; pengelolaan pasien TB MDR menggunakan LAMPIRAN
KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN
strategi pengobatan yang tepat dengan OAT lini kedua; jaminan ketersediaan OAT lini NOMOR : HK.02.04/V/1808/2012
TANGGAL : 27 SEPTEMBER 2012
kedua yang berkualitas dan tidak terputus serta pencatatan pelaporan secara baku.
I. PENDAHULUAN
Diagnosis yang akurat dan tepat waktu merupakan tulang punggung program TB.
Resistensi OAT harus didiagnosis secara tepat sebelum dapat diobati secara efektif. A. Latar Belakang
penemuan kasus TB MDR dilakukan dengan pemeriksaan apusan dahak mikroskopis,

Tuberkulosis (TB) adalah suatu penyakit infeksi yang menular, disebabkan oleh
biakan dan uji kepekaan di laboratorium yang terjaga mutunya. Selain itu, dengan
kuman Mycobacterium tuberculosis. Penularan langsung terjadi melalui aerosol yang
meningkatnya kasus HIV/AIDS, diagnosis TB secara mikroskopik tidak memadai. Hal ini
mengandung kuman TB. Penyakit ini dapat menyerang semua kelompok umur dan
memerlukan upaya pengembangan kemampuan laboratorium yang mampu melakukan
semua organ tubuh manusia, terutama paru. Gejala umum TB paru pada orang dewasa
biakan, identifikasi, dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT atau
adalah batuk yang terus-menerus dan berdahak, selama 2 - 3 minggu atau lebih. Bila
Drug Sensitivity Test (DST).
tidak diobati maka setelah lima tahun sebagian besar (50%) pasien akan meninggal.
Uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap obat bermanfaat bagi klinisi dalam
mengarahkan jenis obat yang akan diberikan kepada penderita. Ini sangat penting Sejak tahun 1995 Indonesia mulai menerapkan strategi DOTS (Directly Observed
karena pemberian OAT yang tidak tepat, tidak hanya akan menyebabkan kegagalan Treatment Shortcourse) untuk digunakan sebagai satu-satunya strategi pengendalian
pengobatan, tetapi juga menyebabkan penularan terus berlangsung dan mempercepat TB di Indonesia, yang dimulai pelaksanaannya di Puskesmas sebagai ujung tombak
kejadian dan penyebaran TB MDR dan XDR. pelayanan kesehatan di Indonesia.
Saat ini terdapat banyak metode pemeriksaan biakan, identifikasi, dan uji kepekaan
Strategi DOTS telah dibuktikan dengan berbagai uji coba lapangan dapat memberikan
Mycobacterium tuberculosis dengan keunggulan dan kelemahan masing-masing.
angka kesembuhan yang tinggi. Strategi DOTS merupakan strategi kesehatan yang
Namun hasil uji kepekaan dengan cara yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian
paling cost effective. Satu studi cost benefit yang dilakukan oleh WHO di Indonesia
yang besar bagi pasien, keluarganya, masyarakat, dan pemerintah. Oleh karena itu
menggambarkan bahwa setiap satu dolar Amerika yang digunakan untuk membiayai
perlu disusun Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Identifikasi dan Uji Kepekaan
program penanggulangan TB, akan menghemat sebesar 55 dolar Amerika selama 20
Mycobacterium tuberculosis yang meliputi : sumber daya manusia, fasilitas laboratorium,
bahan habis pakai, metode pemeriksaan, pemantapan mutu serta pencatatan dan tahun. Agar berhasil baik, diperlukan implementasi dari lima komponen strategi DOTS,
pelaporan. yaitu :
B. Tujuan Petunjuk Teknis 1. Komitmen politis dari para pengambil keputusan, termasuk dukungan dana.
2. Diagnosis TB dengan pemeriksaan dahak secara mikroskopik.
1. Pemeriksaan biakan, identifikasi dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis
3. Kesinambungan persediaan OAT jangka pendek.
terhadap OAT terjamin mutunya.
4. Pengobatan dengan paduan Obat Anti Tuberkulosis (OAT) jangka pendek dengan
2. Memudahkan perencanaan, pelaksanaan, pengawasan dan pengembangan
laboratorium pengawasan langsung oleh Pengawas Menelan Obat (PMO).
3. Memudahkan pengembangan program baru berbasis data yang akurat. 5. Pencatatan dan pelaporan secara baku untuk memudahkan pemantauan dan
evaluasi program TB.
4 Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium
1 1
Untuk menjamin keberhasilan penanggulangan TB kelima komponen tersebut di atas HDL). Titik berat manajemen program meliputi: perencanaan, pelaksanaan,
harus dilaksanakan secara bersamaan. monitoring dan evaluasi serta menjamin ketersediaan sumber daya (dana, tenaga,
sarana dan prasarana)
Kebijakan DOTS di Indonesia :
2. Penanggulangan TB MDR dilaksanakan dengan menggunakan strategi DOTS
1. Penanggulangan TB di Indonesia dilaksanakan sesuai dengan asas desentralisasi
dimana setiap komponen yang ada lebih ditekankan kepada penata laksanaan TB
dengan Kabupaten/Kota sebagai titik berat program yang meliputi: perencanaan,
MDR dan disebut sebagai PMDT (Programmatic Management of Drug Resistant
pelaksanaan, monitoring dan evaluasi, serta menjamin ketersediaan sumber daya
TB).
(dana, tenaga, sarana dan prasarana).
2. Upaya penanggulangan dilaksanakan secara terintegrasi di Fasilitas Pelayanan 3. Penguatan kebijakan untuk meningkatkan komitmen para pelaksana terhadap
Kesehatan (Fasyankes) berdasar kemitraan, dengan menggunakan strategi DOTS, program penanggulangan TB MDR
peningkatan mutu pelayanan, Obat Anti TB (OAT) diberikan secara cuma-cuma, 4. Penguatan PMDT dan pengembangannya ditujukan terhadap peningkatan mutu
serta mempertahankan dan meningkatkan mutu pelayanan laboratorium TB. pelayanan, kemudahan akses untuk penemuan dan pengobatan sehingga mampu
3. Kebijakan lain untuk mendukung keberhasilan Program Pengendalian TB (P2TB) memutuskan rantai penularan dan mencegah terjadinya TB XDR.
adalah mempertahankan dan meningkatkan komitmen daerah, advokasi, komunikasi 5. Tatalaksana penanggulangan TB MDR mengacu kepada strategi DOTS dan ISTC.
dan mobilisasi sosial (AKMS) terhadap sektor terkait, dalam wujud Gerakan Terpadu 6. Pengembangan wilayah disesuaikan dengan rencana pengembangan PMDT yang
Nasional Penanggulangan TB (Gerdunas TB). ada dalam Stranas TB dan RAN PMDT, secara bertahap sehingga seluruh wilayah
4. Diagnosis kasus terutama didasarkan atas pemeriksaan mikroskopik BTA, kecuali Indonesia dapat mempunyai akses terhadap pelayanan TB MDR yang bermutu.
untuk kasus pada anak. 7. Titik berat pelayanan pasien TB MDR adalah pada fasyankes rujukan dan jejaringnya.
5. DOTS mengasumsikan bahwa semua Mycobacterium tuberculosis yang menjadi 8. Pembiayaan penatalaksanaan pasien TB MDR menjadi tanggung jawab Pemerintah
penyebab masih peka terhadap semua OAT lini primer.
pusat dan daerah, melalui mekanisme yang ada.
Tingginya angka default serta penggunaan obat-obat TB lini pertama dan kedua yang 9. Laboratorium TB merupakan unit yang terdepan dalam diagnosis dan evaluasi
tidak rasional khususnya oleh rumah sakit dan sektor swasta serta kecenderungan penata laksanaan pasien TB MDR sehingga kemampuan dan mutu laboratorium
peningkatan kasus HIV memberikan tantangan ke depan yang besar dalam masalah harus sesuai standar internasional dan selalu dipertahankan kualitasnya untuk
TB-MDR. Dewasa ini kasus TB-MDR dan bahkan TB-XDR telah ditemukan di Indonesia. biakan dan uji kepekaan M. Tuberculosis. Diagnosis TB MDR harus berdasarkan
Menurut perkiraan WHO secara nasional angka MDR sekitar 2-3% untuk kasus baru. Dari hasil pemeriksaan uji kepekaan, tidak boleh berdasarkan klinis saja
data survei resistensi OAT yang dilaksanakan di Jawa Tengah, diperoleh data resistensi
10. Pemerintah menyediakan OAT TB MDR yang berkualitas untuk pasien TB MDR.
sebesar 1,9% untuk kasus baru dan 17,1% untuk kasus dengan pengobatan ulang.
11. Mempersiapkan sumber daya manusia yang kompeten dalam jumlah yang memadai
Penatalaksanaan kasus TB MDR (Manajemen Terpadu Pengendalian TB Resisten Obat)
untuk meningkatkan dan mempertahankan kinerja program.
dimulai dengan suatu uji pendahuluan di 2 wilayah pada tahun 2009, yang saat ini telah
12. Meningkatkan dukungan masyarakat bagi pasien TB dan keluarga.
menjadi bagian dari Program Nasional TB dengan mengambil kebijakan sebagai berikut:
13. Memberikan kontribusi terhadap komitmen global.
1. Penanggulangan TB MDR di Indonesia dilaksanakan sesuai tatalaksana
penanggulangan TB yang berlaku saat ini dengan mengutamakan tata hubungan Strategi penerapan Manajemen Terpadu TB Resisten Obat membutuhkan komitmen yang
sarana kesehatan rujukan dan sarana kesehatan dasar (Hospital DOTS Linkage/ berkesinambungan dari semua pihak; penemuan pasien TB MDR yang rasional melalui
3
Dengan meningkatnya kasus-kasus HIV/AIDS maka masalah NTM juga meningkat. II. MANFAAT PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN
Diagnosis NTM pada kasus HIV/AIDS secara mikroskopis mempunyai sensitivitas PADA PROGRAM PENGENDALIAN TB
yang rendah, karena itu diperlukan pemeriksaan biakan. Pemeriksaan biakan dapat
Pengunjung poliklinik dengan gejala saluran pernafasan merupakan kelompok prioritas
meningkatkan sensitivitas untuk diagnosis dan sekaligus membedakan Mycobacterium
penemuan pasien, karena pasien BTA (+) yang merupakan sumber penularan, terdapat
tuberculosis dan NTM.
pada kelompok tersebut. Saat ini pasien BTA positif adalah kelompok terbesar pasien
Ada peningkatan kepekaan untuk mendeteksi BTA dengan biakan, secara mikroskopis TB yang ditemukan dan dilaporkan di negara berkembang.
untuk mendapatkan 50% kesempatan BTA positif diperlukan kuman BTA dalam dahak
5000 kuman per ml jika diperiksa 300 Lapang Pandang, sementara dengan teknik biakan Dalam buku Pedoman Nasional Pengendalian TB pada tahun 2011 yang diterbitkan
yang baik hasil positif dapat terjadi walau kuman hidup berkisar antara 10-100 kuman Kementerian Kesehatan, diagnosis TB paru dilakukan dengan pemeriksaan 3 spesimen
per ml. Pada umumnya biakan dahak akan meningkatkan penemuan kasus sekitar 20– dahak, salah satu di antaranya adalah dahak pagi hari, yang lain adalah dahak sewaktu
30 % dari jumlah keseluruhan TB Paru BTA positif. Oleh sebab itu pemeriksaan biakan yang diambil saat pasien datang ke Fasyankes. Dahak pagi biasanya lebih sering
sangat bermanfaat untuk kasus pausibasiler (kasus dengan jumlah kuman sedikit) memberikan hasil BTA positif dibanding dengan dahak sewaktu.
seperti pada TB ekstra paru, TB anak dan TB pada kondisi penekanan sistem imun. Pemeriksaan dahak secara mikroskopis adalah metode pemeriksaan yang paling
Biakan dahak merupakan suatu metode pemeriksaan yang kompleks, membutuhkan sederhana, cepat, terpercaya dan paling murah untuk diagnosis pasien TB. Sekitar
sarana, prasarana dan peralatan yang lebih mahal serta sumber daya manusia dengan 70 – 80 % TB Paru BTA positif dapat terdeteksi, bila penemuan tersangka TB dilaksanakan
keterampilan khusus. sesuai pedoman yang telah dikeluarkan oleh Kementerian Kesehatan. Pada negara yang
Indikasi utama pemeriksaan biakan dan uji kepekaan adalah sebagai berikut : kasus Non Tuberculosis Mycobacterium (NTM) masih rendah, spesifisitas pemeriksaan
Sesuai kriteria suspek TB MDR berkisar 99%.

1. Pasien TB pengobatan kategori 2 yang gagal (Kasus kronik) Uraian lebih lengkap dapat dilihat pada tabel 1.
2. Pasien TB pengobatan kategori 2 yang tidak konversi
3. Pasien TB yang pernah diobati pengobatan TB Non DOTS Tabel 1. Jumlah BTA dalam sediaan apus, konsentrasi basil dalam dahak, dan ke-
4. Pasien TB gagal pengobatan kategori 1 mungkinan mendapatkan hasil positif.
5. Pasien TB pengobatan kategori 1 yang tidak konversi setelah pemberian Jumlah basil ditemukan Perkiraan konsentrasi Kemungkinan
sisipan. secara mikroskopik (ZN) basil/ ml,dlm spesimen hasil positif
6. Pasien TB kambuh 0 dlm ≥ 100 l.p Kurang dari 1.000 Kurang dari 10 %
7. Pasien TB yang kembali setelah lalai/default 1-2/ 300 l.p 5.000 – 10.000 50 %
8. Suspek TB yang kontak erat dengan pasien TB-MDR 1-9/ 100 l.p ~ 30.000 80 %
9. ODHA dengan gejala TB/ koinfeksi TB. 1-9/ 10 l.p IUATLD ~ 50.000 90 %
1-9/ l.p ~ 100.000 96,2 %
Evaluasi pengobatan MDR/ XDR ≥ 10/ l.p 500.000 99.95 %
5
Pada tahun 2011 angka keberhasilan pengobatan yang dicapai oleh program DOTS 2. Kesalahan yang biasa terjadi pada pengelolaan pengobatan TB adalah :
untuk Indonesia adalah 86.7% dengan angka kesembuhan adalah 80.4% (Data : Manajemen kasus yang buruk (pengobatan tidak dengan pengawasan penuh
Laporan situasi terkini perkembangan Tuberkulosis di Indonesia, Januari-Desember =DOT/ Directly Observed Treatment, terutama pada tahap intensif).
2011). Sedangkan kesimpulan National TB Program Managers Meeting European Pasien kesulitan mendapatkan semua OAT yang diperlukan secara adekuat.
Region tahun 2000 menyatakan bahwa untuk meminimalisasi kejadian MDR (Multiple 3. Pengetahuan pasien kurang karena informasi kurang atau penjelasan yang tidak
Drug Resistant) diperlukan angka kesembuhan minimal 95%. Oleh karena itu pendataan adekuat sebelum mulai pengobatan.
tentang prevalensi TB MDR dan TB XDR harus dilaksanakan secara berkesinambungan.
Pengobatan kasus TB MDR sangat sulit, selain biayanya sangat mahal, efek samping
Multiple Drug Resistance obat lebih besar juga angka kesembuhannya lebih rendah dibandingkan dengan hasil
pengobatan kasus bukan TB MDR. Karena itu strategi terbaik untuk mengendalikan TB
TB MDR (Multiple Drug Resistance) adalah suatu keadaan dimana Mycobacterium
MDR adalah mencegah kejadian TB MDR dengan melaksanakan pengobatan kasus
tuberculosis telah resisten terhadap INH dan Rifampisin saja atau resisten terhadap
bukan TB MDR sebaik-baiknya dan melaksanakan program pengendalian TB MDR
INH dan Rifampisin serta OAT lini pertama lainnya.
sesuai pedoman. Agar terlaksana dengan baik, diperlukan komitmen semua pihak dan
Fenomena amplifikasi dan penyebaran kasus resistensi TB atau TB MDR seluruhnya mobilisasi sumber daya. Perlu diingat bahwa dalam 1 tahun satu kasus TB MDR dapat
adalah akibat perbuatan manusia. Telah dibuktikan bahwa kejadian resistensi menularkan pada 6 orang lain.
Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT adalah akibat mutasi alami. Amplifikasi
Extremely Drug Resistant
Mycobacterium tuberculosis yang resisten selanjutnya terjadi akibat kesalahan manusia,
seperti tersebut di bawah ini : TB XDR merupakan TB MDR disertai resistensi terhadap salah satu obat golongan
fluorokuinolon dan salah satu dari OAT injeksi lini kedua (kapreomisin, kanamisin
1. Kesalahan pengelolaan OAT.
dan amikasin) Hasil berbagai kajian di luar negeri memperlihatkan bahwa terdapat
2. Kesalahan manajemen kasus TB.
kecenderungan peningkatan insidensi TB MDR dan TB XDR. TB XDR juga sudah
3. Kesalahan proses penyampaian OAT kepada pasien.
dikonfirmasi keberadaannya di Indonesia. Jalan untuk menghambat laju kenaikan
4. Kesalahan hasil uji DST
masalah TB XDR dimulai dengan keharusan menjalankan program DOTS sebaik-
5. Pemakaian OAT dengan mutu rendah
baiknya dan tidak dengan mudah menjalankan pengobatan dengan OAT lini kedua. Jika
Kesalahan medis yang biasa terjadi yang menyebabkan resistensi basil, adalah : akan melakukan pengobatan dengan OAT lini kedua, hendaknya konsisten mengacu
pada pedoman yang telah terbukti validitasnya.
1. Pemberian pengobatan yang tidak adekuat, baik dosis, kombinasi OAT maupun
lama pengobatan. Misalnya A. Biakan Mycobacterium tuberculosis
hanya 2-3 OAT pada tahap intensif untuk penderita BTA positif dengan kuman
Untuk mendiagnosis TB MDR dan TB XDR diperlukan pemeriksaan biakan, identifikasi
yang resisten primer terhadap INH
yang kemudian dilanjutkan dengan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap
hanya menambahkan satu jenis OAT pada kasus gagal
OAT.
terus menambahkan OAT lain, pada saat pasien kambuh setelah pengobatan
dengan obat tunggal.
7
Dari sudut pandang kecepatan tumbuh dan jenis pigmen, dua parameter yang mudah B. Uji kepekaan ( Drug Susceptibility Test/ DST)
diamati pada pemeriksaan biakan, Mycobacterium dapat secara sederhana dibagi atas :
Uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT berguna untuk mengarahkan
1. Photochromogen dengan pigmen koloni kuning . jenis obat yang akan diberikan kepada pasien. Ini sangat penting karena pemberian OAT
Kuman golongan ini koloninya akan berwarna jika inkubasi dilakukan dengan yang tidak tepat, tidak hanya akan menyebabkan kegagalan pengobatan, tetapi juga
pencahayaan. Termasuk dalam golongan ini adalah M. kansasii, M. marinum, M. menyebabkan penularan terus berlangsung dan mempercepat kejadian dan penyebaran
simiae, M. asiaticum. TB MDR dan TB XDR.
2. Non photochromogen ( tanpa pigmen pada koloni ). Banyak metode untuk melakukan uji kepekaan; menggunakan media padat atau
Termasuk dalam golongan ini adalah : M. tuberculosis complex, M. terrae complex, cair, metode radiometrik atau nir radioisotop, metode seluler atau molekuler. Semua
M. gastrii, M. malmoense, M. avium complex, M. haemophilum, M. xenopi. metode mempunyai keunggulan dan kelemahan. Karena itu apapun caranya, hasil
3. Scotochromogen ( dengan pigmen koloni jingga ) akan mempunyai arti jika cara yang dipakai telah terstandarisasi. Di antara cara yang
Kuman golongan ini koloninya akan berwarna jika inkubasi dilakukan dalam terstandarisasi adalah cara proporsi pada media LJ, cara radiometric dengan alat Bactec,
keadaan gelap. Termasuk dalam golongan ini adalah : M. szulgai, M. flavesens, cara end point inhibition pada media semi solid, cara “break point “ pada media cair
seperti MGIT, NRA ( Nitrate Reduction Assay), MODS, kalorimetrik. Hasil uji kepekaan
M.thermoresistible, M. gordonae, M. scrofulaceum, M. xenopi
dengan cara yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian yang besar bagi pasien,
4. Rapid grower.
keluarga, masyarakat, dan pemerintah.
Diantaranya adalah M. flavescens, M. thermoresistible, M. marinum, M. fortuitum-
chelonae complex. Kebanyakan kuman dari golongan ini tidak patogen bagi Pada saat ini Kementerian Kesehatan mengambil kebijakan untuk melakukan uji
manusia kepekaan menggunakan cara proporsi pada media LJ dan cara break point (MGIT)
dengan mempertimbangkan berbagai faktor termasuk ketersediaan sumber daya
Kuman yang tidak termasuk rapid grower mempunyai waktu pembelahan puluhan jam, laboratorium.
karena itu koloni yang diisolasi dari spesimen biasanya mulai tampak setelah 2 (dua)
Catatan :
minggu. Sementara koloni kuman yang termasuk rapid grower biasanya akan tampak
Uji diagnosis lain yang tersedia di pasaran sudah banyak. Diperlukan kehati-hatian yang
dalam waktu kurang atau sampai 1 (satu) minggu.
sangat tinggi agar uji tersebut tidak disalahgunakan untuk diagnosis. Banyak uji yang
belum terstandarisasi atau sangat selektif penggunaannya. Di antaranya adalah :
1. Uji serologi untuk mendeteksi/mengukur kadar antibodi terhadap komponen

mycobacteria. Pada tahun 2011, WHO mengeluarkan pernyataan bahwa uji serologis
yang tersedia tidak direkomendasikan untuk diagnosis paru dan ekstra paru
2. Uji serologi untuk mendeteksi antigen.

Sampai saat ini belum ada kit yang direkomedasikan oleh W.HO untuk diagnosis TB
paru dan ekstra paru.
9
3. Uji deteksi/pengukuran interferon gamma. III. KARAKTERISTIK MYCOBACTERIA
Uji ini dapat dilakukan dengan jalan mengukur kadar interferon gamma pada serum atau
plasma dan mengukur kadar interferon gamma yang dihasilkan oleh sel limfosit T yang Mycobacteria merupakan mikroba tahan asam, serupa dengan Rhodococcus dan
diisolasi dari pasien dan direaksikan dengan komponen M. tuberculosis. Sensitifitas Nocardia. Tingkat ketahanan Mycobacteria terhadap asam bervariasi. Mycobacteria ada
dan spesifisitas uji ini dalam menegakkan diagnosis TB paru dewasa juga masih lebih yang bersifat patogen dan ada juga yang tidak patogen. Mycobacteria tidak patogen
rendah dibandingkan dengan pemeriksaan BTA mikroskopis SPS. Sampai saat ini uji ditemukan di lingkungan manusia, khususnya dalam air. Mycobacteria lingkungan ini
deteksi interferon gama tak dapat membedakan antara sakit dan infeksi TB laten. merupakan kontaminasi yang harus diantisipasi agar tak mengacaukan hasil pemeriksaan
biakan dan uji kepekaan.
4. Amplifikasi asam nukleat M. tuberculosis dari spesimen.
Sudah banyak cara yang dikembangkan. Misalnya dengan cara reaksi rantai Termasuk dalam Mycobacteria yang secara medis penting adalah :
polimerasa konvensional (konventional PCR), realtime PCR, NASBA, SDA PCR, PCR
isothermal dan sebagainya. Untuk TB paru uji amplifikasi asam nukleat yang bukan 1. M. tuberculosis
“real time“ telah dibuktikan tidak lebih sensitif dibandingkan dengan pewarnaan BTA 2. M. bovis
tiga kali. Kelebihan cara amplifikasi asam nukleat adalah kemampuannya mendeteksi 3. M. africanum
beberapa species Mycobacteria lain dengan cepat.
4. M. microtii
Pada tahun 2012, WHO merekomendasikan LPA (Line Probe Assay) untuk penapisan
5. M. ulcerans
kasus TB MDR. Pada tahun 2011, WHO merekomedasikan penggunaan teknologi
PCR real time yaitu GenXpert yang lebih sensitif dibandingkan dengan pemeriksaan 6. M. leprae
mikroskopik. Namun baru digunakan untuk kasus TB pada HIV dan dugaan TB 7. M. kansasii
MDR. Apabila dibandingkan dengan GeneXpert, LPA lebih sukar pelaksanaannya, 8. M. marinum
tetapi memiliki kelebihan dibanding GeneXpert yaitu mampu mendeteksi kekebalan
9. M. simiae
terhadap obat lini kedua.
10. M. scrofulaceum
5. Pewarnaan BTA.
11. M. szulgai
Mycobacteria, Nocardia dan Rodococcus merupakan kuman tahan asam. Derajat
12. M. xenopi
ketahanannya tertinggi pada mycobacteria. Dengan demikian pewarnaan BTA dengan
cara Ziehl-Neelsen ataupun auramin juga akan mendeteksi spesies mycobacteria 13. M. gordonae
lain. Namun karena prevalensi infeksi oleh mycobacteria yang bukan Mycobacterium 14. M. flavescens
tuberculosis (MOTT/ NTM) saat ini sangat rendah, maka hasil positif lebih mengarah 15. M. fortuitum-chelonae complex
pada Mycobacterium tuberculosis. Yang perlu diwaspadai adalah BTA lingkungan
16. M. thermoresistible
yang banyak mencemari air.
17. M. avium-intracellulare complex
18. M. terra-triviale complex
Nomor 1 sampai 4 digolongkan sebagai M. tuberculosis complex.
11
dalam 30-45 menit. Resiko infeksi akan sangat dikurangi jika pengerjaan spesimen dan Tabel 2. Mycobacteria yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia
isolat dilakukan dalam Bio Safety Cabinet (BSC) dikerjakan sesuai dengan baku praktek
laboratorium minimal untuk baku praktek laboratorium dengan tingkat keamanan 3 Mycobacteria Habitat Organ yang umum
diserang
(tiga). Jika menggunakan exhaust fan, gunakan yang mempunyai kapasitas minimal
Mycobacterium tubercu-
23.6 liter per detik.
losis complex
Gambar 1: contoh denah laboratorium paling sederhana untuk biakan dan uji M. tuberculosis Manusia Semua organ
kepekaan Mycobacterium tuberculosis ( WHO 1998 ) M. bovis Manusia,ternak Usus dan jaringan lunak
M. canetti Hewan Kelenjar limfe
Photochromogen
M. kansasii Air,ternak Tulang
M. marinum Ikan,air Kulit dan jaringan lunak
Bronkopulmonal
M. simiae Primata Paru
M. asiaticum Primata
Scotochromogen
M. scrofulaceum Tanah,air,ternak,burung Kelenjar limfe
M. szulgai Tak jelas Bronkopulmonal
M. gordonae Air Paru
M. flavescens Air,tanah Paru
Keterangan: M. xenopi Air Bronkopulmonal
1. Biosafety Cabinet A :Ruang administrasi, penerimaan
Non photochromogen
2. Sentrifuse contoh uji
3. Deep freezer -70 0C B : Ruang kerja lab M. avium-intracellulare Tanah,air,ternak,burung Paru,kel limfe,sistemik
4. Wastafel C : Ruang Cuci dan sterilisasi M. ulcerans
5. Bak pewarnaan D : Ruang pembuatan media
Tidak jelas Kulit dan jaringan lunak
6. Timbangan analitik (nefelometer)
7. Mikroskop M. gastri Paru
8. Meja M. terrae Tanah,air Paru
9. Inkubator
Tanah,air
10. Meja
11. Meja cuci E : Exhause Rapid grower
12. Lemari Es (refrigerator) L : Loket penerima bahan M. fortuitum Tanah,air,hewan darat dan laut Kulit, jaringan lunak, sistemik
13. Analitikal Balans AC : Air Conditioner
M. abcessus Tanah,air,hewan darat dan laut Kulit, jaringan lunak, sistemik
14. Penangas air
15. Lemari Bakar M. chelonae Tanah,air,hewan darat dan laut Kulit, jaringan lunak, sistemik
16. Autoclave M. smegmatis Permukaaan lembab, flora Paru
17. Heat sterilisator
urogenital
18. Lemari Administrasi
19. Meja Administrasi M. leprae Manusia Kulit, jaringan lunak,sistemik
13
Dalam pedoman ini akan dijelaskan bagaimana melakukan biakan dan uji kepekaaan IV. SUMBER DAYA LABORATORIUM
untuk Mycobacterium tuberculosis complex. Walaupun demikian masih terdapat
pertanyaan-pertanyaan yang tidak dijelaskan dalam pedoman ini yaitu : Laboratorium TB yang melakukan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan harus memiliki
sumber daya laboratorium yang memungkinkan proses kegiatan praktik laboratorium
1) Bagaimana membedakan Mycobacterium tuberculosis dengan anggota
dapat berjalan lancar, berkualitas dan aman bagi pekerja serta lingkungan. Sumber
Mycobacterium tuberculosis complex lainnya?
Daya Manusia disusun berdasarkan kompetensi teknis/latar belakang pendidikan dan
2) Apakah galur isolat Mycobacterium tuberculosis satu sama lainnya sama? beban kerja
3) NTM mana yang perlu-tidak perlu dilaporkan? Penanggung Jawab : 1 orang Dokter Spesialis Mikrobiologi Klinik/ Patologi Klinik
Tenaga Teknis :
a. Mikroskopis : DIII Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TB

Beban kerja : 20 Sediaan/hari/teknisi
b. Media : D III Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TB
Jumlah tenaga disesuaikan dengan beban kerja
biakan dan uji kepekaan.
c. Biakan : D III Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TB
Beban kerja : 20 biakan/ hari/teknisi
d. Petugas pencatatan dan : 1 orang, minimal SLTA
pelaporan
e. Pekarya : Minimal SLTP, 1 (satu) orang
Tugas : pencucian alat dan sterilisasi
A. Ruang laboratorium
Ruang laboratorium harus menjamin keamanan petugas dan orang lain di sekitarnya
dari spesimen dan isolat yang ditangani. Infeksi oleh Mycobacterium tuberculosis
bersifat airborne melalui mikrodroplet, maka pengaturan aliran udara menjadi sangat
penting. Udara harus mengalir dari area bersih ke area kotor/ tercemar. Udara yang
dikeluarkan dari laboratorium ke lingkungan sebaiknya telah melalui filter bakteri dengan
arah menjauhi tempat berkumpul orang banyak, pemukiman dan lalu lalang.
Sirkulasi udara di laboratorium harus dilakukan melalui pertukaran udara minimal 6

(enam) sampai 12 (dua belas) kali per jam, dengan cara ini 99 % partikel akan dibuang
15
Gambar 2. Contoh lay out laboratorium pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis Gambaran aliran udara pada laboratorium di atas adalah sebagai berikut
dengan fasilitas biomolekuler
Keterangan Denah :
- Ruang A :
Pintu masuk ke laboratorium melalui ruang yang dapat dimanfaatkan untuk
administrasi, penyimpanan laporan, buku register, alat tulis dll. Di ruang ini terdapat
juga loket penerimaan dan penilaian spesimen secara makroskopik. Misalnya
tentang data spesimen, volume, tanggal dan cara pengambilan, kondisi wadah dan
sebagainya. Ruangan ini berfungsi sebagai ruang persiapan pekerja laboratorium,
menggunakan Alat Pelindung Diri (APD).
- Ruang B :
Ruang ini adalah tempat melakukan pemeriksaan, terdapat fasilitas pengolahan
dan inokulasi contoh uji/spesimen. Sebaiknya tempat cuci tangan di ruang ini
menggunakan kran yang dapat dibuka dengan siku atau kaki atau sensor outlet.
Pada bagian terkotor ditempatkan BSC dan sentrifus.
Pada bagian lain di ruang ini disediakan meja kerja untuk pemeriksaan mikroskopis,
pengamatan dan pencatatan hasil biakan.
- Ruang C :
Di ruang ini dilakukan sterilisasi, pencucian alat dan pembuangan limbah sementara.
APD dilepaskan dan disterilisasi di ruang ini.
17
- Ruang D Untuk mengetahui hubungan antar ruang dengan menggunakan tabel III,adalah dengan
Ruang ini tempat menyiapkan dan membuat media, menyimpan peralatan yang mencari titik temu antara kategori ruang
sudah steril dan reagensia.
Misalnya :
Dengan bagan tata ruang seperti diatas diharapkan kegiatan di laboratorium biakan Ruang penerimaan spesimen (1) dan ruang miroskopis (2) berhubungan secara
dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dilaksanakan dengan mudah dan langsung (HL)
menjamin keamanan kerja. Jika petugas laboratorium kidal, pengaturan dapat ditata
seperti bayangan kaca. Ruang sterilisasi (4) dengan ruang tempat inkubator berhubungan dekat (DK)
Ruang penerimaan spesimen(1) dan ruang biakan (3) harus terpisah (TP).
Catatan: Sejalan dengan kebutuhan akan kemanan kerja (biosafety), modifikasi
rancangan ruang laboratorium sebaiknya dilakukan dengan memperhatikan Gambar dibawah merupakan contoh “ lay out “ laboratorium pemeriksaan Mycobacterium
kaidah-kaidah keamanan kerja. Prinsip dasarnya dapat dilihat pada tabel 3. tuberculosis dengan fasilitas pemeriksaan biomolekuler dan menggunakan tata aliran
udara yang diatur secara mekanik.
Tabel 3. Kisi-kisi hubungan antar ruang di laboratorium dan laboratorium
Mycobacterium tuberculosis
Kategori ruang (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10)
Penerimaan spesimen (1) HL TP TP

Ruang mikroskopi (2) HL HL DK HL DK DK
Ruang biakan (3) TP HL HL HL HL DK HL DK DK
Ruang sterilisasi (4) DK HL HL DK HL DK
Ruang media (5) TP HL HL HL DK DK
Ruang mikroskop fluore- HL HL
sen (6)
Ruang pendingin (7) DK HL
Ruang inkubator (8)* DK HL DK
Gudang (9) DK HL DK
Penyimpanan gas (10) DK DK DK DK
Keterangan : DK : dekat
HL : hubungan langsung
TP : terpisah
*) walk in incubator
19
Tabel 4. Peralatan laboratorium biakan dan uji kepekaan dengan media padat Gambar berikut adalah contoh lay out laboratorium biakan dan uji kepekaan tanpa
untuk beban kerja 6000 uji/tahun fasilitas biomolekuler dengan pengaturan aliran udara secara mekanik
No Alat Spesifikasi/penggunaan Jumlah
1 Otoklaf “mixed load pressure cooker type “ atau 1

gravity displacement type “ dengan
pembuangan uap otomatik
2 Timbangan Top loading. Untuk membuat media 1
3 Biological safety cabi- Kelas II dan sesuai standar 2
net
4 Smart flame/incenera- 3
tor electric
5 Sentrifus Biocontained type ( rotor miring, bertutup 1
rapat ) dengan daya endap minimal 3000
g. Lebih diutamakan yang “ refrigerated “
6 Homogenizer/mixer Untuk homogenisasi telur, dapat diotoklaf/ 1
dsiterilkan
7 Inspisator/hot oven Pengatur suhu pada 80-85oC Kapasitas 1
double blower tergantung beban kerja,
Ruang laboratorium TB harus memenuhi syarat sbb.:
8 Mikroskop Binokuler, pembesaran total 1000 kali. 1
Dianjurkan menggunakan lensa anti jamur Lantai :
dan kondensor bukan plastik. Sediaan
Tidak mempunyai sambungan, dengan demikian tidak memakai bahan keramik.
lampu cadangan
9 Refrigerator Suhu 2-8oC 1 Sebaiknya memakai bahan epoksi yang tahan asam dan basa kuat. Pertemuan
10 Vortex 3 lantai dan dinding tidak bersudut.
11 Inkubator Rak dari alumunium atau stainless steel. 1 ( walk in Dinding :
Jika beban kerja tinggi maka digunakan “ incubator )
walk in incubator “ dengan kipas pengatur Terbuat dari bahan yang mudah dibersihkan, permukaan rata, cat dinding berwarna
udara terang, tidak mengkilat. Pertemuan antar dinding tidak bersudut agar mudah dibersihkan.
12 Penangas air Dilengkapi dengan termometer dan 2
Exhauster :
termostat
13 Freezer -20oC 1 Ditempatkan di area kotor, berlawanan dengan air condition dan mempunyai kapasitas
14 Freezer -70 C o
1 minimal 23.6 liter per detik.Udara yang dikeluarkan dari laboratorium ke lingkungan
15 Laminary airflow Untuk membuat media 1 sebaiknya telah melalui filter bakteri dengan arah menjauhi tempat berkumpul orang
16 Destilator/water purifier Destilator tidak menggunakan “metal type 1 banyak, pemukiman dan lalu lalang.
“. Sumber air memenuhi persyaratan.
Air Condition :
21
Daya disesuaikan dengan luasan ruang. Penempatan AC harus memperhatikan posisi Shower dan eye wash
teknisi saat bekerja dan tidak mengganggu tirai udara BSC. Alat ini harus ditempatkan di ruang kerja laboratorium TB, digunakan untuk melakukan
Pintu : netralisasi bila terjadi kecelakaan kerja berupa percikan larutan asam atau basa kuat
Dilengkapi dengan alat yang dapat otomatis menutup pintu, dibuat dari bahan yang dan bahan infeksius. Karena biasanya dalam laboratorium tidak digunakan asam atau
mudah dibersihkan dan memudahkan evakuasi dalam keadaan darurat. basa kuat dalam jumlah banyak, shower tidak merupakan keharusan
Bila ruang laboratorium TB terletak dilantai atas, maka tangga harus aman untuk dilalui Meja kerja
orang ( pegangan pada kedua sisi, tidak licin, ruang tangga terang dan dapat dilalui paling Dibuat permanen dari beton, tinggi 75 cm dari lantai, permukaan rata, tidak mempunyai
sedikit oleh 2 orang secara berdampingan). Sebaiknya ruang laboratorium memiliki pintu sambungan, sebaiknya dilapisi epoksi.
darurat atau ada bagian dinding yang dapat dipakai sebagai jalan keluar dalam keadaan
Kursi
darurat.
Rangka terbuat dari bahan logam yang tidak mudah berkarat dan dudukan dari bahan
Pasokan listrik yang mudah dibersihkan dan tidak menyerap cairan (plastik/kulit), bersifat ergonomik
Harus tersedia 24 jam, karena itu harus dilengkapi dengan generator listrik yang dapat
berfungsi secara otomatis dengan daya yang mencukupi untuk alat-alat yang harus Lemari penyimpan bahan media dan reagensia :
selalu operasional (deep freezer, incubator, refrigerator) Dibuat dari logam yang tidak mudah berkarat dan kaca.
Pasokan Air Catatan :

Harus tersedia dengan kualitas baik dan kuantitas yang cukup.
Bangunan dan peralatan laboratorium harus dirancang berdasarkan “ hazard risk
Bak cuci tangan assesment “. Risiko lebih besar saat melakukan uji kepekaan dibandingkan melakukan
Diletakkan di dekat pintu, dilengkapi dengan kran yang dibuka/tutup dengan siku atau biakan, risiko akan bertambah besar bila melakukan biakan dan uji kepekaan TB MDR,
kaki atau sensored outlet pemeliharaan sarana tidak sesuai, dan beban kerja tinggi. Karena itu WHO menganjurkan
biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dilakukan dalam laboratorium
Bak cuci alat
Bak ini harus cukup besar dan dalam untuk menampung alat-alat yang sedang dicuci dengan standard keamanan BSL 3 dan dilakukan dengan baku praktek laboratorium
(panjang 1m, lebar 75cm, dalam 50 cm) ,dibuat dari bahan yang kuat agar tidak mudah tingkat 3. Karena mahalnya biaya pembuatan dan pemeliharaan laboratorium BSL 3.
bocor (porselin, stainles), permukaan rata dan mudah dibersihkan. Di Indonesia laboratorium yang mengisolasi TB khususnya TB MDR sebaiknya bukan
laboratorium sederhana tetapi sesuai kategori BSL 2 plus dan dikerjakan dengan baku
Bak pewarnaan
praktek laboratorium BSL 3.
Bak ini khusus dipakai untuk proses pewarnaan sediaan BTA. Kedalaman bak sedemikian
rupa sehingga mencegah percikan air keluar ( 30-50 cm) B. Peralatan dan penjaminan kinerja alat, termasuk kalibrasi
Dibuat dari bahan yang tidak mudah bocor, kuat dan mudah dibersihkan dengan Peralatan yang penting untuk laboratorium biakan yang menggunakan media padat
permukaaan yang rata tanpa sambungan dan tidak bersudut. dengan beban kerja 6000 uji per tahun tertera dalam tabel 4.
23
Peruntukan Nama Volume/batch
No Alat Spesifikasi/penggunaan Jumlah
Gliserol 30 ml
Telur yang sudah homogen dan 1000 ml 17 Dessicator Untuk menyimpan bahan higroskopis 2
disaring 18 Dry sterilizer Suhu mencapai 200oC. Tidak mutlak ada 1
Final pH 6.2 19 Timbangan analitik Kepekaan mencapai minimal 0,1 mg (4 1
Uji kepekaan a. Rifampicin 40 mg/L (nefelometer) desimal)
b. Isoniazid 0,2 mg/L 20 Magnetic stirrer Untuk mempermudah pelarutan 2
c. Ethambutol 2 mg/L 21 Blender stainless steel Untuk homogenisasi telur, volume 1,8 L 1
d. Streptomycin sulphate 4 mg/L
e. Dimetil formamide (sesuai konsentrasi Tabel 5. Alat pendukung (beban kerja 6000 uji/tahun)
rifampicin)
f. Aquades No Alat Spesifikasi/penggunaan Jumlah
Identifikasi 1 Kertas aluminium Yang kuat ( heavy duty ) 8 gulung
• Larutan PNB a. PNB 0,1 g 2 Label/spidol Untuk identitas pot dahak 7000/ sc
b. Dimetil formamide 3 ml 3 Kertas indikator otoklaf 12 gulung
• Uji Niacin dengan a. Aquades 2 ml 4 Botol bertutup ulir 50, 100 ml @ 10
paper strip
5 Mangkok gerusan dan 30 x 50 cm 4
b. 1 Paper strip/tabung mortir
Pengawet dahak 10 mg CPC + 20 gr NaCl dalam ana, bila pekat 2 x volume 6 Wadah pipet (stainless Tempat sterilisasi pipet 5
1000ml aquades dahak steel)
Dekontaminasi NaOH 4%(1N) Ana atau 2x volume dahak
Aquadest atau 7 Tabung sentrifus Tutup ulir bukan logam, 15 ml dan 50 ml @ 7000
Homogenisasi Tween 80,0,1% 2 tetes/isolat 8 Kapas Absorben 2 kg
(1 ml Tween 80 + 99 ml aquades) 9 Rak botol biakan Kapasitas 50 botol 10
Penyimpanan koloni Skim milk bubuk dalam PBS 100 mg dalam 1 L 11 Rak tabung Kapasitas 48 tabung, polipropilen atau 5
pada -700C metal
12 Wadah limbah Tahan tusuk, tidak mudah bocor, bertutup 2
13 Nampan limbah polipropilen 3
14 Corong Gelas, 45-60 mm dan 90-125 mm garis @2
tengahnya
15 Kertas saring Diameter 15 mm, Whatman no 4, no1. @ 4 kotak
16 Desinfektan Lisol 5% atau hipoklorit 5% 40 l
18 Labu erlenmeyer 250 dan 500 ml @2
19 Sarung tangan Sekali pakai 400
20 Kaca pembesar 1
25
No Alat Spesifikasi/penggunaan Jumlah No Alat Spesifikasi/penggunaan Jumlah
21 Ose disposable bahan plastik 7000 51 Glass beads Diameter 1,5 – 3 mm Secukup
22 Buku register 2-4 nya
23 Formulir permintaan 7000 52 Kain kasa Penyaring telur 1 roll
pemeriksaan 53 Mikropipet
24 Formulir laporan 7000
Tabel 6. Bahan habis pakai untuk Biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuber-
25 Kertas lensa Untuk membersihkan lensa mikroskop Secukup culosis
nya
26 Masker N95 400 Peruntukan Nama Volume/batch
27 Botol Mc Cartney 14 atau 28 ml,bertutup minimal 3 ulir 9000 Media Lowenstein a. Potasium dihidrogen fosfat 2,4 gram
28 Gelas ukur 25,100,250 dan 1000 ml @2 Jensen
29 Gelas objek 7000 b. Magnesium sulfat heptahidrat 0,24 gram
30 Baju lab 2 per orang c. triMgdisitrat 14-hidrat 0,6 gram
per tahun d. L asparagin 3,6 gram
31 Kertas tissue 2 gulung e. Potato meal 30 gram
32 Pipet Pasteur Disposable, 1 dan 2,5 cc @7000 f. Malachite green 2% 20 ml
34 Volume Pipet 1ml , 5 ml, 10 ml @5 g. Aquades 600 ml
37 Rak untuk inspisasi Stainless steel kemiringan 30o 10 h. Gliserol 12 ml
36 Botol reagensia Kapasitas 50-1000 ml @ 25 i. Telur yang sudah homogen dan 1000 ml
37 Pippet bulb @5 disaring
38 Gunting Stainless steel, 25 cm 4 Modified Ogawa 3% Kalium dihydrogen phosphate 2g
39 Rak gelas objek Plastik, kapasita 25 slide 4 (untuk kultur)
40 Kotak sediaan 20 Magnesium citrate (KH2PO4) 0.1g
41 Spatula Stainless steel 4 Natrium glutamate 0.5g
42 Pot dahak Bening, diameter minimal 4 cm, bertutup 6000 Glycerol 4ml
ulir, volume 50 ml Distilled water 100ml
43 Botol reagen Gelas berwarna gelap 3 Homogenised whole eggs 200ml
44 Rak pewarnaan 2 2% Malachite green solution 4ml
45 Keranjang Stainless steel, diameter sesuai otoklaf 2 Final pH 6.4
46 Batang pengaduk Gelas, panjang 20-30 cm 5 Acidified Ogawa 3% Mono Kalium dihidrogen fosfat 15 gram
47 Tabung reaksi Gelas, 16 x 152 mm 200 (untuk kultur) (KH2PO4)
48 Tutup tabung Alumunium, Cap O 600 Natrium glutamat 5 gram
49 Termometer o
C (uji suhu inkubator, refrigerator) 2 tiap alat Malachite green 2% 30 ml
50 Stopwatch 0-60 menit 2 Aquades 500 ml
27
8. Petugas harus mencuci tangan dengan sabun dan air mengalir dan selanjutnya V. KEAMANAN KERJA UNTUK BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN
dengan alkohol 70% atau antiseptik untuk kulit lainnya, setiap masuk ke laboratorium,
A. Desain Laboratorium
selesai menangani bahan tercemar, dan setelah bekerja. Untuk mengeringkan
tangan dilarang memakai handuk, pakailah pengering sekali pakai. Kegiatan Laboratorium untuk biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis
9. Petugas harus menanggalkan baju laboratorium saat akan meninggalkan ruang harus mengikuti standar keamanan yang ada. Menurut pedoman WHO, terdapat
laboratorium.
beberapa ketentuan pada kemanan tingkat 3, yakni:
10. Pekerjaan yang beresiko menimbulkan aerosol seperti membuka wadah, mengocok,
1. Sebelum masuk ruang laboratorium, sebaiknya terdapat dua ruang pemisah,
menggerus, waktu membuat sediaan apus, dan memipet bahan tercemar harus
yaitu vestibulum (ruang bersih, tempat alat pelindung diri bersih dikenakan) dan
dilakukan dalam BSC dengan blower dinyalakan
anteroom (ruang bersih, tempat alat pelindung diri dilepaskan).
11. Pemusingan dilakukan dengan alat biocontained centrifuge yang tidak memungkinkan
aerosol keluar dari alat. Lakukan sentrifugasi dalam fixed angle rotor (sudut rotor 2. Pintu ruang antara dapat menutup otomatik dan interrlocking, sehingga hanya
tidak berubah pada saat dilakukan pemusingan). Dilarang menggunakan rem mesin satu pintu yang terbuka pada suatu saat.
sentrifus, biarkan berhenti sendiri. 3. Permukaan dinding, lantai dan atap harus kedap air dan mudah dibersihkan.
12. Penggunaan semprit dan jarum harus dibatasi. Hanya semprit dengan jarum yang 4. Ruang laboratorium harus tahan desinfektan. Pipa udara harus tahan terhadap
dapat ”dikunci”/ berulir yang boleh dipakai. Jarum dilarang dibengkokan, dilepas dekontaminasi dengan gas.
dari sempritnya ataupun ditutup ulang. Semprit dan jarum yang telah dipakai harus 5. Jendela selalu ditutup, terbuat dari kaca dan kedap udara.
diletakkan pada wadah tahan tusukan dan disterilisasi dengan otoklaf atau insinerator. 6. Didekat pintu keluar ruang laboratorium disediakan tempat cuci tangan yang
Sebelum disterilkan, jarum dapat direndam dalam desinfektan selama 24 jam. dilengkapi dengan pengaturan otomatis tanpa menggunakan tangan.
13. Sebelum memakai alat, selalu perhatikan dan ikuti petunjuk pemakaian alat tersebut. Sistem ventilasi dibuat sedemikian rupa sehingga tidak mengalir ke dalam ruang
14. Jangan membuka langsung wadah yang baru saja dikocok atau disentrifugasi, lain dalam gedung. Sebaiknya digunakan filter high efficiency particulate air
biarkan dahulu selama minimal 10 menit. (HEPA), sehingga udara setelah bersih dapat dialirkan kembali di dalam ruang
C. Pedoman Khusus laboratorium. Bila udara dari laboratorium (selain dari BSC) akan dialirkan kearah
luar gedung harus tidak mengenai bagian lain dalam gedung dan terpisah
Kesalahan petugas, teknik kerja yang tidak benar dan penggunaan alat yang salah
dari udara masuk. Ventilasi dan air-conditioning (AC) dapat dipasang dengan
akan menyebabkan kecelakaan kerja infeksi akibat kerja. Teknik-teknik kerja yang perlu
menjaga agar tekanan udara negatif tetap ada di laboratorium. Sistim pengaliran
diperhatikan untuk menghindari atau mengurangi masalah yang timbul akibat kerja pada
udara dalam laboratorium tidak boleh mengganggu tirai aliran udara BSC
pelaksanaan kultur dan DST-TB :
7. Semua filter HEPA harus dipasang dengan memungkinkan bagi dekontaminasi
1. Alat pelindung diri / Personal Protective equipment (PPE) menggunakan gas dan mudah di cek.
8. Biological Safety Cabinet (BSC) sebaiknya tidak ditempatkan di tempat untuk lalu
Baju laboratorium harus dipakai setiap saat bekerja di laboratorium. Baju
laboratorium harus menutup seluruh permukaan depan mulai leher sampai lalang petugas laboratorium dan tidak menghadap ke pintu dan sistem ventilasi.
29
B. Pedoman Umum Keamanan Laboratorium Prosedur kerja merupakan unsur terpenting dalam keamanan di laboratorium. Tim
keamanan kerja harus dibentuk untuk mengelola keamanan kerja di laboratorium.
Laboratorium harus memiliki peraturan dan pedoman keselamatan kerja yang
Ketentuan di bawah ini harus diketahui dan dilaksanakan oleh setiap petugas:
komprehensif. Keselamatan kerja di laboratorium merupakan tanggung jawab
1. Akses laboratorium : tanda pada gambar 1 diatas harus dipasang pada pintu masuk.
semua anggota baik supervisor maupun pekerja laboratorium. Perlu dibentuk komite
Laboratoriun TB hanya boleh dimasuki oleh petugas yang telah terlatih dalam hal
keselamatan kerja yang bertanggungjawab mengembangkan kebijakan institusional
prosedur penanganan mikroorganisme patogen. Orang dan petugas yang tak terkait,
tentang keselamatan kerja, melakukan penilaian terhadap resiko kerja dan memastikan
tidak diperkenankan masuk ke dalam ruang laboratorium. Petugas kebersihan dan
pedoman praktek kerja di laboratorium dilaksanakan oleh setiap pekerja laboratoium.
teknisi alat atau orang lain dengan alasan kuat hanya diperkenankan masuk setelah
Laboratorium biakan dan uji kepekaan harus ditandai sebagai lokasi yang infeksius mendapat penjelasan, mematuhi penjelasan dari petugas laboratorium dan izin dari
dan harus terpasang lambing biohazard untuk membatasi akses ke laboratorium. penanggung jawab laboratorium.
2. Dilarang memakai perhiasan pada tangan selama bekerja. Gunakan sarung tangan
Tanda baku biohazard international yang ditempel pada Laboratorium yang menangani
jika menangani dahak dan bahan tercemar.
mikroorganisme beresiko klas 2 atau diatasnya, menyebutkan tingkat keamanan,
3. Pekerjaan harus mengikuti prosedur tetap (Protap/ SOP) yang ada dan dikerjakan
penanggung jawab, alamat yang harus dihubungi bila terjadi kedaruratan.
hati-hati.
4. Semua permukaan tempat kerja harus didesinfeksi tiap selesai bekerja dan segera
setelah terjadi tumpahan kecil . Desinfeksi permukaan kerja segera setelah pekerjaan
selesai dengan handuk/kertas yang telah dibasahi oleh larutan 5 % senyawa fenol
(lysol, kresol, karbol) atau 70% etanol atau larutan natrium hipoklorit 1 : 100 - 200
(natrium hipoklorit terdapat pada larutan pemutih pakaian. Untuk membuat larutan 1
: 100 - 200 yang benar, perhatikan konsentrasi natrium hipoklorit pada label pemutih
tersebut). Lantai laboratorium secara berkala (tiap hari segera setelah selesai
bekerja) harus dipel dengan desinfektan.
5. Semua limbah infeksius dan bahan lain yang tercemar harus di otoklaf atau
insenerasi/ karbonisasi sebelum dibuang. Jika proses ini oleh suatu sebab menjadi
tertunda maka bahan-bahan limbah tersebut harus dikemas dalam container yang
kedap bocor. Semua limbah infeksius dibuang sesuai dengan Protap. Barang dan
bahan (berpotensi) tercemar yang tidak dipakai lagi harus segera disterilisasi dengan
Gambar 3. Tanda baku biohazard international otoklaf, pemanasan kering atau insenerator/ carbonizer. Pencucian barang boleh
dilakukan setelah dilakukan sterilisasi.
Seperti telah disebutkan diatas, penularan TB terjadi melalui inhalasi partikel infektif. 6. Dilarang memakai kosmetik di dalam laboratorium. Demikian juga dengan menyimpan
Bahaya terjadinya partikel infektif terutama terjadi saat pengumpulan dahak, pencampuran makanan dan minuman dalam lemari es di laboratorium.
larutan lain dan dahak/biakan, homogenisasi, penggunaan sengkelit, pemipetan serta 7. Ruang laboratorium harus selalu bersih, rapi dan bebas dari bahaya fisik (misalnya :
sentrifugasi. sengatan listrik, tergelincir, dsb).
31
5. Penggunaan BSC kelas II melewati lutut, tanpa kerah dan tidak menggunakan tali yang panjang sebagai
Dianjurkan menggunakan BSC yang dasarnya tak berpori dan alasnya terbuat pengikat. Panjang lengan harus mencapai pergelangan tangan dan pada bagian
dari stainless steel pergelangan tangannya, digunakan karet. Baju laboratorium harus ditanggalkan
Digunakan untuk melakukan tindakan pada bahan (tersangka) tercemar, seperti
saat keluar laboratorium dan dimasukkan dalam kantong tertutup atau direndam
saat membuka wadah bahan, membuat sediaan mikroskopis, melakukan
dalam desinfektan sebelum disterilkan dan selanjutnya dicuci.
sentrifugasi (jika alatnya tidak bio-contained), melakukan pengocokan/
Sarung tangan harus dipakai saat bekerja di laboratorium. Setelah selesai
pengguncangan, melakukan inokulasi bahan pada media, dsb.
Prosedur tetap pemakaian BSC harus tertulis dan tersedia di laboratorium serta setiap tindakan, sarung tangan dilepas secara aseptik. Ganti sarung tangan jika
mudah dibaca oleh tiap pekerja. Harap selalu diperhatikan bahwa BSC tidak terkontaminasi, sobek atau jika diperlukan. Gunakan 2 pasang sarung tangan
dirancang untuk melindungi pekerja dari tumpahan yang luas, pecahan atau jika perlu misalnya dalam penanganan tumpahan. Sarung tangan yg sudah
tehnik laboratorium yang buruk. dipakai tidak boleh dicuci dan digunakan lagi. Buang sarung tangan bersama
BSC yang rusak jangan dipakai. limbah laboratorium lain. Selanjutnya cuci tangan sesuai protokol yang tepat.
Skema aliran udara pada BSC klas 2 menjamin agar udara dari ruangan (kotor)
Dianjurkan pula memakai masker. Masker harus mempunyai kemampuan
masuk ke arah bawah di dalam kabinet, sebagian akan dimasukkan kembali
menyaring 95% partikel dengan ukuran 1-5 mikrometer. Ukuran masker
kedalam ruang kabinet setelah difiltrasi, sebagian yang lain dilepas keatas setelah
disesuaikan dengan hasil “fit test“. Masker yang tidak “fit“ tidak ada gunanya.
melalui filter. Kabinet ini melindungi petugas dan spesimen dari kontaminasi.
Tidak boleh mengenakan alas kaki terbuka di laboratorium
Kacamata pelindung, pelindung muka atau alat pengaman lain hanya dipakai jika
perlu untuk melindungi mata dan wajah dari percikan pada saat terjadi tumpahan.
Semua alat pelindung diri tidak boleh dipakai di luar laboratorium .
2. Penanganan dan Pengiriman Spesimen
Pengumpulan spesimen, pengiriman dan penanganan spesimen yang tidak benar

merupakan risiko penularan infeksi.
Wadah Spesimen
Sebaiknya dari plastik dengan tutup ulir rapat dan tahan pecah atau bocor,
ukuran sesuai anjuran agar contoh uji tidak tumpah.
Diberi label dengan benar sebelum digunakan
Pengiriman spesimen ke laboratorium lain
Wadah spesimen yang tertutup rapat ditempatkan di wadah kedua untuk mengantisipasi
pecah atau bocor. Sebagai wadah kedua dapat digunakan kotak kardus, atau plastik
Gambar 5. Skema aliran udara pada BSC klas 2
33
tahan pecah dan bocor yang besarnya tepat dengan wadah pertama sehingga dapat kontaminasi pada alat bantu pipet. Sumbat kapas (stopper) harus cukup padat
tetap tegak dan tidak bergoyang, dilengkapi dengan kertas yang dapat menyerap dan kapas tidak keluar dari ujung pipet
tumpahan yang berasal dari wadah spesimen. Ditutup rapat dan diseal. Wadah kedua Sebaiknya dipakai pipet berskala agar pemipetan tak perlu sampai habis benar
(ujung pipet biasanya lebih kecil dan ada kecenderungan penekanan kuat
harus dapat di-dekontaminasi. Selanjutnya wadah kedua dimasukan dalam wadah ketiga
agar semua cairan keluar sehingga resiko terjadinya droplet lebih besar). Saat
yang terbuat dari karton dengan tanda seperti dalam gambar. Antara wadah kedua dan
mengeluarkan cairan dari pipet, sentuhkan ujung pipet pada permukaan dalam
wadah ketiga harus mempunyai jarak. Bila pengiriman menempuh waktu yang lama dan
wadah dan alirkan perlahan-lahan.
dikhawatirkan terjadi kekurangan daya hidup kuman maka tambahkan dry ice dalam Jangan meniupkan udara di atas bahan yang akan dipipet.
wadah ketiga dan tempatkan kemasan sedemikian rupa sehingga proses penguapan Rendam pipet dalam wadah berisi desinfektan segera setelah selesai tindakan.
tidak terganggu. Informasikan pemakaian dry ice pada kurir. Biarkan semalam (minimal 12 jam) sebelum disterilkan.
Sediakan kapas dibasahi desinfektan di dekat tempat kerja agar jika terjadi
tumpahan dapat segera didesinfeksi.
Untuk bahan tercemar, dilarang mengganti fungsi pipet dengan semprit karena
resiko aerosolisasi lebih besar.
Jika memakai mikropipetor, gagang mikropipetor tidak boleh menyentuh atau
menempel bagian dalam dan mulut dari wadah tercemar. Hanya “tip” yang boleh
masuk ke dalam wadah tercemar
Pemipetan bahan infeksius dilakukan dalam BSC
4. Penggunaan sengkelit/ ose/ loop

Bahaya penggunaan sengkelit adalah aerosolisasi
Lingkaran sengkelit hendaknya penuh, lingkaran yang tidak penuh lebih berisiko
menggores media/gelas dan menimbulkan percikan. Makin panjang gagang
Gambar 4. Skema wadah spesimen rujukan
sengkelit, makin besar potensinya menimbulkan aerosol. Upayakan hanya
Penerimaan Spesimen bagian lingkarannya yang menyentuh bahan yang (berpotensi ) tercemar bahan
Laboratorium rujukan harus memiliki ruang khusus penerimaan spesimen. infeksius.
Dianjurkan menggunakan sengkelit sekali pakai sehingga mencegah terjadinya
Membuka kemasan spesimen
aerosol.
Harus dilakukan di dalam BSC
Spesimen dibuka diatas kertas yang dibasahi desinfektan Untuk mencegah terjadinya droplet, sengkelit yang telah dipakai, dimasukkan
Tersedia pula larutan disinfektan untuk menangani tumpahan ke dalam botol berisi pasir-lysol, dibersihkan dengan jalan memutarnya di dalam
pasir dan tidak langsung pada pembakar Bunsen. Dapat juga dicelupkan pada
3. Penggunaan pipet pasir-alkohol sebelum dibakar dengan pembakar bunsen. Lakukan desinfeksi
Pada saat memipet selalu gunakan alat bantu pipet (pipet aid), dilarang setiap selesai melakukan tindakan.
menggunakan mulut. Inokulasi bahan atau pembuatan sediaan dengan sengkelit hendaknya dilakukan
Semua pipet harus diberi sumbat kapas di ujungnya untuk mengurangi dalam BSC. Lakukan dengan hati-hati.
35
Komposisi “Kit tumpahan biologi” Pembukaan panel kaca kabinet saat bekerja sesuai dengan petunjuk pemakaian.
Nyalakan exhaust fan sebelum bekerja sesuai dengan petunjuk pemakaian
Laboratorium penelitian biomedis dan mikrobiologi harus menyediakan “kit tumpahan
sampai dengan 5 menit setelah pekerjaan selesai.
biologis”. Kit tumpahan adalah alat keamanan penting untuk kerja laboratorium dengan
Gunakan lampu UV sesuai petunjuk.
agen mikrobiologi yang termasuk dalam BSL 2 atau diatasnya. Alat dan bahan berikut
jangan menggunakan pembakar Bunsen dalam kabinet karena mempermudah
harus ada dalam kit tumpahan:
kerusakan filter. Pakailah mikro-incenerator atau ose sekali pakai.
1. Desinfektan (periksa tanggal kadaluwarsa setiap tahunnya)
Batasi jumlah bahan dan alat dalam kabinet sesedikit mungkin dan letakkan di
2. Forsep, sapu dan serok autoclavable, atau alat mekanik lain untuk menangani
belakang daerah kerja. Bahan dan pengendali alat yang digunakan harus terlihat
benda tajam.
melalui panel kaca. Bahan dan alat tidak boleh menghalangi aliran udara BSC
3. Kertas tissue atau bahan penyerap lainnya
Lakukan pekerjaan di bagian tengah. Pisahkan barang bersih dengan kegiatan
4. Kantong Biohazard untuk membuang tumpahan yang terkontaminasi
yang dapat menghasilkan aerosol minimal 12 cm. Pisahkan peletakkan bahan
5. Tempat sampah benda tajam yang kosong
dalam tiga urutan, bersih ( misalnya larutan pengencer steril), tempat pengerjaan,
6. Sarung tangan
kotor (misalnya tempat pembuangan tip mikropipet).
7. Pelindung wajah (kacamata dan masker atau pelindung wajah)
Jangan biarkan botol dan tabung berisi bahan infektif terbuka. Segera tutup
8. Sepatu boots kedap air kembali setelah dibuka.
Pedoman Umum pada Insiden tumpahan Letakkan wadah berisi desinfektan dalam BSC untuk menampung limbah
1. Hindari menghirup material yang terkandung di udara dan segera tinggalkan kegiatan atau wadah limbah lain yang dapat diotoklaf.
ruangan. Beritahu yang lain untuk meninggalkan ruangan Hindari berkali-kali memasukkan dan mengeluarkan tangan. Hindari seminimal
2. Tutup pintu dan pasang tanda bahaya mungkin gerakan tangan menyamping dan berputar.
3. Lepas pakaian yang terkointaminasi, balik bagian yang terkontaminasi ke dalam Dilarang lalu lalang di muka kabinet bila sedang tak bekerja.
dan masukkan ke kantong biohazard. Setelah selesai bekerja, kabinet dikosongkan, didesinfeksi, dan UV dinyalakan
4. Cuci semua bagian kulit yang terpapar dengan sabun dan air. selama 2 jam atau sesuai dengan petunjuk produsen lampu.
5. Informasikan pada supervisor dan tim keamanan kerja Fan kabinet harus dihidupkan 5 menit sebelum bekerja dan setelah pekerjaan di
kabinet selesai
Pembersihan tumpahan
Kalibrasi BSC dilakukan secara berkala minimal 1x per tahun.
1. Biarkan aerosol hilang/ mengendap selama setidaknya 30 menit sebelum masuk
kembali laboratorium. Persiapkan alat untuk pembersihan (spill kit) 6. Penggunaan lemari pendingin.
2. Kenakan alat pelindung diri (baju lab, pelindung wajah, sarung tangan lapis ganda Lakukan defrosting secara teratur.
dan sepatu boot). Buat demarkasi wilayah tumpahan dengan kertas tissue. Tutupi Semua wadah harus diberi label yang jelas mencakup antara lain tanggal
daerah yang menuju pintu keluar lab. Tutup tumpahan dengan kertas tissue yang pembuatan dan kadaluwarsa, nama bahan, nama penyimpan. Wadah berisi
mengandung disinfektan dan tuangkan desinfektan hati-hati ditempat tumpahan. dahak harus tertutup rapat, berdiri tegak.
Gunakan desinfektan yang lebih tinggi konsentrasinya karena anak diencerkan oleh Dilarang menyimpan makanan, minuman, kosmetika serta barang lain yang tak
tumpahan tersebut. Biarkan kontak selama 20 menit. berkaitan dengan pekerjaan laboratorium.
37
Jangan menyimpan cairan yang mudah terbakar. 5. Insenerasi merupakan cara mengolah limbah sebelum atau setelah diotoklaf.
Jika ada percikan/tumpahan bahan tercemar, keluarkan barang yang pecah Insenerasi idealnya dilakukan pada alat dengan dua ruang bakar, di mana
dengan memakai sarung tangan karet. Selanjutnya desinfeksi bagian dalam pada ruang bakar pertama suhu mencapai 8000C dan pada ruang bakar kedua
lemari pendingin mencapai 10000C. Waktu retensi gas dalam ruang bakar kedua minimal 0,5 detik.
Jangan mengisi wadah penuh jika akan dibekukan. Insenerator yang hanya memiliki satu ruang bakar kurang efektif untuk menangani
bahan infektif. Jika memakai carbonizer pakailah sesuai petunjuk pemakaian.
D. Penanganan Limbah.
6. Untuk sterilisasi dengan otoklaf dibutuhkan suhu 1210C dengan tekanan udara
1. Limbah infektif dan tidak infektif, baik padat maupun cair harus dikumpulkan pada
1,5 sampai 2 atmosfer selama minimal 20 menit (perhitungan waktu dimulai saat
tempat terpisah dalam wadah yang tidak bocor. Wadah untuk limbah tajam harus
suhu dan tekanan udara tersebut tercapai; jangan membuka otoklaf jika belum
kuat terhadap tusukan.
dingin benar dan jangan mengisi air berlebihan). Jika jumlah yang di otoklaf
2. Wadah spesimen dan tutupnya, kaca sediaan yang sudah tak terpakai dan
banyak, dianjurkan minimal 30 menit dan 45 menit untuk sterilisasi biakan.
limbah padat lain harus direndam dalam larutan lysol 5% atau desinfektan lain
Pastikan bahwa ada ruang kosong diantara barang yang di otoklaf. Pada saat
yang cocok untuk desinfeksi Mycobacterium tuberculosis selama minimal 12
melakukan otoklaf, pastikan bahwa tidak ada wadah yang tertutup rapat. Wadah
jam.
harus sedikit dilonggarkan agar uap air mudah masuk ke dalam wadah. Dianjurkan
3. Limbah cair bekas pewarnaan ditampung dalam wadah yang mengandung lysol
melakukan uji fungsi otoklaf secara berkala sebaiknya dengan memakai spora
sebelum dibuang ke saluran limbah. Limbah zat pewarna hanya dibuang ke
B.thermophilus sebagai indikator dan ditempatkan di bagian paling tengah dari
saluran air kotor yang tak akan mencemari badan air/ sungai untuk konsumsi.
bahan yang akan disterilkan. Jika menggunakan pemanasan kering, lakukan
Informasi lebih lanjut dapat ditanyakan kepada Badan Pengendalian Dampak
pada suhu 1800C selama minimal 2 jam.
Lingkungan (Bapedal) daerah masing-masing.
7. Tersedia “spill kit” yang berisi semua peralatan untuk menanggulangi kecelakaan
4. Untuk membersihkan tumpahan dahak , petugas harus memakai sarung tangan
kerja berupa tumpahan bahan infeksius (terdiri atas : tissue, lap tebal, forcep,
ganda dan sepatu kedap air, selanjutnya tutupi dahak dan wadah yang pecah
desinfektan, sapu kecil dengan skop sampah yang bisa didesinfeksi, google,
tersebut dengan kain atau kertas. Tuang larutan lysol 5% atau desinfektan lain
respirator, sarung tangan, kantong plastik).
yang sesuai untuk Mycobacterium tuberculosis sampai membasahi semua
Spill kit harus disimpan di tempat yang mudah terjangkau, disertai dengan tulisan
kertas/kain dan biarkan selama 2 jam dalam keadaan basah. Lepas sarung
“spill kit” dan prosedur penggunaannya.
tangan terluar dan kumpulkan bersama wadah yang pecah, kertas/kain yang
8. Tersedia kotak PPPK yang berisi kapas, antiseptik, plester dll
dipakai tempatkan dalam wadah tertutup dan sterilkan. Pakai sarung tangan
lapis kedua baru, selanjutnya pel lantai dengan desinfektan. Sepatu baru dilepas E. Penanganan Tumpahan Infeksius
setelah alasnya diinjakkan pada kain yang dibasahi desinfektan. Jika percikan
Tumpahan limbah harus dibersihkan dengan cepat berdasarkan prosedur pembersihan
terjadi dalam BSC, jangan matikan blower-nya. Biarkan tetap menyala agar filter
tumpahan sesuai jenis limbahnya. Harus tersedia “Spill kit “atau kit penanggulangan
HEPA dapat membantu mengurangi cemaran dan tindakan desinfeksi dilakukan
tumpahan biologi.
seperti di atas. Untuk BSC yang tutup dasarnya berpori, lakukan desinfeksi untuk
tutup berpori dan setelah tutup diangkat, lakukan untuk permukaan dibawah tutup
39
Catatan : 3. Ambillah jika ada benda tajam dengan forsep dan buang dalam wadah benda tajam.
• Pada sampel dahak SPS atau SP, kerjakan pemeriksaan biakan dalam Tutup desinfektan dan tumpahan dengan menggunakan kertas tissue atau kain lap.
tabung yang sama. Kumpulkan dahak menjadi satu atau ambil dahak Karena kemungkinan ada benda tajam dibawah kertas tissue, gunakan sapu dan
dengan hasil BTA terbanyak serok autoclavable untuk membersihkan tumpahan dan letakkan dalam wadah
• Identifikasi dikerjakan pada koloni murni dan jumlah memadai (confluent) benda tajam. Pecahan kecil gelas dapat diambil dengan menggunakan kapas atau
• Untuk bahan yang steril, misalnya cairan liquorserebrospinal, bronkolaveolar kertas tissue yang dipegang dengan forsep. Jika tidak ada benda tajam dalam
lavage tidak perlu dilakukan dekontaminasi dan homogenisasi, cukup tumpahan, buang material dalam kantong autoclave. Tanggalkan sarung tangan
dilakukan konsentrasi dengan sentrifugasi minimum 3000 g selama 15 terluar, ganti dengan yang baru
menit 4. Bersihkan area sekitarnya (dimana mungkin tumpahan terpercik) dengan
• Untuk bahan bilasan lambung biarkan sisa makanan mengendap, kemudian desinfektan. Gerakan pembersihan dilakukan secara sirkuler dimulai dari bagian
dilakukan sentifugasi 3000g selama 15 menit terhadap supernatannya. terluar menuju ke pusat tumpahan
5. Buang semua kertas tissue dan alat pelindung yang terkontaminasi dalam kantong
Selanjutnya identifikasi Mycobacterium mengikuti langkah-langkah sebagai berikut :
biohazard atau kantong autoclave.
1. Pengamatan makroskopis
6. Cucilah tangan dan area kulit yang terpapar dengan sabun cair dan air mengalir.
a. Amati keberadaan satu atau lebih jenis koloni. Deskripsikan ukuran koloni
dan sifat-sifat lain seperti: kasar, halus, cembung, menyebar, tepi bergerigi, Pembersihan tumpahan di BSC.
transparan, keruh, dan sebagainya 1. Biarkan blower BSC menyala dan segera mulai membersihkan.
b. Amati pigmen pasca inkubasi (kuning, oranye, kuning muda, kuning-oranye). 2. Bersihkan cabinet dari tumpahan, tutup daerah tumpahan dengan kertas tissue atau
Jika tak berpigmen, sebut sebagai “buff”. kertas tissue yang mengandung disinfektan, jaga supaya wajah tetap dibalik kaca.
c. Jika terdapat lebih dari satu jenis koloni, lakukan subkultur untuk tiap jenis koloni. 3. Jika perlu, genangi permukaan meja juga drain pans dan catch basins dibawah meja
2. Pewarnaan BTA dengan Ziehl-Neelsen. kerja berisi disinfektan. Pastikan katup pengering tertutup sebelum menggenangi
Yakinkan tak ada cemaran mikroba yang tahan asam selain Mycobacteria. area permukaan meja.
Rhodococcus spp, Nocardia spp, Legionella micdadei, kista Cryptopsoridium spp 4. Bersihkan dinding kabinet, permukaan meja dan bagian dalam kaca dengan
dan Isospora spp juga tahan asam walau pada tingkat lebih rendah. Dengan cara desinfektan.
ini tidak dapat dibedakan MTB dan MOTT. 5. Jika permukaan meja dan drain pans dan catch basins dibawah permukaan meja
3. Kecepatan tumbuh. telah digenangi dengan desinfektan tuanglah disinfektan pada permukaaan meja
Rapid grower akan tumbuh dalam 7 hari atau kurang, sedangkan slow grower akan kerja. Letakkan wadah dibawah katup pengering dan keringkan disinfektan dibawah
tumbuh setelah itu. Namun hal tersebut tak selalu jelas batasnya. M. chelonae meja kerja ke wadah tersebut.
subspesies chelonae atau M. thermoresistible pada suhu 35-37oC akan tampak 6. Bersihkan area dibawah permukaan kerja untuk membersihkan sisa disinfektan.
sebagai slow grower. M. chelonae subspesies chelonae menjadi rapid grower pada 7. Cucilah tangan dan kulit yang terpapar dengan sabun dan air.
suhu 25-30 oC dan M. thermoresistible pada suhu 45-52 oC.
4. Pencahayaan.
41
Pembersihan tumpahan sentrifugasi VI. ALUR KERJA BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN
1. Selalu gunakan safety buckets yang tertutup atau rotor dengan cincin O yang Mycobacterium tuberculosis
tertutup. Periksa cincin-O dan ganti jika sudah digunakan, pecah atau hilang. Periksa
Biakan Mycobacterium tuberculosis dilakukan untuk konfirmasi diagnosis, pemantauan
tabung atau botol apakah terdapat tanda-tanda pecah dan kelainan bentuk sebelum terapi dan penentuan kesembuhan. Pedoman ini memberikan petunjuk untuk melakukan
digunakan. biakan, identifikasi dan uji kepekaan menggunakan media padat berbahan telur. Adapun
2. Selalu gunakan sentrifuse biocontainment dengan safety bucket yang berfungsi baik. langkah-langkah untuk melakukan biakan dapat dilihat pada alur di bawah ini.
3. Tunggu 5 menit sebelum membuka sentrifus yang mengandung material biologis yang
Gambar 6. Alur Biakan dan Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
berbahaya. Jika ditemukan tumpahan setelah sentrifus dibuka, tutup kembali secara
hati-hati dan kosongkan laboratorium dan tutup pintu laboratorium. Petugas tetap
diluar laboratorium setidaknya selama 30 menit. Pasang tanda di pintu laboratorium
menunjukkan bahwa ada tumpahan biohazard dan dilarang masuk.
4. Lepaskan semua alat pelindung diri yang terkontaminasi dan masukkan dalam
kantong biohazard. Cuci tangan dan kulit yang terpapar dengan sabun dan air.
5. Masuklah ke laboratorium setelah 30 menit dengan APD dan spill kit.
6. Pindahkan rotor dan bucket ke dalam BSC. Rendam rotor dan bucket dalam alkohol
70% atau disinfektan non korosif yang efektif membunuh Mycobacterium tuberculosis.
Biarkan setidaknya 30 menit untuk kontak. Tabung yang utuh dapat dibersihkan dan
diletakkan dalam wadah yang baru. Ambil pecahan gelas dengan forsep dan buang
dalam wadah benda tajam berisi desinfektan.
7. Pecahan gelas yang lebih kecil dapat diambil dengan kapas atau kertas tissue yang
dipegang dengan forsep. Bersihkan dengan hati-hati bagian dalam centrifus dengan
disinfektan dan biarkan mengering. Jika digunakan pemutih, lanjutkan dengan
alkohol 70% untuk mencegah korosif.
8. Simpan bahan terkontaminasi dan APD yang sekali pakai dalam kantong autoclave
dan lakukan autoclave.
9. Cuci tangan dengan sabun dan air bersih mengalir.
43
Apabila terdapat indikasi untuk melakukan uji kepekaan maka uji kepekaan dapat Mycobacteria yang termasuk photokromogen akan menghasilkan pigmen jika
dilakukan bersamaan atau setelah uji identifikasi. dipaparkan cahaya. Namun pigmen hanya optimal jika koloni kuman terpisah. Jika
pertumbuhannya sangat padat, pigmen tak akan muncul.
Gambar 8. Alur Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis
5. Identifikasi Mycobacteria yang lebih rinci dilakukan dengan berbagai cara :
a. Uji biokimia
Misalnya uji niasin, uji reduksi nitrat, uji katalase, uji katalase tahan panas, uji
hidrolisa tween, uji urease, uji arilsulfatase, uji iron uptake, uji penggunaan
sitrate, uji penggunaan inositol, uji penggunaan manitol, uji pirazinamidase dan
uji reduksi telurit.
b. Uji toleransi pada 5% NaCl atau hambatan oleh thiophene 2 carboxylic acid
hydrazide (TCH)
c. Uji pertumbuhan pada media McConkey tanpa kristal violet
d. Uji molekuler
e. Kromatografi cair atau tekanan tinggi.
Perbedaan diantara Mycobacterium tuberculosis complex dapat dilihat pada tabel

dibawah
Tabel 7. Diferensiasi diantara Mycobacterium tuberculosis complex
Kata- Hidro- Kepe-

Pyra-
lasa lisa kaan
Species Niasin Nitrat zinami- Urease
tahan tween pada
dase
panas 10 hari TCH
M. tubercu-
Pos Pos Neg/pos Pos Pos/Neg Neg/Pos Resisten
losis
M. bovis Neg Neg Neg Neg Pos/Neg Neg/Pos Peka
M. africa- Pos/
Neg Neg Pos Pos Neg Variabel
num Neg
Pos/ Neg/
M. microti Neg Pos Pos/Neg Neg/Pos Variable
Neg Pos
Untuk keperluan praktis, diferensiasi spesies Mycobacterium tuberculosis complex tidak
harus dilakukan
45
Sebagian besar Mycobacterium tuberculosis complex dapat dibedakan dengan
Mycobacterium lain menggunakan uji Niasin dan PNB, sehingga untuk melakukan
identifikasi Mycobacterium tuberculosis minimum menggunakan 2 uji tersebut.
Gambar 7. Alur Kerja Identifikasi Rutin
*Subkultur hanya dilakukan apabila

• jumlah koloni tidak memadai (<1+) atau
• bila ditemukan beberapa koloni dengan bentuk yang berbeda
47
d. Periksa kekentalan, warna dan volume dahak. dahak yang baik untuk Catatan :
pemeriksaan adalah berwarna kuning kehijau–hijuan (mukopurulen), kental,
dengan volume 3 – 5 ml. • Hasil yang dilaporkan adalah hasil pembacaan hari yang ke-28 apabila
e. Jika dahak tidak dapat diinokulasikan dalam 3 (tiga) hari, tambahkan bahan isolat menunjukkan resisten pada semua OAT. Hasil yang sensitif untuk
pengawet CPC 1% dalam NaCl 2%, sama banyak dengan dahak ke dalam pot. laporan harus menunggu pembacaan hari ke-42.
Tutup pot dengan rapat. Dahak harus disimpan pada suhu ruang dan diproses
Hasil uji kepekaan yang benar sangat bermanfaat sebagai panduan pengobatan
untuk biakan dalam waktu kurang dari seminggu. Untuk dahak yang dapat
diperiksa dalam 3 x 24 jam, tidak perlu memakai CPC, cukup disimpan dalam penderita. Telah dibuktikan bahwa jika proporsi isolat Mycobacterium tuberculosis
keadaan dingin dengan suhu 6-100C. resisten lebih dari 1% terhadap satu obat, maka pemakaian obat tersebut untuk tujuan
pengobatan tidak akan tercapai.
• Bubuk CPC adalah senyawa higroskopis, bubuk yang telah menjadi basah
harus dianggap kadaluwarsa, Terdapat dua pendekatan untuk melakukan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis
• CPC merupakan desinfektan turunan amonium quartener, terhadap OAT, yaitu: uji fenotifik dan uji genotipik (molekuler). Uji fenotifik merupakan
• Dahak yang dicampur CPC akan menjadi encer setelah paparan 24 jam, pengujian atas fakta biologis dari kuman Mycobacterium tuberculosis, sedangkan uji
• CPC residu yang tidak dinetralisasi akan menghambat pertumbuhan genotipik merupakan pengujian atas keberadaan gen-gen Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis terutama pada media berbahan dasar agar. yang telah mutasi pada tempat tertentu.
• Sedapat mungkin, hindari pemakaian CPC. Mycobacterium tuberculosis
akan mati jika terlampau lama terpapar pada CPC atau jika konsentrasi CPC Saat ini telah ditemukan berbagai cara untuk melakukan uji kepekaan, setiap cara
lebih dari 1% mempunyai kekurangan dan kelebihan. Dari berbagai cara yang tersedia, tujuh cara
yang paling sering digunakan adalah :
f. Dahak SPS diperiksa secara mikroskopis dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen
g. Bila yang terkumpul diduga bukan dahak (hanya air liur/ ludah) atau dahak 1. Cara proporsi,
volumenya kurang, petugas harus meminta agar penderita batuk lagi sampai 2. Cara konsentrasi absolut,
volumenya mencukupi. 3. Cara rasio resisten,
Catatan: 4. Cara media cair,
1) Setelah mengolah spesimen petugas harus cuci tangan dengan sabun dan air 5. Cara deteksi perubahan metabolik,
mengalir 6. Cara mycobacteriophaga dan
2) Jika tidak ada dahak yang keluar, pot dahak dianggap sudah terpakai. 7. Cara molekuler.
Masukkan dalam kantong plastik dan harus dimusnahkan untuk menghindari
kemungkinan terjadinya kontaminasi oleh kuman TB Dari semua cara tersebut, cara proporsi, konsentrasi absolut dan rasio resisten
merupakan cara yang paling banyak dipakai. Ketiga cara tersebut menggunakan media
Tata cara merujuk spesimen :
padat yaitu dengan membandingkan pertumbuhan isolat Mycobacterium tuberculosis
1) Sebelum dikirim, hubungi dahulu laboratorium rujukan
dengan kuman kontrolnya. Hal yang paling kritis untuk ketiga cara tersebut adalah
2) Pengemasan dan pengiriman bahan rujukan dilakukan sesuai standar. Apabila
jumlah dan viabilitas kuman dan homogenitas inokulum.
tidak tersedia bahan kemasan sesuai standar, maka lakukan:
49
Cara proporsi unggul dalam hal pengendalian besaran inokulum, dengan catatan VII. PRAKTEK LABORATORIUM
proses homogenisasi inokulum yang diambil dari koloni yang kering harus lebih
Praktek laboratorium akan dititikberatkan pada biakan dan identifikasi Mycobacterium
lama atau melakukan subkultur lebih dahulu. Cara proporsi kurang mengantisipasi
tuberculosis complex dari spesimen dahak dengan menggunakan media padat berbahan
potensi kesalahan konsentrasi obat. Untuk OAT lini pertama, ketiga cara diatas telah
telur. Dipilih sasaran Mycobacterium tuberculosis complex karena spesies terbanyak dari
terstandarisasi dengan baik. Tingkat ketepatannya sangat tinggi untuk rifampisin dan Mycobacterium tuberculosis complex pada dahak adalah Mycobacterium tuberculosis
isoniazid diikuti oleh etambutol dan streptomisin. dan identifikasi sampai tingkat spesies tidak mudah. Dipilih spesimen dahak karena
merupakan spesimen terbanyak dan menjadi titik berat program pengendalian TB di
Saat ini berbagai penelitian terus berlangsung untuk mendapatkan cara biakan dan
Indonesia dan menggunakan media padat berbahan telur, karena media ini yang paling
uji resistensi Mycobacteria yang hasilnya cepat. Media yang dipakai merupakan media
banyak digunakan di Indonesia serta relatif murah.
cair, sebagian diantaranya menggunakan faktor yang mempercepat pertumbuhan
kuman. Pertumbuhan pada media cair lebih cepat dibandingkan media padat, namun A. Pengambilan, Pengiriman dan Penerimaan Spesimen
kemungkinan adanya cemaran harus dibuktikan dengan pewarnaan dan biakan lanjutan
Spesimen dahak
dengan agar darah.
1. Alat dan bahan yang diperlukan
a. Pot dahak steril bertutup ulir dan mulut lebar (diameter 4-5 cm)
b. Formulir permintaan pemeriksaan
c. Kantong plastik dengan pengaman (Clipped)
d. Stiker atau penanda tahan luntur
e. Pipet dengan bulb
f. Bahan pengawet Cetyl Piridinium Chloride (CPC) 1% digunakan apabila kultur
dikerjakan setelah 72 jam tanpa adanya fasilitas pendingin
2. Cara pengumpulan dahak :
a. Persiapkan pot dahak dengan nomor identitas pada stiker atau pada dinding pot
sebelah luar. Nomor identitas sesuai dengan pedoman nasional.
b. Pada waktu pasien datang, lakukan pengambilan dahak sewaktu. Pasien dibekali
dengan 2 pot dahak dan instruksikan untuk mengumpulkan dahak pagi hari,
dahak ke 3 (SPS) dikumpulkan pada saat pasien datang keesokan harinya.
c. Instruksikan pasien mengeluarkan dahak serta menampungnya dalam pot
dahak di ruang terbuka yang jauh dari pemukiman atau dalam ruang khusus
pengumpulan dahak.
Dahak terbaik untuk biakan adalah dahak yang dikeluarkan pertama kali saat
bangun pertama di pagi hari.
51
dalam inspisator yang telah dipanaskan sampai suhu 850C selama a) Masukkan pot dahak dalam kantong plastik, kemudian “sealed”. Tiap
45 menit (lakukan optimasi inspisator) Keluarkan dari inspisator, pot dahak memerlukan satu kantong plastik
tutup botol dikencangkan dan diamkan sampai suhu kamar b) Letakkan/masukkan pot dahak yang sudah berada dalam kantong
c) Bila kualitas media tidak baik : terlalu lembek, terjadi perubahan plastik pada kotak / box (styrofoam, plastik atau bahan lain yang tidak
mudah pecah) dengan posisi tegak, menghadap ke atas. Masukkan
warna, berlubang-lubang, atau terdapat gelembung-gelembung
formulir kedalam kantong plastik, sealed masukkan kedalam kotak/
pada permukaan, maka media tersebut tidak dapat dipakai.
box tadi, dan selanjutnya dikirim ke laboratorium rujukan.
Catatan : c) Kotak/box harus ditutup rapat dan diberi seal serta cantumkan nama
1. Media LJ dapat memakai potato meal atau tidak dan alamat laboratorium rujukan dan laboratorium pengirim. Beri
2. Jika membuat dari media komersial, ikuti petunjuk dari pabrik tanda peringatan agar jangan dibalik.
d) Rujukan spesimen dahak
3. Untuk membuat larutan malachite green tersendiri. Lakukan sebagai berikut :
a. Timbang 2 gram Malachite green kristal dalam gelas kimia. - Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/uji kepekaan yang dapat ditempuh dalam 48
a. Tuang ke dalam mortir, gerus sampai halus, masukkan kembali ke dalam jam, kemasan dahak dikirim dalam suhu kamar.
gelas kimia dan tambah aquadest 100 ml.
- Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/ uji kepekaan yang berjarak tempuh 72 jam,
b. Masukkan magnetic stirrer, tempatkan di atas stirring hot plate , inkubator
kemasan dahak dikirim dalam suhu 4-80C dengan cara memasukkan pot dahak
selama 2 jam atau suhu kamar semalaman agar larut sempurna kedalam kemasan yang berisi ice pack.
c. Saring dengan kertas saring Whatmann no 4.
d. Simpan dalam botol coklat, catat tanggal pembuatan pada label. - Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/ uji kepekaan yang memakai mesin MGIT, dahak
e. Larutan tahan 1 bulan pada suhu kamar, tetapi sebaiknya digunakan dalam tidak boleh diawetkan dengan CPC 10% karena akan mengganggu pembacaan
oleh mesin.
waktu 1 minggu
- Apabila memungkinkan, laboratorium dapat menjamin kualitas contoh uji dengan
c. Kultur Mycobacterium tuberculosis dapat pula dilakukan pada media Ogawa
menjaga suhu pada 4-8 0C segera setelah contoh uji diterima oleh laboratorium.
3% yang telah dimodifikasi ( inokulasi pada media ini tak perlu netralisasi
dengan HCl atau PBS, cukup homogenisasi dengan NaOH 4%) 3. Cara penerimaan spesimen rujukan :
1) Bahan a. Spesimen diterima di bagian penerimaan di laboratorium

Modified Acidified b. Periksa kesesuaian identitas pada kemasan dan formulir permintaan
a. KH2PO4 10.0 gr 15 gr c. Catat data dalam buku register
b. Magnesium sitrat 0.5 gr Tidak ada d. Bila ada ketidak sesuaian identitas dan kualitas, segera hubungi pengirim untuk
c. Na Glutamat 2.5 gr 5 gr klarifikasi. Jika perlu mintakan lagi dahak pagi hari
d. Glyserol 20 ml 30 ml e. Kemasan dibuka dalam BSC
e. 2% Malachite green 20 ml 30 ml f. Gunakan sarung tangan saat menerima dan membuka kemasan contoh uji
f. Aquadest steril 500 ml g. Periksa apakah ada kebocoran pada kemasan contoh uji, jika terlihat ada
kebocoran kemasan harus langsung dibuang ke tempat sampah yang sudah
53
diberi desinfektan dan selanjutnya di otoklaf. 2) Bilas dengan air mengalir hingga bersih, kemudian keringkan
h. Bila pot dahak ada yang pecah, lakukan desinfeksi pot dahak yang lain dengan 3) Rendam dalam alkohol 70% selama 15 menit
kapas yang sudah dibasahi desinfektan. 4) Cuci dan desinfeksi tangan sebelum memegang telur yang telah bersih
B. Pembuatan Media Lowenstein-Jensen dan kering

5) Pecahkan telur dan tampung dalam gelas ukur steril
1. Alat dan bahan yang diperlukan untuk membuat media : 6) Homogenisasi dengan blender, atur kecepatan sedemikian rupa agar
Alat : tidak terbentuk gelembung.
a. Timbangan analitik j. pH meter 7) Saring larutan telur menggunakan corong steril yang telah dialasi kasa
b. Spatula / sendok k. Otoklaf steril.
c. Gelas ukur 1000 ml steril l. Inspisator/ Hot Air Oven 8) Ukur dengan gelas ukur steril sampai didapatkan 1 liter.
d. Gelas beaker 1000 ml steril m. Blender stainless steel 9) Catatan :
e. Pipet 10 ml, 25 ml steril n. Magnetic stirrer & magnetic bar steril
a) Tidak diperkenankan menggunakan telur dari peternakan yang
f. Labu Erlenmeyer 250 ml, 1000 o. Corong steril
menggunakan antibiotika dalam pakannya. Karena umumnya
ml steril p. Kain kasa steril
g. Botol McCartney q. Lap pembersih telur peternakan bebek dilakukan secara tradisional, telur bebek lebih
h. Bunsen kecil kemungkinannya mengandung antibiotika.
i. Power pipet/pipetor b) Homogenisasi telur agar dilakukan dalam laminar flow/ BSC, untuk
Bahan : meminimalisasi pencemaran oleh mikroba udara.
a. Bahan dasar Medium LJ dengan komposisi : b. Pembuatan media LJ :

1) Potassium dihydrogen phosphate : 2,5 gr 1) Larutkan garam-garam, L-Asparagine ( dan potato meal ) media LJ dalam
2) Magnesium sulfate heptahydrate : 0.24 gr
600 ml aquades, pH 6.8-7.0
3) Tri-magnesium dicitrate 14-hydrate : 0.6 gr
2) Tambahkan 12 ml glycerol
4) L-asparagin : 3.6 gr
3) Tambahkan 20 ml larutan malachite green 2%
5) Potato meal : 30 gr
6) Malachite green2 % : 20 ml 4) Setelah tercampur sempurna, sterilkan dalam otoklaf selama 15 menit
b. Aquadest : 600 ml pada suhu 1210C
c. Glyserol : 12 ml 5) Dinginkan sampai suhu + 500C
d. Telur homogen sampai dengan : 1000 ml 6) Tambahkan telur homogen 1 liter yang telah dipersiapkan secara
steril, aduk perlahan-lahan, hindari terbentuknya gelembung. Jika ada
Cara pembuatan Media LJ : gelembung, diamkan beberapa waktu lamanya untuk menghilangkan
a. Homogenisasi telur : gelembung.
1) Bersihkan telur ayam/bebek segar yang berumur tidak lebih 7 hari dengan a) Tuangkan ke dalam botol McCartney steril sebanyak 6 – 8 ml.
cara menggosoknya dengan lap, air dan sabun b) Tutup botol dengan longgar dan letakkan pada kemiringan 300
55
media. Hal ini dianjurkan jika pengolahan dahak dilakukan pada g. Telur bebek (homogenisasi 1000 ml
tabung 15 ml. dengan blender dan disaring
melalui kain kasa)
d. Pengolahan dengan dengan N-Acetyl –L-cystein-NaOH( NALC-NaOH) h. pH akhir 6,4 6,2
1) Tuang contoh uji ke dalam tabung sentrifus 50 ml
2) Ditambah NALC – NaOH sama banyak 2) Cara kerja
3) Kocok sampai homogen, tidak lebih dari 30 detik dan diamkan selama 15 a) Pembuatan larutan garam
menit pada suhu kamar. (1) Masukkan KH2PO4 dan Na Glutamat ke dalam labu
4) Tambah PBS sampai volume 45 ml. Bolak-balik tabung beberapa kali erlenmeyer, larutkan dengan aquadest.
5) Timbang agar posisi pada waktu sentrifus seimbang. (2) Homogenkan di atas hot plate dengan magnetic stirrer
6) Centrifuge selama 20 menit, 4 C, 3000 g o
sampai larut sempurna.
7) Buang supernatant kemudian ditambah 1 ml PBS (3) Otoklaf 121oC selama 15 menit, biarkan dingin
8) Inokulasi pada 2 media LJ sebanyak 100 μl (4 tetes pipet plastik vol 1 ml)
(4) Ke dalam erlenmeyer yang telah berisi beberapa glass beads
9) Inkubasi pada suhu 37oC.
(diameter 3mm) masukkan glyserol dan malachite green
Catatan : kemudian lakukan homogenisasi.
Pembuatan larutan Natrium sitrat (5) Campurkan larutan (1) ke dalam larutan (4)
i. Timbang 29 g Natrium sitrat dihidrat atau 26 g Na-sitrat anhidrat,
b) Pembuatan media
larutkan dalam 1000 ml aquades
(1) Campur 1000 ml telur yang telah dihomogenisasi dengan
ii. Buat larutan NaOH 4% seperti di atas
iii. Campur sama banyak larutan Natrium sitrat dan NaOH. larutan garam dengan magnetic stirrer, diamkan selama 30
iv. Otoklaf 121oC selama 15 menit. Dinginkan di suhu ruang menit.
v. Simpan di lemari es (2) Tuang ke dalam botol Mac Cartney kira - kira 6-8 ml, letakkan
botol dalam rak dengan kemiringan 30o.
Larutan NALC-NaOH dibuat sbb :
(3) Masukkan dalam inspisator 80-85oC selama 45 menit.
Larutan ini harus selalu dibuat baru setiap kali akan melakukan
(4) Dinginkan pada suhu kamar.
pemeriksaan (tidak bisa disimpan > 24 jam ). Pembuatan sesuai
kebutuhan, dan sesuai dengan tabel : C. Biakan Mycobacterium tuberculosis
Tabel 9. Pembuatan larutan sesuai dengan kebutuhan: Alat dan bahan yang diperlukan:
N-Acetyl cystein Stok A ( ml ) Stok B ( ml ) 1. Untuk pengolahan bahan pemeriksaan
ml
( gr ) NaOH 4% Na Citrat 2,9%
a. Tabung sentrifus 50 ml
5 0,025 2,5 2,5
50 0,25 25 25 b. Rak tabung
100 0,5 50 50 c. Biocontained-centrifuge pada gaya gravitasi 3000 g (bukan 3000 rpm)
57
2. Untuk inokulasi Catatan :
a. Media LJ • PBS dapat dibuat dalam bentuk konsentrat 10x. Untuk itu
b. Pipet pasteur steril atau mikropipet 100 ul timbang bahan 10 kali lipat. Larutan kerja dibuat dengan jalan
menambahkan 1 bagian volume PBS 10 x dengan 9 bagian
c. Tip mikropipet
volume aquades,pH 7.0
3. Inkubator
• HCl adalah asam kuat. Jika terjadi tumpahan, segera siram
4. BSC Class II dengan air sebanyak mungkin
Cara pengolahan dahak c. Pengolahan dengan NaOH 4%

1. Dahak tanpa CPC diolah sebagai berikut : 1) Tuangkan dahak ke dalam tabung sentrifus 50 ml. Jika lebih dari 10 ml,
a. Pembuatan larutan NaOH 4% (1 N) pilih 10 ml bagian yang purulen.
1) Timbang 4 g pelet NaOH kering (jangan biarkan botol NaOH terbuka 2) Tambahkan NaOH 4% sama banyak
karena NaOH sangat higroskopis). Gunakan APD (kaca mata, lab jas, 3) Campur dengan vortex mixer sampai homogen. Diamkan dalam
sarung tangan) saat menimbang NaOH karena NaOH bersifat kaustik suhu ruang tidak lebih dari 15 menit (jika lebih lama, kuman akan mati
kuat. 4) Tambahkan larutan PBS sampai volumen > 45 ml dengan menggunakan

pipet. (Jika menuang PBS dari botol, gunakan botol dengan volumen 100
2) Masukkan ke dalam beaker yang berisi 100 ml akuades. Beaker akan
ml, buang sisa PBS.)
menjadi panas.
5) Tutup tabung dengan rapat, sentrifus minimal 3000 g selama 15-20 menit
3) Biarkan menjadi dingin
6) Tuangkan supernatan ke dalam wadah berisi desinfektan. Usap bibir
4) Pindahkan ke dalam botol dan masukkan ke dalam otoklaf 121oC selama tabung dengan 95% etanol (jangan sampai masuk ke dalam tabung ).
15 menit. Volume NaOH tiap botol upayakan tidak lebih dari 100 ml 7) Tambahkan 1 ml PBS ke dalam sedimen, kocok agar homogen.
5) Simpan di suhu ruang 8) Olahan contoh uji siap diinokulasikan. Jangan lupa membuat sediaan
b. Pembuatan 0.067 M PBS pH 6.8 untuk diwarnai dengan ZN pada sisa inokulum
1) Timbang Na2HPO4 anhidrat 9.47 g, larutkan dalam 1000 ml aquades atau Catatan :
timbang Na2HPO4 12H2O 23.68 gr dan dilarutkan dengan 1000 ml aquadest • Jika dalam evaluasi ternyata 4% NaOH terlampau kuat, ganti
2) Timbang 9.07 g KH2PO4, larutkan dalam 1000 ml aquades, campur, dengan NaOH 2%. Selalu gunakan larutan steril untuk mencegah
masukkan dalam botol bertutup ulir. cemaran Mycobacteria lingkungan. NaOH adalah senyawa
3) Atur pH dengan menambahkan sedikit asam atau basa agar higroskopis. Bubuk yang sudah lembab sebaiknya tak dipakai.
mencapai pH 6.8 Apabila menggunakan NaOH 4% dan angka cemaran mencapai
4) Otoklaf 121 oC selama 15 menit, dinginkan di suhu ruang, simpan di lemari >5% ganti menjadi NaOH 6%
es • Jika menggunakan medium Ogawa 3% untuk inokulasi, setelah
dihomogenisasi dengan NaOH 4% dan didiamkan selama 15
menit, contoh uji yang sudah diolah langsung ditanam pada
59
Mycobacterium tuberculosis mempunyai sifat : 200 1,0 100 100
Tidak terjadi perubahan warna koloni setelah terpapar cahaya 300 1,5 150 150
Uji akumulasi niasin positif 500 2,5 250 150
Uji reduksi nitrat positif 1000 5 500 500
Uji katalase tahan panas 68°C negatif 2. Dahak dengan CPC diolah sebagai berikut :
Uji PNB negatif a. Tuangkan dahak yang sudah bercampur CPC ke dalam tabung sentrifus.
b. Campur sampai homogen dengan menggunakan vortex, tunggu 10 menit agar
F. Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
tidak terjadi aerosol. Dahak yang telah seluruhnya mencair dan homogen, tak
Identifikasi Mycobacterium tuberculosis harus dikerjakan pada isolat subkultur yang perlu di vortex
berumur 2-3 minggu. Bila koloni terkontaminasi, lakukan dekontaminasi dan subkultur c. Tambahkan PBS steril sampai tanda batas tertinggi pada tabung sentrifus.
ulang atau subkultur saja jika koloni terduga Mycobacterium tuberculosis terpisah dari d. Sentrifus pada 3000 g selama 15 menit, tunggu/diamkan sampai 15 menit
koloni cemaran. Tidak satupun uji tunggal yang dapat dengan pasti membedakan
e. Buang supernatan.
Mycobacterium tuberculosis dengan Mycobacteria lainnya, teknik molekuler paling
f. Campur endapan dengan menggunakan vortex, tunggu 10 menit agar tidak
spesifik untuk hal ini. Jika kondisi laboratorium masih tidak memadai, identifikasi
terjadi aerosol.
Mycobacterium tuberculosis minimal didasarkan pada hasil pewarnaan, kecepatan
g. Tambahkan PBS dengan pH 7,2 sampai tanda batas tertinggi pada tabung
tumbuh, morfologi koloni, uji PNB dan uji niasin.
sentrifus.
Beberapa uji identifikasi yang dapat digunakan adalah sebagai berikut : h. Sentrifus pada 3000 g selama 15 menit , tunggu/diamkan sampai 15 menit.
i. Buang supernatan.
1. Uji Niasin
j. Tambahkan 1ml larutan PBS pH 7,2, campur sampai homogen dengan
Semua mycobacteria menghasilkan asam nikotinat waktu tumbuh. Kebanyakan
menggunakan vortex, diamkan 10 menit untuk menghindari adanya aerosol.
galur Mycobacterium tuberculosis dan beberapa galur M. simiae dan M. chelonae
tidak mampu memetabolisme asam nikotinat tersebut. Asam nikotinat terakumulasi k. Sedimen siap digunakan untuk diinokulasikan pada media.
dalam media. Jumlah asam nikotinat yang dibentuk terbanyak pada media LJ dan
Inokulasi bahan pada media :
bukan media lain. Karena itu uji niasin memerlukan isolat yang koloninya penuh
pada media LJ. Udara saat biakan sangat penting dalam metabolisme niasin, karena 1. Pipet 100 ul sedimen ke dalam media LJ, buat duplo
itu tutup tabung biakan harus sedikit longgar selama proses inkubasi. 2. Tutup botol, tetapi jangan terlalu rapat
3. Sebar secara merata bahan pemeriksaan tersebut di atas permukaan media dengan
Uji Niasin dengan Chloramine T
cara menggerak-gerakkan botol
Alat dan bahan yang diperlukan
4. Letakkan botol-botol pada rak dengan kemiringan 300 selama 24 jam pada incubator
a. Tabung reaksi 5 ml
b. Ose/sengkelit dengan suhu 35 - 370C.
c. Pipet steril dengan bulb 5. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung dengan
d. Otoklaf posisi tegak dan lanjutkan inkubasi.
61
6. Amati pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis setiap minggu. E. Subkultur Isolat Mycobacterium tuberculosis
Pengamatan dilakukan sampai 8 minggu. Hasil negatif dinyatakan jika tak ada
Subkultur diperlukan untuk memurnikan koloni dan meremajakan kuman sebelum
pertumbuhan setelah 8 minggu. Untuk contoh uji yang berasal dari kasus yang
dilakukan uji kepekaan terhadap OAT, uji identifikasi dan jika akan disimpan pada -70oC
telah mendapat OAT atau pausibasiler, dianjurkan diinkubasi sampai 12 minggu
Alat dan bahan yang diperlukan :
Tanda khas koloni Mycobacterium tuberculosis adalah :
1. Media LJ
a. Akan tampak pertumbuhan dalam waktu 2 – 4 minggu
2. Tabung reaksi dengan tutup ulir
b. Koloni bewarna putih kekuning-kuningan (buff coloured), permukaan kering dan
3. Glass beads, diameter 1.5-3 mm
rapuh dengan tepi yang tidak beraturan (seperti bunga kol)
4. Vortex mixer
c. Konfirmasi dengan membuat sediaan dari koloni dengan pewarnaan Ziehl
5. Aquades steril
Neelsen. Mycobacterium tuberculosis akan memberikan gambaran BTA yang
6. Micropipette 100 μl
bergerombol berbentuk khas (serpentine cord, typical cord). Bila hasil BTA
7. Tip mikropipet
negatif, tidak dilanjutkan dengan subkultur
7. Lakukan pengamatan pertumbuhan koloni setiap minggu Cara kerja :
8. Catat hasil pengamatan setiap minggu pada buku catatan biakan 1. Pilih hasil biakan dengan pertumbuhan koloni yang paling baik untuk dilakukan
subkultur, minimal satu untuk tes niacin, satu untuk uji PNB, satu untuk disimpan
D. Pembacaan Hasil Biakan
pada -70 oC dan satu untuk uji kepekaan.
PEMBACAAN PENCATATAN
2. Ambil koloni sebanyak 1 (satu) sengkelit penuh
> 500 koloni 4+ 3. Masukkan dalam tabung reaksi yang telah diisi dengan 1 ml aquadest steril dan
200 – 500 koloni 3+
glass bead, tutup tabung reaksi.
100 – 200 koloni 2 +
4. Homogenisasi dengan menggunakan vortex mixer selama ± 1 menit
20 – 100 koloni 1 +
1 – 19 koloni Jumlah koloni 5. Diamkan minimal selama 15 menit
Tidak ada pertumbuhan Negatif 6. Ambil suspensi kuman dari bagian terbawah 1/3 atas sebanyak 100 μl. Lakukan
inokulasi pada setiap botol Mc Cartney yang telah berisi media LJ, botol ditutup
Keterangan :
kembali.
- Bila terdapat kontaminasi pada biakan, laporkan segera dan ulangi pembuatan
7. Sebarkan inokulum secara merata di atas permukaan media dengan cara
biakan
menggerak-gerakkan botol
- Bila biakan POSITIF dan pertumbuhan dinilai sebagai Mycobacterium
8. Tutup botol dilonggarkan, letakkan pada rak dengan kemiringan 300, simpan
tuberculosis, laporkan segera pada pihak yang berkepentingan
dalam inkubator dengan suhu 35 - 370C selama 24 jam
- Pada minggu ke 4 dapat dibuat laporan sementara
9. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung
- Pada minggu ke 8 dibuat laporan akhir (final)
dengan posisi tegak dan lanjutkan inkubasi sampai 2-3 minggu
10. Amati pertumbuhan tiap minggu
63
3. Dalam cairan asam, sianogenbromida akan menghidrolisis e. Larutan Chloramin T 5%
hydrocyanic acid yang mudah menguap dan sangat toksik. f. Larutan KCN 1%
Buanglah semua tabung reaksi ke dalam larutan disinfektan g. NaOH 4 %
yang alkalis dengan menambahkan sama banyak larutan 10 h. Kontrol positif biakan Mycobacterium tuberculosis H37RV
% NaOH
Cara kerja :
Catatan a. Tambahkan 1 ml aquadest steril pada subkultur Mycobacterium
Kristal sianogen bromida sangat sukar larut. Karena itu tuberculosis dengan jumlah koloni penuh/hampir penuh
pembuatan larutan sianogen bromida dapat juga dilakukan b. Gores media LJ dengan menggunakan ose steril sampai terbelah
dengan menambahkan 50 ml air dalam botol berisi 25 gr c. Masukkan pada otoklaf 1210 C selama 60 menit dengan posisi
sianogen bromida dan dibiarkan minimal semalam. Sianogen horizontal sehingga semua cairan menutupi permukaan media
bromida yang terlarut mempunyai konsentrasi sekitar 10% d. Keluarkan botol dari otoklaf dan letakkan pada posisi tegak, diamkan
selama 5 menit
Cara kerja
e. Pipet 0,5 ml cairan ekstrak dan masukkan ke dalam tabung reaksi 5ml
1. Tambah 1-2ml aquades atau 0.85% NaCl kedalam botol biakan yang
f. Tambahkan 0,5 ml larutan Chloramin T 5%
koloninya penuh
g. Tambahkan 0,5 ml larutan KCN 1%
2. Gores media sampai terbelah
h. Campur sampai homogen. Amati perubahan warna sampai 5 menit
3. Biarkan selama satu malam
4. Ambil 1 ml cairan , tambah sama banyak berturut-turut larutan 4% anilin Positif : terbentuk warna kuning
dan larutan 10% sianogen bromida Negatif : tidak berwarna
5. Amati timbulnya warna kuning setelah 5 menit Sebelum isi tabung dibuang, lakukan netralisasi dengan menambahkan
NaOH 4%
Catatan :
Gunakan kontrol pada tiap pengerjaan. Kontrol positif menggunakan biakan i. Bila koloni mempunyai ciri-ciri spesifik tetapi hasil tes Niacin negatif,
Mycobacterium tuberculosis H37RV. Kontrol negatif menggunakan media maka tes Niacin diulang
LJ yang tidak ditanami spesimen/media steril
Uji Niasin dengan Paper Strip
Asam nikotinat akan berdifusi ke dalam media. Jika permukaan media
a. Pilih paper strip yang telah direkomendasikan oleh WHO atau yang
penuh dengan koloni kuman, maka proses ekstraksi asam nikotinat dengan
hasil meta analisisnya paling sensitif
aquades/dapar akan terganggu. Itu sebabnya media harus tergores.
Jumlah koloni yang terlampau sedikit juga menyebabkan negatif palsu. b. Ikuti prosedur dari pabrik.
Pakailah subkutur dengan jumlah koloni minimal 50 Uji Niasin dengan Anilin atau Benzidine
Warna kuning akan lebih jelas jika pencampuran reagensia dan suspensi Bahan
kuman dilakukan perlahan-lahan. Warna kuning akan tampak sebagai 1. Larutan anilin 4% atau benzidine 3% dalam etanol 95%
cincin diantara kedua larutan. Jika terkocok, warna kuning akan terencerkan a. Catatan cara pembuatan
menjadi lebih pudar.
65
• Oleh karena anilin atau benzidine dapat berubah warna alumunium foil, tulis berat yang tertera pada secarik kertas
bila terpapar dengan udara dan cahaya, sebaiknya larutan 3. Masukkan 5 g kristal sianogenbromida dalam gelas beaker
dipersiapkan dengan segar sewaktu diperlukan.Gunakan anilin berpenutup allumunium foil tersebut
atau benzidine yang jernih dan tidak berwarna. 4. Tambahkan akuades dalam gelas beaker sejumlah 10x berat
• Campur dan kocok anilin atau benzidine dengan etanol dalam kristal sianogenbromide yang tertimbang
botol berwarna coklat untuk menghindari udara dan cahaya . 5. Tutup gelas beaker dengan alumunium foil dan letakkan pada
lemari asam pada suhu kamar selama 24 jam sampai kristal
b. Penyimpanan reagen
sianogenbromide larut dalam air
1. Simpan dalam botol coklat
6. JANGAN lewatkan larutan pada api bunsen
2. Label tiap botol dengan nama reagen, dan tanggal pembuatan
7. Tuangkan hati-hati dalam botol warna coklat kemudian tutup
reagen
rapat
3. Simpan ditempat yang gelap dan dalam lemari pendingin
8. Simpan dalam lemari pendingin.
4. Jangan gunakan larutan anilin yang warnanya telah berubah
9. Bila akan dipakai, hangatkan dahulu pada suhu kamar untuk
menjadi kuning
melarutkan presipitat yang terjadi selama penyimpanan.
c. Kendali mutu 10. Buatlah larutan secukupnya oleh karena sianogenbromide
1. Reagen tidak berwarna mudah menguap dan akan kehilangan potensinya selama
2. Buang reagen bila larutan berubah warna menjadi kuning atau penyimpanan
terdapat endapan
c. Penyimpanan reagen
d. Keamanan kerja 1. Simpan dalam botol coklat dan botol harus ditutup dengan rapat
1. Anilin merupakan onkogenik dan dapat penetrasi melalui kulit. oleh karena larutan ini mudah menguap. Penguapan dapat
2. Bekerjalah dengan memakai sarung tangan dan dengan hati- mengurangi potensi larutan ini dan akan memberikan hasil
hati negatif palsu.
3. Kerjakan dalam lemari asam 2. Label tiap botol dengan nama reagen dan tanggal pembuatan
reagen
2. SianogenBromida 10% 3. Simpan dalam lemari es
a. Bahan
1. Kristal sianogenbromide 5 gr d. Keamanan kerja
2. Akuades 50 ml 1. Sianogenmerupakan lacrimator kuat dan toksik bila dihirup;
b. Cara pembuatan bekerjalah dalam lemari asam selama pembuatan reagen dan
1. Kerjakanlah dalam lemari asam atau dalam BSC dengan dalam BSC selama melakukan uji biokimiawi
penghisap udara. Hindari kontak yang terlalu lama dengan 2. Sianogenbersifat onkogenik dan dapat penetrasi melalui kulit,
kristal sianogenbromide selama proses penimbangan oleh karena itu bekerjalah dengan memakai sarung tangan dan
2. Timbang gelas beaker kosong yang sudah ditutup dengan dengan hati-hati
67
1) Larutan stok Metode ekstraksi asam nikotinat dari medium bermacam-macam. Ada
0.067M Na2HPO4 anhidrat (9.47 g dalam 1000 ml aquades) yang mengekstraksi pada suhu ruang selama 30 menit atau 24 jam dalam
0.067M KH2PO4 (9.07 g dalam 1000 ml aquades) inkubator, pendidihan bahkan otoklaf. Tiap lab dapat melakukan optimasi
0.067M Na3PO4 (25.47 Na3PO4.12H2O dalam 1000 ml aquades) dengan kuman standar.
1% phenophtalein (1 g dalam 100 ml aquades) Uji niasin dengan menggunakan anilin dan sianogen bromida merupakan
1% bromthymolblue (1 g dalam 100 ml etanol 95%) cara terbaik dibandingkan kedua cara lain.
0.01% bromthymolblue (1 ml larutan no 5 dalam 99 l aquades)
2. Uji Katalase Tahan Panas
2) Dapar kerja Katalase akan menghidrolisis hirogen peroksida menjadi air dan oksigen. Gas
Campur 35 ml larutan stok 1 dengan 1.5 ml larutan stok 2 dan 100 ml oksigen akan menyebabkan timbulnya gelembung-gelembung dalam larutan. Semua
larutan stok 3 diatas
Mycobacteria, kecuali beberapa galur Mycobacterium tuberculosis yang resisten
3) Cara membuat larutan standar isoniazid dan M. bovis menghasilkan katalase dalam jumlah dan sifat tahan panas yang
Deretkan 8 tabung bersih yang sama dengan tabung uji. berbeda. Pengujian jumlah dilakukan dengan uji katalase semikuantitatif, sedangkan
Masukkan 2 ml dapar kerja dalam tiap tabung, kecuali tabung 1 sifat tahan panasnya diuji pada suhu 68oC. Mycobacterium tuberculosis dan beberapa
Buat larutan 7 dengan cara mencampur 0.1ml larutan stok 4 dengan 0.2 mycobacteria lainnya kehilangan aktifitasnya jika dipanaskan sampai 68 oC.
ml larutan stok 6 dan 9.7 ml dapar kerja ( ini standar +5 )
Alat
Kedalam tabung nomor 2, masukkan 2 ml larutan stok 7, kocok ( ini
menjadi standar +4 ). a. Tabung reaksi 20 x 125 mm
Ambil 2 ml dan pindahkan ke tab no 3, kocok ( standar +3). b. Aplikator steril/ ose
Ambil 2 ml dari standar+3, pindahkan ke tabung no 4, kocok ( stan- c. Waterbath/ penangas air
dar +2 ). Lakukan hal sama untuk standar +1 dan 0.
d. Pipet ( otomatik )
Buang kelebihan 2 ml dari standar 0.
Otoklaf dan simpan pada lemari es Reagen
a. Buffer Phosphat 0,067 M pH 6.8
Cara kerja
1) Timbang 9.47 g Na2HPO4, larutkan dalam 1000 ml aquades, sterilkan
a Masukkan 0,2 ml 0.85% larutan NaCl dalam tabung
dengan otoklaf
b Ambil 2 sengkelit penuh koloni ,
2) Timbang 9.07 g KH2PO4, larutkan dalam 100 ml aquades, sterilkan
c Masukkan 2 ml reagen nitrat dalam tabung, suspensikan kuman
dengan otoklaf
d Inkubasi dalam penangas air ( bukan inkubator ) pada suhu 37 oC selama 2 jam
3) Campur sama banyak, tera pH dan atur sampai pH 6.8. Bekerjalah
e Tambah 1 tetes HCl 50% , campur sampai rata
dengan cara aseptik
f Tambah 2 tetes Sulfanilamide 0,2% + 2 tetes N-Naphtylenediamine 0,1%,
campur b. H2O2 30%
g Baca segera dengan membandingkan pada larutan standar 1) Tersedia di pasaran dalam bentuk larutan 30%. Larutan ini dapat
menyebabkan terbakarnya kulit dan mata
Pembacaan :
2) Simpan dalam lemari pendingin dengan tutup rapat
69
c. Tween 80, 10% Alat
1) Hangatkan Tween 80 dan 90 ml aquades pada penangas air 50 C o
a. Tabung reaksi plastik ( beberapa tabung gelas mengandung residu nitrit )
2) Pipet 10 ml Tween 80. Buang kelebihan Tween pada permukaan luar pipet b. Ose/ sengkelit
3) Masukkan Tween ke dalam aquades hangat. Bilas Tween dalam pipet c. Inkubator
sampai bersih. Biarkan dalam penangas air sampai semua Tween terlarut d. Pipet pasteur
4) Simpan pada lemari es e. Pipet ukur
Cara kerja Reagen

a. Buat campuran H2O2 30% dan Tween 80 10% sama banyak. a. Reagen nitrat 0,01M
b. Pipet 1 ml PBS pH 7,0 kedalam tabung reaksi. NaNO3 ..................................................................0,085 gr
c. Tambahkan beberapa sengkelit penuh koloni bakteri umur 2-3 minggu KH2PO4 ..............................................................0,117 gr
d. Pindahkan 0.5 ml kedalam tabung lain. Sehingga akan didapat dua set tabung Na2HPO4 ............................................................0.193 gr
berisi kuman.
Aquadest .............................................................100 ml
e. Tabung pertama diinkuba si pada suhu 68oC dalam penangas air selama 20
Atur pH sampai 7.0
menit. Tabung kedua diinkubasi pada suhu ruang.
Sterilkan dengan otoklaf
f. Keluarkan dan biarkan sampai suhu kamar.
Simpan pada lemari es
g. Tambah 0,5 ml campuran H2O2 dan Tween 80 segar. Jangan digoyang karena
akan terbentuk gelembung, amati selama 20 menit. b. HCl 50%
50 ml konsentrat HCl ditambah 50 ml aquadest
Pembacaan :
c. Sulphanilamide 0,2%
Positif : terbentuk gelembung, walau kecil Larutkan dengan sempurna di dalam botol coklat 0,2 gr sulphanilamide
dengan 100 ml aquades . Untuk memudahkan pelarutan, lakukan dalam
Negatif : tidak terbentuk gelembung sampai 20 menit
penangas air 47-50 oC.
Jangan gunakan sulphanilamide yang tak larut sempurna. Reagensia
3. Uji Nitrat
dapat dipakai selama 1 bulan
Spesies Mycobacteria mempunyai kemampuan berbeda dalam mereduksi nitrat.
d. N-naptyl ethylenediamine dihydrochloride 0,1%
Mycobacterium tuberculosis merupakan spesies terkuat dalam mereduksi nitrat
Larutkan dalam botol coklat 0,1 gr N-naptyl ethylenediamine dihydrochloride
dibandingkan mycobacteria lain. Uji harus dilakukan pada kuman terduga Mycobacterium
dengan 100 ml aquades. Simpan dalam lemari es. Larutan dapat dipakai selama
tuberculosis yang tumbuh subur usia 3-5 minggu. Jangan menggunakan biakan yang
1 bulan.
lebih dari 5 minggu. Media yang dianjurkan untuk menumbuhkan Mycobacterium
tuberculosis untuk uji nitrat adalah LJ. e. Bubuk Zink
f. Standar warna
71
- Potassium dihydrogen phosphate ………. 2,4 gr Positif : warna pink dengan standar minimal +3. Ulangi pengujian jika
- Magnesium sulfate heptahydrate …………. 0.24 gr hasilnya +2.
- Tri-magnesium dicitrate 14-hydrate ……… 0.6 gr Negatif : hasil sesuai dengan standar warna 0 atau +1
- L-asparagin ……………………………………3.6 gr Kontrol negatif ditambah bubuk zink, jika berubah menjadi pink berarti
kontrol negatif benar
- Potato meal …………………………………… 30 gr
- Malachite green ……………………………… 0.4 gr
Catatan: Uji nitrat dalam bentuk paper strip tersedia di pasaran. Ikutilah petunjuk pabrik
- Aquadest …………………………………..600 ml dalam pengerjaannya.
b. Glyserol …………….…………………………… 12 ml
c. Telur homogen….……..……………………… 1000 ml 4. Uji Paranitro-Benzoic Acid ( PNB )
Alat dan bahan :

2. Untuk membuat stock solution OAT & working solution obat
1. Media LJ yang mengandung PNB ( cara pembuatan media mengandung PNB
Alat : dapat dilihat pada cara pembuatan media dengan obat )
a. Labu ukur steril 2. Inkubator
3. Rak tabung
b. Filter membrane 0.22 micron disposable
c. Cryo tube 1 ml steril + rak tube Cara kerja :
d. Pipet steril + bulb 1. Ambil 100 ul suspensi 1 mg/ml stok dan inokulasi pada media LJ yang
e. Micropipet + tip steril mengandung PNB dan satu tabung tanpa PNB
2. Tutuplah botol agak longgar.
Bahan : 3. Sebarkan bahan pemeriksaan tersebut secara merata di atas permukaan
a. Rifampicin (susceptibility test grade ) ……………… 40 mg/lt media dengan cara menggerak-gerakkan botol.
b. Isoniazid (susceptibility test grade) ……………………0.2 mg/lt 4. Letakkan botol-botol pada rak dengan kemiringan 300 selama 24 jam pada
c. Ethambutol (susceptibility test grade ) ………………. 2 mg/lt incubator dengan suhu 35 - 370C
5. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung
d. Streptomycin sulfate (susceptibility test grade) ……4 mg/lt
dengan posisi tegak dan lanjutkan inkubasi (copy paste)
e. Dimethyl formamide (Analytical grade )
6. Amati pertumbuhan M. tuberculosis setiap minggu. Jika sesudah minggu ke 4
f. Aquades tidak terlihat adanya koloni, pengamatan dilakukan sampai 8 minggu sebelum
hasilnya dinyatakan tidak ada pertumbuhan.
7. Catat hasil pengamatan setiap minggu pada buku catatan biakan
8. Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis akan dihambat oleh PNB
Catatan: Uji PNB langsung dari hasil olahan dahak tidak dianjurkan. Uji PNB
dianjurkan dilakukan dari isolat terduga Mycobacterium tuberculosis
5. Uji Pyrazinamide
73
Uji resistensi terhadap pyrazinamide sukar pelaksanaannya. Hasil uji pyrazinamidase
dapat memperkirakan apakah Mycobacterium tuberculosis masih sensitif atau resisten Timbulnya warna merah jambu : Positif
terhadap pyrazinamide. Selain itu dapat digunakan untuk membedakan antara M. avium
Warna tak berubah : Negatif
complex, M. marinum dengan M. kansasii dan M. bovis yang negatif pada uji niasin.
Bahan
Catatan :
1. Media
Positif menunjukkan bahwa isolat Mycobacterium tuberculosis mungkin resisten
a. Larutkan 6.5 g kaldu Dubois base dalam 1000 ml aquades
terhadap pyrazinamide
b. Tambahkan
Selalu sertakan kontrol positif ( M. intracellulare ATCC 13950 ) dan kontrol negatif
Pyrazinamide murni …….. 0.1 g
Natrium piruvat …………… 2.0 g ( M. Kansasii ATCC 12478 ), medium tanpa inokulum dan reagen saja
Agar ……………………….. 15.0 g
G. Pembuatan Media untuk Uji PNB dan Resistensi
c. Larutkan dalam penangas air
d. Masukkan 5 ml dalam tabung tutup ulir dalam posisi tegak Alat dan bahan yang diperlukan :
e. Otoklaf 121oC selama 15 menit
1. Untuk membuat media :
f. Simpan pada lemari es. Medium dapat tahan selama 6 bulan
bila tidak kering atau tercemar Alat :
a. Timbangan analitik
2. Reagen 1 % amonium ferosulfat b. Spatula / sendok
a. Masukkan 0.1 g amonium ferosulfat dalam tabung tutup ulir c. Gelas ukur
b. Larutkan dalam 10 ml aquades steril
d. Gelas beaker
c. Reagen tidak dapat disimpan, harus dibuat segar
e. Pipet 10 ml, 25 ml steril
Cara kerja f. Labu Erlenmeyer 250 ml, 1000 ml steril
1. Inokulasikan satu sengkelit penuh isolat usia 2-3 minggu pada permukaan media g. Botol Mc Cartney
secara duplo. h. Elpiji & Bunsen
2. Tutuplah tabung agak longgar, inkubasi pada suhu 37 C o
i. Power pipet
3. Setelah 4 hari, keluarkan 1 tabung dan tambahkan 1.0 ml reagen. j. pH meter / kertas pH
4. Amati warna merah jambu yang terbentuk pada perbatasan permukaan agar dan k. Otoklaf
reagen setelah 30 menit pada suhu ruang. Jika tidak ada warna, masukkan ke l. Inspisator
lemari es selama 4 jam, kemudian baca ulang. m. Blender stainless steel
5. Jika masih tak muncul warna, lanjutkan inkubasi sampai 7 hari dan ulangi
n. Magnetic stirrer & magnetic bar steril
6. Pengamatan. Jika tidak terbentuk warna berarti negatif.
Bahan :
Pembacaan
a. Bahan Medium LJ base dengan komposisi :
75
Cara kerja : Cara pembuatan :
1. Isi tabung bertutup ulir dengan 10-15 glass beads diameter 1.5 mm atau 5-10 jika 1. Buat stock solution (SS) dan working solution (WS) obat dengan cara :
diameternya 3 mm, kemudian tambah Tween 80, 0.1% 2 tetes untuk membasahi a. Contoh Rifampicin murni dengan potensi bahan hanya 95% :
glass beads kemudian disterilkan dalam otoklaf. Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 105.26 mg obat + 10 ml dimethyl formamide
Konsentrasi 8.000 mg/lt (WS) : 4 ml + 1 ml dimethyl formamide (buat tabel)
2. Timbang tabung tsb, misalnya M1
SS disterilkan dengan filter membrane yang disposable, kemudian
3. Ambil satu ose penuh koloni bacilli yang berumur 2 – 4 minggu dan masukkan dalam
pengenceran selanjutnya dilakukan secara steril
tabung di atas. Tutup tabung dengan rapat
Semua larutan obat, terutama untuk SS dimasukkan dalam cryo tube
4. Timbang tabung, misalnya M2. Jadi berat bacilli adalah M2 – M1 = M3
Cryo tube diberi catatan nama obat, pengenceran & tanggal pembuatan
5. Vortex 2 menit, kemudian diamkan 15 menit
WS dibagi dalam aliquot sesuai kebutuhan
6. Tambahkan aquades steril sesuai dengan volume M3 ml
Catatan : SS yang disimpan pada -70oC dapat bertahan 2 tahun
7. Homogenkan dengan menggunakan vortex mixer selama maximum 2 menit
8. Diamkan 15 menit. Yakinkan suspensi telah homogen. WS yang disimpan pada -20oC dapat bertahan 3 bulan
9. Ambil suspensi dari bagian terbawah 1/3 atas dan buat pengenceran serial 10 kali
b. Contah isoniazid murni dengan potensi bahan 100%
lipat (lihat uji kepekaan)
Cara kerja dan penyimpanan sama seperti Rifampicin
Jika metode penimbangan tidak dapat dilakukan, gunakan kepekatan kuman menurut Mc Cara membuat pengenceran adalah sebagai berikut :
Farland untuk inokulum. Gunakan kepekatan antara 0.5-1.0 skala Mc Farland. Kepadatan - Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 100 mg obat + 10 ml aquades steril
kuman dalam suspensi terbaik dilakukan dengan nefelometer atau penimbangan. Jika - Konsentrasi 1.000 mg/lt : 0.5 ml + 4.5 ml aquades steril
tidak ada, lakukan standarisasi makroskopik seperti dibawah - Konsentrasi 100 mg/lt : 0.5 ml + 4.5 ml aquades steril
- Konsentrasi 20 mg/h (WS) : 1 ml + 4 ml aquades steril
Cara penyediaan kuman untuk mencapai standar Mc Farland dapat dilihat dibawah :
a. Bahan c. Contoh ethambutol murni dengan potensi bahan 100%
BaCl2 0.1 g Cara kerja dan penyimpanan sama seperti Rifampicin
H2SO4 pekat 1.0 ml Cara membuat pengenceran adalah sebagai berikut :
b. Cara membuat - Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 100 mg obat + 10 ml aquades steril
1) Larutkan 0.1 g barium klorida dalam 10 ml aquades (larutan 1) - Konsentrasi 1.000 mg/lt : 0.5 ml + 4.5 ml aquades steril
2) Campur 1.0 ml asam sulfat pekat dengan 10 ml aquades (larutan 2). - Konsentrasi 200 mg/lt (WS) : 1 ml + 4 ml aquades steril
Bekerjalah seperti menangani asam klorida. Asam sulfat adalah asam
d. Contoh streptomycin murni dengan potensi bahan 100%
kuat
Cara kerja dan penyimpanan sama seperti Rifampicin
3) Campur larutan 1 dan larutan 2 dengan komposisi seperti dalam tabel
Cara membuat pengenceran adalah sebagai berikut :
dibawah
Standar 0.25 0.5 1.0 2.0 3.0 - Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 100 mg obat + 10 ml aquades steril
Larutan 1 ( ml ) 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3 - Konsentrasi 1.000 mg/lt : 0.5 ml + 4.5 ml aquades steril
Larutan 2 ( ml ) 9.975 9.95 9.9 9.8 9.7 - Konsentrasi 800 mg/lt (WS) : 4 ml + 1 ml aquades steril
77
Catatan : Isoniazid 20 mg/lt diambil 1.5 ml lalu tambahkan ke erlemeyer II
Sediaan obat banyak yang tersedia dalam bentuk konjugat atau terhidrasi, Ethambutol 200 mg/lt diambil 1.5 ml lalu tambahkan ke erlemeyer III
maka diperlukan faktor koreksi. Streptomycin 800 mg/lt diambil 0.75 ml lalu tambahkan ke erlemeyer IV
PNB diambil 2.25 ml lalu tambahkan ke erlemeyer V
Misal : streptomisin sulfat dan dihidro streptomisin. Jika sediaan adalah
streptomosin sulfat anhidrat dengan potensi 100%, maka jumlah obat yang h. Putar perlahan-lahan erlemeyer I – V dengan menggunakan magnetic stirrer
ditimbang harus dilebihkan menjadi 120%. supaya obat merata.
Untuk perhitungan koreksi, lihat rumus faktor koreksi pada lampiran.
i. Bagikan media @ 7 ml kedalam botol-botol steril yang telah diberi kode sesuai
2. Pembuatan larutan PNB : dengan jenis obat. Hindari terjadinya gelembung dengan cara mengalirkan media
a. Timbang 0.1 gr PNB dan larutkan dalam 3 ml dimethyl formamide melalui dinding botol tanpa menyentuhkan ujung pipet pada dinding botol.
b. Pada setiap 150 ml media LJ tambahkan 2,25 ml larutan PNB atau Timbang
j. Tutup botol rapat dan letakkan pada nampan dengan kemiringan 300, masukkan
dan larutkan 250 mg PNB dalam 10 ml propylene glycol.
ke dalam inspisator yang telah dipanaskan 850C selama 45 menit.
Dalam hal ini media dibuat dengan menambahkan 2 ml larutan PNB dalam 98 ml LJ
k. Keluarkan dari inspisator dan diamkan pada suhu kamar.
3. Pembuatan media dengan obat dan media dengan PNB :
a. Larutkan 37.5 gr LJ medium base dalam 600 ml aquades l. Bila kualitas media tidak baik (terjadi perubahan warna, berlubang-lubang, atau
b. Tambahkan 12 ml glycerol terdapat gelembung-gelembung pada permukaan) maka media tersebut tidak
c. Setelah tercampur sempurna, sterilkan dengan otoklaf selama 15 menit pada dapat dipakai.
suhu 1210C
d. Dinginkan sampai suhu + 500C 4. Penyimpanan media
e. Tambahkan telur homogen 1 liter yang telah dipersiapkan secara steril, campur a. Media dengan kualitas yang baik dicatat tanggal pembuatannya dan disimpan
perlahan-lahan agar tidak terbentuk gelembung. dalam refrigerator (suhu 4 – 80C )
f. Tuangkan dalam erlenmeyer steril yang masing-masing telah diisi magnetic bar b. Penyimpanan dapat sampai 4 minggu dengan tabung ditutup rapat.
steril :
H. Pembuatan Suspensi Kuman untuk Uji Kepekaan
Erlenmeyer I : 150 ml media LJ kurangi 0.7 ml untuk Rifampicin
Erlenmeyer II : 150 ml media LJ kurangi 1.5 ml untuk Isoniazid Alat dan bahan yang diperlukan :
Erlenmeyer III : 150 ml media LJ kurangi 1.5 ml untuk Ethambutol 1. Tabung tutup ulir steril atau botol Mc Cartney
Erlenmeyer IV : 150 ml media LJ kurangi 0.75 ml untuk Streptomycin 2. Glass beads steril diameter 1.5-3 mm
Erlenmeyer V : 150 ml media LJ kurangi 2.25 ml untuk PNB 3. Timbangan
Erlenmeyer VI : 850 ml media LJ tanpa obat 4. Vortex mixer
5. Koloni berumur 2 – <4 minggu.
g. Siapkan WS dari obat :
6. Aquades steril
Rifampycin 8.000 mg/lt diambil 0.75 ml, lalu masukkan ke erlemeyer I
7. Tween 80, 0.1%
79
tabung kuman jika tidak sedang diperlukan. 4) Masukkan 5-10 ml standar ke dalam tabung dengan dinding bening,
c. Jangan meneteskan inokulum. Tempelkan ujung tip pada permukaan media, rata dan cukup lebar dan sama dengan tabung yang akan dipakai untuk
keluarkan inokulum dari tip perlahan-lahan. Aerosolisasi tidak hanya membuat inokulum. Tutup dengan rapat.
membahayakan keselamatan petugas tetapi dapat juga menyebabkan bias hasil
5) Untuk membandingkan kepekatan inokulum dan standar, letakkan tabung
uji resistensi.
berisi kuman diantara standar 0.5 dan 1.0 dengan latar belakang hitam
d. Jika menggunakan mikropipet, yakinkan gagang pipet melekat erat pada tip.
yang tidak mengkilat. Volume pembanding dan yang dibandingkan harus
Jangan pakai tip yang lnggar atau ujungnya telah meruncing, yakinkan tidak ada
sama. Amati titik tengah larutan sejajar mata pengamat Kocok dahulu
gelembung pada tip.
standar sebelum dibandingkan dengan suspensi inokulum
J. Interpretasi Hasil Uji Kepekaan
6) Standar harus diganti tiap 6 bulan atau jika telah ada gumpalan.
Pembacaan
I. Uji Resistensi Mycobacterium tuberculosis Cara Proporsi
Pembacaan pertama kali dilakukan pada hari ke 28, jika hasilnya adalah “resisten”
tidak perlu diadakan pembacaan ulang. Kuman tersebut dapat diklasifikasikan Alat: 1. Timbangan dengan sensitivitas 0.1 mg.
sebagai “resisten”. Jika hasilnya adalah “sensitive” maka perlu diadakan pembacaan 1. Sengkelit
ulang pada hari ke 42 untuk meyakinkan hasil pembacaan pada hari ke 28. Jadi 2. Tabung 10 ml bertutup ulir steril
pembacaan pada hari ke 42 berfungsi pula sebagai alat kontrol. 3. Tabung 15 ml bertutup ulir steril
4. Glass beads diameter 1.5-3 mm steril
Jumlah koloni pada permukaan media harus dihitung dengan tepat. Pada botol Mc
5. Vortex mixer
Cartney dengan volume 14 ml, jumlahnya kurang dari 100 koloni. Hasil ini mungkin
6. Pipet volumetrik 1 ml dan 10 ml steril
teramati pada media tanpa obat pada pengenceran 10-5 atau pada media dengan
7. Automatic pipette 100 μl dan tip pipet
obat pada pengenceran 10-3. Idealnya jumlah koloni antara 50-100 terdapat pada
8. Botol Mc Cartney
salah satu pengenceran yang ditanam pada media tanpa obat. Hindari pendugaan
9. Inkubator
jumlah koloni pada permukaan media, kecuali sangat padat.
10. Inspisator
Skala pembacaan dapat dilihat pada tabel dibawah ini : Bahan
1. Aquades steril
Pembacaan Laporan
2. Media LJ
> 500 koloni 4 + ( konfluen)
3. Media LJ yang mengandung OAT dengan konsentrasi sbb:
200 – 500 koloni 3 + (hampir konfluen)
100 - 200 koloni 2+ a. Isoniazid (INH) : 0.2 μg/ml
20 – 100 koloni 1 + (hitung jumlah koloni) b. Streptomycin : 4 μg/ml (bila menggunakan Dihydrosteptomycin,
1 – 19 koloni Tulis jumlah koloni konsentrasi harus sebanding dengan 4 mg/ml basa)
Tidak tumbuh Negatif c. Rifampicin : 40 μg/ml
Jika jumlah koloni pada pengenceran 10-5 lebih dari 100, uji kepekaan harus diulang. d. Ethambutol : 2 μg/ml
81
Cara kerja : d. Ambil 100 μl suspensi bacilli pengenceran 10-3 dengan menggunakan tip
1. Siapkan suspensi kuman dengan konsentrasi 1 mg/ml atau Mc Farland 0.5-1.0 baru dan inokulasi pada botol media yang mengandung INH, kemudian
2. Buat pengenceran 10-3 dan 10-5 dari suspensi kuman tersebut sebagai berikut: ratakan inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan
a. Ambil 5 buah tabung reaksi steril botol perlahan-lahan
b. Masing-masing tabung isi dengan 4.5 ml aquades steril e. Ambil 100 μl suspensi bacilli pengenceran 10-5 dengan menggunakan tip
c. Ambil 0.5 ml suspensi kuman konsentrasi 1 mg/ml baru dan inokulasi pada botol media yang mengandung INH , kemudian
d. Masukkan dalam tabung reaksi I dan campur dengan melakukan pemipetan ratakan inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan
minimal 10 kali sampai homogen, sehingga dihasilkan larutan kuman botol perlahan-lahan
pengenceran 10-1. Goyang-goyang tabung diantara pemipetan. f. Lakukan hal yang sama pada butir d dan e untuk botol media yang
e. Larutan kuman pengenceran 10 : -2
mengandung Rifampicin, botol media yang mengandung Ethambutol dan
Ambil 0.5 ml larutan kuman pengenceran 10-1 dengan pipet baru, masukkan botol media yang mengandung Streptomycin
dalam tabung II, homogenisasi dengan pipet g. Tutuplah botol-botol tersebut agak longgar
f. Larutan kuman pengenceran 10 : -3
4. Inkubasi dengan cara sebagai berikut :

Ambil 0.5 ml larutan kuman pengenceran 10-2 dengan pipet baru, masukkan
a. Masukkan botol-botol tersebut dengan posisi horizontal dengan sudut
dalam tabung III, homogenisasi dengan pipet
kemiringan 300 dalam incubator suhu 370C selama satu malam dengan tutup
g. Larutan kuman pengenceran 10-4 :
longgar.
Ambil 0.5 ml larutan kuman pengenceran 10-3 dengan pipet baru, masukkan
b. Setelah inkubasi satu malam, perhatikan permukaan media harus sudah
dalam tabung IV, homogenisasi dengan pipet
kering, eratkan tutup botol dan tegakkan posisi botol.
h. Larutan kuman pengenceran 10-5 :
Ambil 0.5 ml larutan kuman pengenceran 10-4 dengan pipet baru, masukkan 5. Lakukan pembacaan pertumbuhan koloni pada hari ke 28 dan 42 serta dicatat
dalam tabung V, homogenisasi dengan pipet dalam Tabel Pembacaan seperti terlampir
3. Inokulasi pada media tanpa OAT dan media dengan OAT sebagai berikut : Catatan :
a. Siapkan 4 buah botol media LJ tanpa OAT dan media LJ mengandung OAT, a Untuk menjamin hasil uji kepekaan yang baik, pada tiap kali pengerjaan harus
2 botol untuk setiap jenis OAT. disertakan kuman kontrol : H37RV yang peka terhadap semua OAT lini pertama,
b. Homogenkan suspensi dengan pemipetan. Ambil 100 μl suspensi bacilli Mycobacterium tuberculosis dengan tingkat resisten sedang terhadap streptomisin
pengenceran 10 , inokulasikan pada botol I dan II media tanpa OAT kemudian
-3
dan rifampisin serta kuman Mycobacterium tuberculosis yang resisten sedang
ratakan inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan terhadap isoniazid dan etambutol. Tidak dianjurkan memakai kuman kontrol yang
botol perlahan-lahan resisten terhadap isoniazid dan rifampisin. Usia kuman kontrol juga harus antara
c. Ambil 100 μl suspensi bacilli pengenceran 10 dengan menggunakan tip
-5
2-3 minggu
baru dan inokulasi pada botol III dan IV media tanpa OAT, kemudian ratakan b. Hindari kontaminasi silang. Jangan sampai batang pipetor menyentuh bibir tabung
inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan botol berisi kuman. Ganti tip pipet setiap menginokulasikan tiap pengenceran dan tiap
perlahan-lahan isolat. Dianjurkan menggunakan tip dengan “stopper” (komersial). Selalu tutup
83
Alat yang diperlukan : Hasil perhitungan koloni layak dilaporkan sebagai sensitif atau resisten jika :
1. Otoklaf 1. Jumlah koloni pada media tanpa obat pada pengenceran 10-3 dan 10-5
2. Botol Mc Cartney atau tabung bertutup ulir volume 10 ml berbeda secara proporsional.
3. Glass beads 2. Jumlah koloni pada permukaan media dapat dihitung tepat.
4. Vortex mixer 3. Jumlah koloni minimal pada media tanpa obat adalah 5. Jika jumlahnya
5. Pipet 1 ml steril kurang dari 5, hasil tidak dapat disimpulkan.
6. Cryo vial 2 ml steril
Untuk media tanpa obat, jumlah koloni berdasarkan prioritas sbb :
7. Ultra deep freezer ( -700C )
1. 20 – 100 koloni, jika tidak ada yang seperti ini, pilih yang ke 2
8. Biological Safety Cabinet II
2. 5 – 19 koloni
Cara kerja : 4. Untuk perhitungan, pakai jumlah koloni tertinggi, bukan jumlah rata-rata.
1. Suspensikan 100 gr bubuk susu skim dalam 1 liter PBS (volume dapat diperkecil Catatan.
tergantung kebutuhan, tetapi perbandingan tetap seperti di atas) masukkan ke dalam a. Koloni yang sangat kecil ( pin point ) pada media yang mengandung etambutol
botol bertutup ulir, tutuplah botol jangan terlalu rapat atau streptomisin jangan diperhitungkan.
2. Sterilkan botol tersebut dalam otoklaf pada tekanan 15 lbs dan suhu 121 C selama 0
b. Jika jumlah koloni pada hari ke 28 dan ke 42 berbeda mencolok, hasil tidak boleh
10 menit (jangan lebih dari 10 menit sebab akan terjadi „caramel“) disimpulkan. Uji kepekaan harus diulang
3. Setelah dingin tutup botol dikencangkan Perhitungan penetapan resistensi
4. Siapkan biakan Mycobacterium tuberculosis pada media LJ yang berumur 2 – 3
Jumlah koloni pada permukaan media yang mengandung obat menandakan jumlah
minggu
kuman yang resisten. Jumlah koloni pada permukaan media yang mengandung obat
5. Kerok koloni tersebut dan masukkan ke dalam botol Mc Cartney yang telah berisi
dibagi dengan jumlah koloni pada permukaan media yang tanpa obat akan menghasilkan
larutan PBS steril dan glass beads secukupnya
proporsi kuman yang resisten untuk galur tersebut. Jika proporsi kuman terhadap obat
6. Homogenkan dengan menggunakan vortex mixer selama + 30 detik
tertentu dibawah 1 (satu) persen, maka kuman dinyatakan sensitif terhadap obat tersebut.
7. Diamkan selama minimal 15 menit supaya gelembung yang terbentuk dapat
Jika proporsinya ≥ 1 % maka kuman dinyatakan resisten terhadap obat tersebut.
mengendap. Sesuaikan kekeruhan suspensi kuman sama dengan Mc Farland 1.0
8. Pipet suspensi kuman tersebut sebanyak 0.5 ml dan masukkan dalam cryo vial yang Untuk menilai proporsi kuman yang resisten, tetapkan angka tertinggi pada media tanpa
telah berisi 0.5 ml suspensi susu skim. Simpanlah sebanyak-banyaknya, minimal 50 obat, baik yang didapat pada hari ke 28 atau hari ke 42.
vial Untuk media yang mengandung obat, pilih pengenceran yang menghasilkan jumlah
9. Simpan dalam ultra deep freezer. Kuman dapat bertahan puluhan tahun sepanjang koloni antara 20-100 sebagai prioritas utama, jika tak ada pilih pengenceran dengan
suhunya stabil. Ini merupakan generasi 1 jumlah koloni 5-19.
10. Lakukan hal yang sama untuk mendapatkan generasi ke 2. Simpanlah lebih banyak Berdasarkan kriteria diatas, proporsi dapat dihitung sbb ;
dari generasi 1
Jumlah koloni pada media dengan obat
11. Untuk kuman kontrol, ambil dari vial generasi 2 dan lakukan subkultur bersamaan % resistensi = X 100 %
dengan subkultur kuman yang akan ditentukan kepekaannya Jumlah koloni pada media tanpa obat
85
Contoh 1 : pembacaan jumlah koloni hari ke 42 Secara teoritis perbedaan jumlah koloni antara pengenceran 10-3 dan 10-5 adalah 100
kali. Jika dalam kenyataan, perbedaan itu terlalu jauh, hasil uji kepekaan seharusnya tak
Suspensi (1mg/ml – Media bebas Obat/konsentrasi (mg/L)
107/ ml ) Obat dibaca. Pemeriksaan harus diulang
Pengenceran (estimasi S (4) H (0.2) R (40) E (2) Contoh - 2 : pembacaan jumlah koloni hari ke – 42
jumlah kuman per ml )
10-1 (106) Suspensi (1mg/ml – 107/ Media bebas obat Obat/Konsentrasi (mg/L)
ml )
10-2 (105)
Pengenceran ( estimasi S (4) H (0.2) R (40) E (2)
10-3 (104) 4+, 4+ 4 + 1 3+ 8 2+
jumlah kuman per ml )
(>500)
10-1 (106)
10-4 (103)
10-2 (105)
10-5 (102) 36, 45* 45 0 12 0 20
10-3 (104) 4+, 4+ 4+ (>500) 1 30 8 2+
Proporsi resistensi <0.1% 27% 0.2% 44.4%
10-4 (103)
Hasil dilaporkan S R S R
10-5 (102) 36, 45* 45 0 12 1 20
* pilih angka tertinggi dari jumlah koloni pada media tanpa obat sebagai dasar Proporsi resistensi <0.1% 44.4%
perhitungan. Hasil dilaporkan S ? ? R
Koloni yang dipakai dalam perhitungan pada tabel contoh diatas adalah :
H (12) pada 10-5; E (20) pada 10-5 & R (8) pada 10-3) dan S (1) pada 10-3). Pada contoh ini kontradiksi terjadi pada interpretasi untuk isoniazid dan rifampisin.
Jika dihitung maka tampak sebagai berikut : Interpretasi untuk Isoniazid:
a. Isoniazid: 12/45 27.0% (Resisten)
Streptomycin :1/4,500 x 100% = <0.1 % (Sensitif) b. Isoniazid: 30/4500 0.07% (Sensitif)
Isoniazid :12/45 x 100% = 27.0% (Resisten)
Rifampicin : 8/4,500 x 100% = 0.2% (Sensitif) Kondisi ini biasanya dapat timbul karena petugas kurang teliti atau kurang terampil
Ethambutol : 20/45 x 100% = 44.4% (Resisten) dalam homogenisasi inokulum.
Hasil uji resistensi tidak selalu dapat dibaca sekali. Kadang-kadang perlu pengulangan K. Preservasi Kuman pada Suhu -70oC
pengujian, yaitu pada keadaan :
Sub kultur kuman kontrol tidak boleh dilakukan terus menerus karena risiko mutasi
a. Hasil pengujian pada kuman kontrol tidak sesuai menjadi lebih besar. Sub kultur kuman kontrol paling banyak dilakukan tiga kali. Untuk
b. Kriteria untuk pembacaan/interpretasi pertumbuhan pada media yang mengatasi hal tersebut, kuman kontrol harus disimpan sebagai aliquot dalam jumlah
mengandung obat dan media yang tidak mengandung obat belum dicapai. besar sehingga ketersediaannya terjamin. Preservasi juga mempunyai manfaat untuk
c. Jika terjadi perbedaan jumlah koloni yang terlalu besar pada duplo kontrol. penelitian.
Misalnya lebih dari 10 kali Bahan yang diperlukan :

d. Terjadi kontradiksi interpretasi (contoh – 2) 1. Bubuk susu skim (“ laboratory grade “)
2. Aquades
87
8. NaOH adalah dekontaminan sekaligus mukolitik. Daya mukolitik maksimum pada Catatan :
konsentrasi akhir 2%. Namun harus diingat bahwa pada konsentrasi tersebut, a. Prosedur no 6-9 dilakukan dalam BSC
NaOH juga berefek kurang baik untuk mycobacteria. Karena itu waktu paparan b. Kuman yang belum dipasasi merupakan generasi ke 0, dan yang disimpan
terhadap NaOH harus sangat terkendali. Jika dengan konsentrasi 2%, cemaran pertama kali merupakan generasi ke 1. Agar sifat kuman mencerminkan
masih tinggi. naikkan konsentrasi akhir menjadi 3-4% dan jangan memanjangkan generasi asalnya, kuman hanya dapat dipakai sampai generasi ke 3.
waktu paparan. Seandainya cemaran dengan Pseudomonas aeruginosa tetap c. Suspensi susu skim dalam PBS dapat diganti dengan larutan steril gliserol
menjadi masalah besar, gunakan cara dekontaminasi dengan asam oksalat 8% dalam larutan proteose pepton (Proteose peptone no 3 sebanyak 10g,
gliserol 80 ml dan aqubidestilata 1000 ml kemudian sterilkan)
9. Untuk menilai kemampuan dekontaminasi reagen baru, lakukan dekontaminasi
pada 4-6 spesimen dahak dan tanam hasilnya pada agar darah. Reagensia yang L. Resusitasi Mycobacterium tuberculosis dari -70oC
baik hanya menyebabkan pertumbuhan minimal dalam 24-48 jam. Angka cemaran
yang baik berkisar antara 3-5%. Lakukan analisa bulanan/tahunan Cara :
1. Ambil satu atau secukupnya tabung berisi kuman dari -70oC
10. Jika tersedia, penambahan fraksi V bovine albumin 0.2 % dalam inokulum akan 2. Biarkan pada suhu ruang sampai mencair
memperkuat penempelan kuman pada media
3. Buka cryo vial, masukkan sengkelit steril (diameter 3 mm) tegak lurus sampai
11. Temperatur inkubator untuk isolasi Mycobacterium tuberculosis harus pada suhu dasar. Putar sengkelit beberapa kali perlahan-lahan. Tanam satu sengkelit pada
35-37oC. Idealnya mengngunakan inkubator CO2 dengan kadar 5-10%. Jika seluruh permukaan media LJ dengan jalan menggoreskannya. Alternatifnya,
menggunakan inkubator tersebut, tutup botol dapat dikendorkan untuk minggu homogenkan suspensi kuman dengan pipet dan tanamkan 0.1 ml pada seluruh
pertama dan setelah itu ditutup rapat untuk menghindari pengeringan. permukaan media LJ
4. Selanjutnya amati biakan seperti biasa. Pertumbuhan dalam 7 hari mencurigakan
12. Biakan baru dinyatakan negatif jika dalam 8 minggu tak ada pertumbuhan. Jika hasil
cemaran. Konfirmasi dengan pewarnaan BTA, Gram dan penanaman pada agar
pemeriksaan mikroskopis dahak BTA positif, biakan dinyatakan negatif setelah 12
darah
minggu tak ada pertumbuhan
Catatan :
13. Adanya serpentine cord formation pada pemeriksaan mikroskopik mengarah
pada Mycobacterium tuberculosis. Tetapi tidak boleh melakukan identifikasi hanya Suhu yang sangat dingin dapat membakar kulit. Pakailah sarung tangan
berdasar temuan mikroskopik tersebut Cryotube mengandung sangat banyak Mycobacterium tuberculosis. Berhati-
hatilah bekerja
Sisa suspensi kuman dapat dikembalikan ke dalam -70 oC. Makin sering keluar-
masuk -70oC, viabilitas kuman makin menurun.
M. Pengiriman Isolat ke Laboratorium Rujukan
Pengiriman subkultur ke laboratorium dilakukan untuk tujuan mengidentifikasi isolat,

melakukan uji kepekaan dan uji silang dalam program pemantapan mutu (Quality
Assurance).
89
Jika menggunakan pesawat terbang, pegiriman subkultur harus mengikuti aturan IATA CATATAN TAMBAHAN
(International Airline Transport Association). Secara umum sama dengan yang telah 1. Keberhasilan melakukan biakan sangat bergantung pada kualitas contoh uji yang
dijelaskan pada bab Keamanan Kerja. Hal yang sama untuk metode pengiriman dengan diterima. Memberikan informasi yang rinci dan mudah dimengerti merupakan salah
transportasi lain. Pada kondisi dengan fasilitas terbatas, pengiriman dahak dan subkultur satu kunci keberhasilan pengumpulan dan pengiriman spesimen yang baik.
dapat dilakukan seperti di bawah ini:
2. Idealnya contoh uji diharapkan sampai ke laboratorium dalam waktu 1 (satu) jam.
Alat Yang Diperlukan Jika tidak dapat sampai dalam waktu 1 jam, dinginkan, jangan bekukan spesimen.
Bila jarak tempuh ke laboratorium lebih dari 72 jam, maka contoh uji diawetkan
1. Wadah bahan infeksius (biohazard container) : box Styrofoam, pipa pralon
dengan CPC. Spesimen yang sudah ditambah dengan CPC atau darah tidak boleh
2. Bahan penyerap : kertas, tissue
didinginkan. Untuk pembiakan pada MGIT dilarang menambahkan CPC, cukup
3. Penahan guncangan : plastik, busa, gabus dikirim dalam keadaan dingin.
4. Kantong plastik bersegel
5. Formulir identitas isolat 3. Spesimen yang diawetkan dengan CPC harus dikelola secara khusus sebelum
penanaman
6. Parafilm, lakban
7. Stiker : Biohazard, Fragile, 4. Paparan kuman terhadap OAT dalam beberapa hari telah menyebabkan sebagian
kuman mati dan viabilitasnya rendah.
Cara kerja :
1. Tutup Botol Mc Cartney dengan rapat kemudian segel dengan parafilm. Masukkan 5. Tidak ada satu metodepun yang ideal untuk semua spesimen. Pilihan cara
dekontaminasi tergantung pada jenis dan kondisi spesimen.
2 botol dari 1 pasien kedalam kantong plastik bersegel.
2. Bungkus tiap kantong plastik dengan kertas tissue agar jika terjadi bocoran, tidak Prinsip umum dekontaminasi adalah menggunakan cara yang paling ringan dalam
keluar dari wadah bahan infeksius membunuh mikroba. Toleransi kontaminasi 3% - 5% untuk media padat.
3. Catat identitas isolat yang akan dikirim pada Formulir
6. Untuk kebutuhan pemantapan mutu internal, sisa spesimen dapat disimpan pada
4. Masukkan kantong plastik yang berisi botol Mc Cartney ke dalam wadah bahan
refrigerator sampai hasil pewarnaan BTA hasil pemekatan didapat atau dicurigai
infeksius. timbulnya kontaminasi pada media. Spesimen tersebut masih dapat digunakan
5. Tutup wadah, rekatkan dengan lakban dalam 7-10 hari
6. Masukkan Formulir identitas isolat dalam amplop
7. Dekontaminasi dengan Nacetyl cystein ( NALC ) dan NaOH sangat baik untuk dahak,
6. Masukkan wadah bahan infeksius dan formulir ke dalam kotak karton sedemikian
namun NALC sangat labil dan harus selalu dibuat segar. Hindari pengocokkan
rupa agar tidak terjadi guncangan, beri alamat yang dituju dan tempelkan stiker
NALC-NaOH yang berlebih karena NALC mudah teroksidasi oleh oksigen udara.
yang diperlukan
7. Kirim melalui expedisi atau kurir
N. Pengelolaan Limbah
Semua bahan/ alat yang telah atau dianggap tercemar harus disterilisasi sebelum
dibersihkan atau dibuang.
91
e. Pengambilan dan penanganan contoh uji dahak VIII. PEMANTAPAN MUTU BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN
• Dahak yang diperiksa harus mukopurulen yaitu dahak yang mukoid
Jaminan mutu untuk biakan TB merupakan suatu sistem yang disusun secara
berwarna kuning kehijauan. Petugas harus dapat memotivasi pasien
berkesinambungan untuk meningkatkan reliabilitas, dan efisiensi pemeriksaan biakan
agar dapat mengeluarkan dahak yang baik. Untuk lebih jelasnya, lihat
pedoman pemeriksaan mikroskopis. sebagai alat diagnostik dan pengelolaan pasien. Pemantapan mutu laboratorium
• Uji kualitas dahak dilakukan dengan cara melihat warna dan kekentalan adalah suatu sistem yang dirancang untuk meningkatkan dan menjamin mutu serta
dahak tanpa membuka tutup pot dahak, karena itu pot dahak harus efisiensi pemeriksaan laboratorium secara berkesinambungan sehingga hasilnya dapat
terbuat dari bahan yang transparan dan bening. dipercaya. Pemantapan mutu laboratorium tuberkulosis sangat diperlukan agar diagnosis
• Periksalah kualitas spesimen dan beri catatan bila spesimen seperti penyakit tuberkulosis melalui pemeriksaan biakan dan pemeriksaan uji kepekaan dapat
saliva. Laporan hasil harus mencantumkan bahwa ”spesimen diperkirakan dipertanggung jawabkan mutunya.
saliva”, laporkan negatif dengan catatan.
A. Tujuan Pemantapan Mutu
• Bila dahak yang diperoleh tetap tidak memenuhi syarat, petugas lab tetap
harus melakukan pemeriksaan dengan memilih bagian yang paling kental Tujuan pemantapan mutu uji kepekaan laboratorium TB adalah :
dan beri catatan bahwa ”spesimen tidak memenuhi syarat / air liur” a. Menjamin bahwa hasil pemeriksaan biakan dan uji kepekaan yang dilaporkan
• Buanglah wadah spesimen yang pecah atau bocor dengan diotoklaf dan oleh suatu laboratorium akurat dan terpercaya.
mintalah spesimen ulangan. b. Mengidentifikasi berbagai tindakan yang berpotensi menimbulkan kesalahan.
c. Menjamin bahwa tindakan-tindakan perbaikan yang tepat telah dilakukan.
f. Reagen dan Pewarnaan
Catat tanggal kadaluarsa tiap bahan dan reagen, buat label di wadahnya. Setiap komponen di dalam pemantapan mutu tidak berdiri sendiri tetapi merupakan
Semua wadah pewarnaan dan reagen sebaiknya menunjukkan tanggal bagian yang tidak terpisahkan dan saling terkait satu sama lain. Laboratorium yang akan
penerimaan dan pembukaan pertama. Semua bahan yang tidak memenuhi melakukan pemantapan mutu eksternal tanpa melakukan pemantapan mutu internal
syarat harus dicatat dan segera dibuang. Stok sebaiknya dibatasi untuk dengan baik (mendeteksi terjadinya kesalahan secara dini) maka usaha tersebut akan sia-
waktu 6 bulan dan urutan penggunaan stok sebaiknya sesuai tanggal paling sia. Demikian pula bila kedua komponen tersebut dilakukan tanpa disertai pelaksanaan
awal, untuk menghindari kadaluwarsa. komponen peningkatan mutu sebagai upaya untuk penyelesaian masalah.
g. Uji Biokimia B. Komponen Pemantapan Mutu Laboratorium Tuberkulosis

Siapkan reagen untuk identifikasi dilengkapi dengan menggunakan kontrol
Pemantapan mutu laboratorium tuberkulosis terdiri atas 3 komponen utama,
positif dan negatif. Gunakan wadah dengan volume kecil untuk menghindari
yaitu :
kontaminasi silang.
1. Pemantapan Mutu Internal (PMI) atau Internal Quality Control
h. Air
Pemantapan mutu internal adalah suatu proses pemantauan yang terencana,
Minimal air yang dipakai adalah aquabidestilata, pH 6.8-7.2 atau air yang
sistematik, dan efektif yang dilakukan oleh laboratorium itu sendiri untuk mendeteksi
telah mengalami filtrasi partikel, de-ionisasi dan osmosis terbalik. Aqua pro
adanya kesalahan dan menganalisis kesalahan yang terjadi.
injeksi paling baik untuk dipakai
93
Kunci keberhasilan pemantapan mutu internal adalah : buffer untuk pH 4.0 dan 7.0 sebelum digunakan.
• Pelatihan yang adekuat, motivasi dan komitmen petugas 3. Water bath : periksalah temperatur sebelum dan sesudah penggunaan.
• Pelaksanaan prosedur/ SOP Bersihkan setiap bulan dengan larutan sabun.
• Kemauan menerima dan memperbaiki kesalahan 4. Almari Pendingin 20-80C : periksa temperatur setiap hari, tempatkan
• Komunikasi efektif termometer pada rak tengah, catat dalam buku PMI, bersihkan setiap
bulan. Lakukan defrost atau periksa bagian almari pendingin dan
Pemantapan Mutu Internal merupakan tanggung jawab petugas laboratorium yang
freezer setiap 3 bulan.
meliputi :
5. Freezer : periksa setiap hari, bersihkan setiap 6 bulan.
1. Tahap Pra Analitik 6. Alat-alat gelas : pastikan bahwa alat-alat gelas bebas dari detergen.
a. Tata Ruang dan Administrasi Laboratorium Jangan menggunakan alat gelas yang telah disterilkan lebih dari 3
• Pastikan bahwa pintu laboratorium selalu tertutup. Area kerja, peralatan minggu.
dan bahan-bahan sebaiknya disusun sedemikian rupa sehingga
Pemeliharaan dan kalibrasi alat yang digunakan dalam laboratorium biakan
mendukung efisiensi alur kerja. Area kerja sebaiknya bebas debu. Meja
dan uji kepekaan dapat dilihat pada lampiran
kerja/ bench/ kabinet sebaiknya dibersihkan setidaknya sekali sehari
dengan desinfektan (misalnya fenol 5%) c. Permintaan pemeriksaan
• Setiap prosedur yang digunakan di laboratorium harus tercatat dan • Pemeriksaan hanya dilakukan bila ada permintaan tertulis dari dokter
disimpan. Setiap perubahan prosedur harus dikonsultasikan pada atau orang yang berwenang dan permintaan dengan lisan sebaiknya
supervisor/penanggung jawab laboratorium tidak dilayani.
• Semua dokumen hasil pemeriksaan tersimpan untuk 5 tahun. • Formulir permintaan pemeriksaan dipisahkan dari spesimen. Bila formulir
terkontaminasi spesimen, harus dilakukan dekontaminasi atau disterilkan
b. Peralatan laboratorium
dengan otoklaf. Salin ulang permintaan terlebih dahulu.
• Peralatan digunakan sesuai manual dan spesifikasi yang ditentukan
• Periksalah bahwa data-data pada formulir permintaan pemeriksaan
• Pedoman penggunaan dan pemeliharaan semua alat harus tersedia dan
sesuai dengan data pada label spesimen. Buanglah atau tolak spesimen
tersimpan
yang identitasnya tidak jelas dan kualitas tidak memenuhi syarat.
• Peralatan harus dimonitor secara teratur agar tercapai akurasi alat dan
• Catatlah tanggal dan jam pengambilan serta kedatangan spesimen di
presisi yang tetap
laboratorium dan catatlah semua keterlambatan pengiriman pada formulir
1. Incubator 35-370C: ukur temperatur setiap hari, sebaiknya pagi hari.
hasil, terutama pada hasil biakan negatif atau terkontaminasi
Ujilah temperatur di beberapa tempat dalam inkubator dengan
menempatkan termometer di dalam kotak kayu. Kontrol lampu dalam d. Persiapan pasien
inkubator. • Memberikan bimbingan kepada pasien tentang cara pengumpulan dahak,
2. pH meter : Sesuaikan temperatur setiap penggunaan. Buatlah larutan waktu pengumpulan dahak dan lokasi pengumpulan dahak. Lakukan
buffer setiap hari, buanglah bila sudah tidak terpakai. Standarkan demonstrasi di depan pasien.
95
o Recovery Rate yang baik i. Media Biakan
o Semua dahak BTA pos seharusnya memberikan hasil pemeriksaan • Gunakan telur segar (kurang dari 7 hari) untuk penyiapan media LJ.
biakan pos (>97%) Dianjurkan telur bebek yang bukan dari peternak besar.
o Sebanyak 20 - 30% dahak BTA neg dapat memberikan hasil biakan • Periksa waktu koagulasi dan temperatur untuk pembuatan media telur.
pos Buang media yang mengalami dekolorisasi, mengandung gelembung
o 2-3% dahak BTA pos memberikan hasil biakan negatif atau tanda-tanda pemanasan berlebih.
o Angka indikator di atas dihitung untuk contoh uji dahak dari suspek • Ciri-ciri umum media yang baik
saja, sehingga pencatatan untuk pasien suspek dan pasien follow up o Pada batch yang sama harus mempunyai warna yang sama. Bila
sebaiknya dipisahkan terjadi perbedaan warna berarti proses homogenisasi tidak baik
o Buat analisa indikator di atas tiap tahun dan selama 3 tahunan. atau adanya materi residu yang tertinggal dalam botol tsb. Warna
o Untuk mempertahankan kemampuan petugas lab, minimal sebanyak hijau yang lebih gelap disebabkan karena terlalu banyak malachite
5.000 pemeriksan biakan harus dilakukan per tahun. green atau medium terlalu asam (pH rendah), sebaliknya warna
c. Pemantapan mutu/ indikator internal uji kepekaan medium yang kekuningan disebabkan karena kualitas malachite
o Gunakan isolat yang berumur tidak lebih dari 4 minggu (dianjurkan green yang jelek atau medium yang terlalu basa/alkalis (pH tinggi)
2-3 minggu) atau pemanasannya terlampau tinggi. Medium yang berbeda warna
o Selalu sertakan kuman kontrol H37RV, Mycobacterium tuberculosis tersebut sebaiknya segera dibuang.
yang resisten S dan H/R, Mycobacterium tuberculosis yang resisten o Bila temperatur inspisator terlalu rendah, medium dapat mudah luruh.
E dan R/H. Umur kuman kontrol harus sama dengan kuman yang Cara memeriksa kualitas tekstur medium adalah dengan mengambil
akan diuji. secara acak 1 atau 2 medium dan mengetukkannya pada telapak
o Jika hasil uji kepekaan kuman kontrol tidak dapat dibaca, hasil uji tangan 2-3 kali. Media yang telah cukup padat tidak akan luruh.
kepekaan isolat dari pasien tidak boleh dibaca. Medium yang tidak cukup padat harus segera dibuang.
o Selalu bekerja dengan mematuhi Petunjuk Teknis yang telah o Munculnya gelembung udara selama proses inspisasi disebabkan
diuraikan sebelumnya. Perhatian khusus saat homogenisasi oleh temperatur inspisator terlalu tinggi. Tidak ratanya proses
inokulum dan pengenceran. Lakukan homogenisasi dengan baik homogenisasi juga dapat menyebabkan terbentuknya gumpalan.
mulai saat penyiapan inokulum awal, selama proses pengenceran Medium yang berwarna kuning dan mengandung gelembung udara
dan saat inokulasi. tidak layak dipergunakan dan harus segera dibuang.
o Simpan bubuk obat pada suhu yang sesuai dengan anjuran pabrik o Medium yang baik tidak kering. Adanya sedikit air dalam wadah media
bersangkutan. Bubuk obat harus selalu tertutup rapat, dianjurkan merupakan hal baik. Jika jumlah air terlalu banyak, harus dibuang
untuk disimpan dalam desikator dengan gel silika di dalamnya. secara aseptik. Adanya sedikit air akan mencegah pengeringan saat
Panaskan gel silika minimal 1 bulan sekali. Jangan menggunakan media yang telah diinokulasi diinkubasi dalam keadaan tutup longgar.
obat yang telah lewat masa kadaluarsa atau telah bergumpal-
• Periksa sterilitas setiap batch dengan cara sebagai berikut:
gumpal.
97
- Ambil sampel 5% -10 % dari jumlah tiap batch pembuatan. Inkubasi terkontaminasi dan dievaluasi setiap bulan dengan standar kisaran
pada suhu 35 - 37 C selama 2 x 24 jam. Dapat juga dilakukan
0 0
3-5%. Kontaminasi < 3% mengindikasikan proses dekontaminasi
inkubasi semua media dalam 1 x 24 jam terlalu kuat, berarti terlalu banyak tuberkel yang mati. Keterlambatan
- Bila tidak tumbuh koloni, media dapat dipakai. pengiriman spesimen dapat menyebabkan kontaminasi > 5%.
- Bila tumbuh koloni, buang seluruh media dan buat yang baru. Kontaminasi > 5% juga menunjukkan proses dekontaminasi terlalu
lemah. Dalam hal ini gunakan konsentrasi dekontaminasi lebih tinggi
• Uji Kesuburan Media
tanpa memperpanjang waktu paparan. Pastikan bahwa seluruh
Untuk media tanpa obat, uji kesuburan media dapat dilakukan dengan
spesimen telah terdigesti sempurna untuk mengetahui penyebab
menggunakan M. fortuitum atau mycobacterium lain yang termasuk rapid
kontaminasi. Campurkan dengan benar isi tabung agar seluruh
grower dengan standar Mc Farland 0.5 - 1.0 pada pengenceran 10 -3.
spesimen terdekontaminasi.
Jika dalam waktu 5 (lima) hari tidak terdapat pertumbuhan M. fortuitum,
media dikategorikan tidak baik dan tidak layak dipakai. Pada media yang e. Prosedur Biakan
baik akan tampak pertumbuhan yang cukup rapat. • Hindarkan kontaminasi silang biakan dengan penggunaan pipet atau
ose/loop dan terapkanlah teknik aseptik
• Penyimpanan media
• Perlu curiga pada spesimen-spesimen yang positif secara berturut-
Media dengan kualitas yang baik dilabel dan dicatat tanggal
turut atau biakan dengan beberapa koloni yang diikuti biakan positif
pembuatannya dan disimpan dalam refrigerator (5-8oC) tinggi.
Penyimpanan dapat sampai 4 minggu tetapi tutup tabung harus rapat
f. Pengukuran turbiditas dengan menggunakan standar kepekatan kuman
Penempatan tabung tidak boleh menghalangi outlet udara dingin.
menurut Mc Farland untuk inokulum. Gunakan kepekatan antara 0.5-1.0
Jangan menggunakan media yang berumur lebih dari 4 minggu atau
skala Mc Farland.
media yang kering
Catatan:
2. Tahap Analitik.
1) Kontaminasi silang umumnya terjadi melalui aerosol yang mengendap
a. Memastikan prosedur tetap di laksanakan dengan baik pada setiap
karena gaya gravitasi ke wadah lain, gagang pipet yang menyentuh
pemeriksaan
wadah tercemar.
b. Menggunakan alat sesuai standar. Kelengkapan alat dapat dibuat dalam
3. Tahap Post analitik
bentuk daftar tilik.
c. Proses pengerjaan, dekontaminasi, inokulasi dilaksanakan sesuai a. Menjamin bahwa pelaksanaan tahap pasca analisis sesuai protap yaitu
prosedur tetap pelaksanaan dekontaminasi alat dan bahan infeksius; pengelolaan limbah
d. Digesti dan dekontaminasi infeksius dan non infeksius; dan pemeliharaan alat.
b. Indikator keberhasilan :
• Pemrosesan spesimen dahak diurutkan, sesuai kapasitas sentrifus.
o Angka kontaminasi di setiap laboratorium harus selalu terpantau.
Gunakan semua rotor saat pemusingan.
Toleransi kontaminasi yang masih bisa diterima adalah 3% - 5% untuk
• Buatlah catatan persentase hasil biakan spesimen klinik yang
media padat.
99
d. Pelaporan.
o Periksa kembali pencatatan dan pelaporan sesuai dengan standar.
o Lakukan pelaporan biakan dan identifikasi segera setelah
mendapatkan hasil positif dan setelah hasil uji kepekaan selesai.
o Untuk dahak dengan hasil BTA pos, hasil biakan negatif dapat
dilaporkan sampai dengan 8 minggu, sedangkan untuk dahak BTA
neg, sebaikya menunggu sampai 12 minggu.
2. Pemantapan Mutu External (PME) atau External Quality Assurance (EQA)

Pemantapan Mutu External (PME) atau External Quality Assurance (EQA) adalah
suatu proses yang terencana dan berkesinambungan yang dilakukan oleh laboratorium
pembanding untuk menilai mutu hasil pemeriksaan biakan dan uji kepekaan.
Jejaring laboratorium uji kepekaan terdiri atas lab supranasional dan lab nasional dan
laboratorium di Fasilitas pelayanan kesehatan lain yang mampu melaksanakan uji
kepekaan. Pemantapan mutu eksternal laboratorium uji kepekaan dilakukan secara
berjenjang ke laboratorium di bawahnya
Metode yang dipakai untuk melaksanakan pengkajian mutu eksternal uji kepekaan
Mycobacterium tuberculosis:
a. Tes panel (panel testing/ proficiency testing) yaitu pengiriman isolat dari laboratorium
rujukan untuk diperiksa dan diinterpretasi. Gunakan isolat yang benar-benar telah
terstandarisasi untuk panel, dianjurkan isolat dari WHO. Jumlah isolat minimal 30
dan terdiri dari berbagai pola kepekaan. Minta laboratorium yang diuji melakukan
upaya rutin dan bukan dengan upaya khusus.
b. Supervisi/ on site evaluation/ pembinaan yaitu pemantauan mutu dan bimbingan

teknis kegiatan laboratorium TB pada waktu kunjungan supervisor.
c. Uji Silang (cross check). Cara ini lebih jarang dipakai dibandingkan dengan panel.
3. Peningkatan mutu (Quality Improvement)
Peningkatan mutu atau quality improvement merupakan proses yang terus menerus
dilakukan oleh laboratorium dengan cara menganalisis setiap aspek dalam
pemeriksaan laboratorium dan sebagai tindak lanjut hasil supervisi dan tes panel.
101
Komponen kunci dalam proses ini meliputi pengumpulan data, analisis data dan IX. PENCATATAN DAN PELAPORAN
penyelesaian masalah secara kreatif dengan cara pemantauan yang terus menerus,
Laboratorium TB harus melakukan pencatatan dan pelaporan hasil biakan dan uji
identifikasi masalah yang terjadi yang ditindaklanjuti dengan upaya perbaikan untuk
kepekaan. Hal-hal yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :
mencegah dan menghindari terulangnya kembali masalah yang sama. 1. Apabila hasil biakan terkontaminasi, harus segera dilaporkan dan perlu dilakukan
Secara umum masalah dapat terjadi akibat faktor tunggal, namun umumnya pemeriksaan spesimen ulang.
gabungan dari beberapa faktor diantaranya: 2. Apabila hasil biakan positif dan diidentifikasi sebagai Mycobacterium tuberculosis
segera dicatat dan dikirim hasilnya.
a. Kualitas bahan dasar dan bahan kerja (working dilution/ media) yang tidak baik. 3. Tanggal tumbuhnya dan karakteristik koloni dari biakan positif dicatat pada
b. Kualitas dan pemakaian alat yang tidak memenuhi syarat. register laboratorium. Biakan negatif dan biakan yang terkontaminasi juga dicatat
c. Kualitas dan kuantitas dahak dan pot dahak yang tidak memenuhi syarat. berdasarkan tanggal pelaporan.
d. Kurangnya keterampilan petugas. 4. Hasil yang dilaporkan menurut kriteria kualitatif dan kuantitatif.
e. Kepatuhan terhadap petunjuk teknis yang tidak konsisten. 5. Harus ada kesesuaian antara nomor register laboratorium dengan nomor yang
ditulis pada tabung.
f. Kesalahan administrasi (transcription error) misalnya kesalahan penulisan dan
6. Laporan hasil menggunakan format standar sesuai program TB
penyalinan.
7. Salinan laporan hasil akhir disimpan di laboratorium selama 2 tahun.
Catatan :
Supervisor laboratorium harus memahami semua aspek teknis laboratorium TB dan

setiap bulan memonitor pembuatan reagen, media, penanganan sampel, pencatatan
dan pelaporan. Misalnya catatan pembacaan pH larutan garam pada pembuatan media,
sterilisasi, dan monitoring temperatur alat.
Format laporan hasil seperti pada lampiran.
103
Lampiran 2. Tabel Penghitungan Hasil Uji Kepekaan
Jml koloni Estimasi/Jml Proporsi

tertinggi dlm koloni tertinggi (%)
No Spesi- media dengan dlm media
OAT HASIL
men OAT tanpa OAT (c/d) x 100
…………. S
I
R
E
Ofl
Am
Kn
…………. S
I
R
E
Ofl
Am
Kn
105
Lampiran 3. Form TB 05 MDR (Formulir permohonan lab TB MDR)
PENANGGULANGAN TB NASIONAL TB.05 MDR
FORMULIR PERMOHONAN LABORATORIUM TB MDR UNTUK PEMERIKSAAN DAHAK

Nama RS Rujukan TB MD : ___________________________ No. Telp. : _______________________
Nama suspek/ pasien : ___________________________ Umur : tahun
Jenis Kelamin : Laki-laki Perempuan
Alamat lengkap :________________________________________________________________
________________________________________________________________
Kabupaten/ Kota :____________________________
Propinsi :____________________________
No. Identitas Sediaan (sesuai no.Reg Suspek di TB.06 MDR) Alasan Pemeriksaan :
……/………/………/……… Diagnosis
Tgl. Pengambilan dahak terakhir : ______________ Follow up pengobatan :
Tanggal pengiriman sediaan : ______________ Bulan ke :
Tanda tangan pengambil sediaan : ______________ Follow up pasca pengobatan :
Jenis & Jumlah Pemeriksaan Klasifikasi Penyakit Bulan ke :
BTA x …………. Paru
Biakan x ................ Extra Paru No.Reg.TB MDR UPK : ________
Uji Kepekaan Lini 1 Lokasi : No.Reg.TB MDR Kab : ________
Uji Kepekaan Lini 2 Secara visual dahak tampak
Uji cepat Nanah lendir : S Bercak darah : S Air liur : S

P P P
HASIL PEMERIKSAAN LABORATORIUM

No. Register Lab. (sesuai dengan Formulir di TB.04 MDR) : …………………………
Spesimen dahak*) Tanggal Hasil Hasil BTA**) Tanggal Hasil Hasil Biakan
+++ ++ + 1-9***) Neg M.TB Neg

Sewaktu
Pagi
Spesimen dahak*) Hasil Uji Kepekaan****

Tanggal Hasil
H R E S Km Ofx Lfx Cs PAS Cm Eto
Sewaktu
Pagi
Mengetahui
Tanda tangan pemeriksa Dokter PJ pemeriksaan
(………………………….) (………………………….)
*) Diisi sesuai dengan kode huruf sesuai identitas sediaan/

w aktu pengambilan dahak.
**) Beri tanda rumput pada hasil pemeriksaan/ tingkat positif yang sesuai.
***) Isi dengan jumlah BTA yang ditemukan
****) Diisi sesuai kode : R : resisten S : sensitif TD : Tidak dilakukan
Ke te rangan :
Nomor identitas sediaan terdiri dari 4 kelompok angka dan 1 huruf , sebagai berikut :
o Kelompok angka pertama terdiri dari 2 angka, misalnya 02 yang merupakan kode RS rujukan MDR
o Kelompok angka kedua terdiri dari 3 angka, misalnya 015 yang merupakan nomor urut suspek.
o Kelompok angka ketiga terdiri dari 2 angka, misalnya 10 yang merupakan kode bulan oktober.
o Kelompok angka keempat terdiri dari 2 angka, misalnya 08 yang merupakan kode untuk tahun 2008.
o Kode huruf :
- Penegakan diagnosis A = dahak sew aktu pertama, B = dahak pagi
- Follow up bulan ke 1, C
- Follow up bulan ke 2, D
- dan seterusnya sampai akhir pengobatan
o Contoh nomor identitas sediaan : 02/015/10/08 A, 02/015/10/08 B dan 02/015/10/08 C
107
No. Alat Pemeliharaan Dilakukan oleh Lampiran 6. Rekapitulasi hasil biakan
7 Deep freezer- Suhu : setiap hari Teknisi lab
200Cdan
-700C Dihubungkan dengan alarm untuk mengetahui suhu REKAPITULASI HASIL BIAKAN Mycobacterium tuberculosis
dan sirkulasi udara.
Nama Laboratorium : ………………………….......…………………………….
Bersihkan setiap 6 bulan
8 Inkubator Suhu: setiap hari Teknisi lab
Provinsi : …………………………………………………………….
Sterilitas/indikator biologi
9 Vortex Frekuensi getaran : 1x/th Lab. kalibrasi
Tahun : …………………………………………………………….
10 Air Condition Suhu, kelembaban,aliran udara: 1x/3 bulan Teknisi AC
Penanggungjawab : …………………………………………………………….
11 Refrigerator Suhu: diukur dengan thermometer setiap hari , Teknisi lab
defrost setiap 3 bulan Triwulan Hasil BTA Hasil Biakan
12 Nefelometer Tera Skala McFarland:1x/tahun Teknisi Alat Inokulasi Suspek, tidak dalam pengobatan Follow Up
13 pHmeter Uji dengan larutan buffer stándar pH 4.0 dan 7.0 Kontaminasi Neg Pos Total Kontaminasi Neg Pos Total
TW 1 Positif
Dilakukan setiap akan digunakan
Scanty
Negatif
Tidak Diketahui
Total
TW 2 Positif
Scanty
Negatif
Tidak Diketahui
Total
TW 3 Positif
Scanty
Negatif
Tidak Diketahui
Total
TW 4 Positif
Scanty
Negatif
Tidak Diketahui
Total
Total
109
Lampiran 7. Rekapitulasi Hasil Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis Lampiran 8. Tabel Pemeliharaan dan Kalibrasi Alat
KASUS PUTUS GAGAL KAMBUH No. Alat Pemeliharaan Dilakukan oleh

BARU OBAT 1 BSC - Cek harian BSC meliputi : Teknisi
JML % JML % JML % JML % bersertifikat
Pastikan bahwa laju aliran udara yang melewati
Jumlah pemeriksaan bagian depan yang terbuka adalah 75 linier feet/
Sensitif dengan 4 menit (22.86 meter/detik) untuk klas I dan 75
macam obat sampai 100 linier feet//menit (22.86 sampai 30.48
meter/detik) untuk kabinet klas II
Resisten terhadap
Isoniazid (H) - HEPA filter, tekanan udara : 1x/6 bulan
Rifampicin ( R ) - kecepatan aliran udara memakai anemometer
Ethambutol (E)
- arah aliran udara dengan asap
Streptomycin (S)
Monoresisten - lampu UV : 1x/6 bulan, periksa dengan UV light
meter, diganti bila <70%
Isoniazid (H)
Rifampicin ( R ) - kebocoran kabinet
Ethambutol (E) - aliran listrik
Streptomycin (S)
- tes getaran
Multi Drug resistance
H+R - tes kebisingan
H+R+E 2 Sentrifus - Uji kecepatan dengan tachometer RPM : 1x/6 Teknisi lab.terlatih
bulan
H+R+S
H+R+S+E - Tekanan udara : setiap hari
Kombinasi lain - Suhu: setiap hari

H+E 3 Pipet 1x/tahun, volumetrik Lab.kalibrasi
H+S 4 Autoclave tekanan, suhu : 1x/tahun Lab,kalibrasi
H+E+S Sterilitas: dengan spora strip : 1x/bulan Teknisi lab.
R+E 5 Hot Air oven / - Suhu: setiap hari Teknisi lab
R+S Inspisator
- Bersihkan alat ini setelah selesai penyiapan
R+E+S setiap batch media
E+S 6 Analitycal bal- Berat massa /tera: 1x/th Metrologi
ance
111
Lampiran 9.
FORMULIR PEMANTAPAN MUTU INTERNAL
Pembuatan Media TB (…………………………………..)
No Tangal Jenis Jumlah Uji Sterilitas Hasil Uji Keterangan Paraf

Pembuatan Media (Volume) (5%)
Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium

113
114 Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium

Booklet JUKNIS Biakan OK

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Booklet JUKNIS Biakan OK

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Petunjuk Teknis

Pemeriksaan Biakan, Identifikasi, Dan

Peran laboratorium dalam menegakkan mendiagnosis dan melakukan follow

Pemeriksaan biakan, identifikasi dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis

Kami mengucapkan terima kasih kepada Kelompok Kerja Laboratorium TB dan

Harapan kami semoga petunjuk teknis ini bermanfaat bagi semua

1. Judul I. TUBERCULOSIS - DIAGNOSIS dr. Supriyantoro, SpP, MARS

Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium

Manajemen Terpadu Pengendalian TB Resisten Obat bertujuan untuk menemukan

Prof Dr. Tjandra Yoga Aditama

Prof. Dr. Agus Sjahrurachman, Sp.MK, PhD - Dept. Mikrobiologi FKUI

Dr. Endang Woro, Sp.PK - RS Persahabatan

e. bahwa berdasarkan pertimbangan sebagaimana dimaksud pada

DIRJEN BINA UPAYA KESEHATAN;

KATA PENGANTAR .......................................................................................................i

AKMS : Advokasi, Komunikasi, Mobilisasi Sosial

penemuan kasus TB MDR dilakukan dengan pemeriksaan apusan dahak mikroskopis,

Sesuai kriteria suspek TB MDR berkisar 99%.

simiae, M. asiaticum. TB MDR dan TB XDR.

1. Uji serologi untuk mendeteksi/mengukur kadar antibodi terhadap komponen

2. Uji serologi untuk mendeteksi antigen.

Nomor 1 sampai 4 digolongkan sebagai M. tuberculosis complex.

a. Mikroskopis : DIII Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TB

Sirkulasi udara di laboratorium harus dilakukan melalui pertukaran udara minimal 6

Penerimaan spesimen (1) HL TP TP

No Alat Spesifikasi/penggunaan Jumlah

1 Otoklaf “mixed load pressure cooker type “ atau 1

Pasokan Air Catatan :

2. Penanganan dan Pengiriman Spesimen

Pengumpulan spesimen, pengiriman dan penanganan spesimen yang tidak benar

Pengiriman spesimen ke laboratorium lain

4. Penggunaan sengkelit/ ose/ loop

Perbedaan diantara Mycobacterium tuberculosis complex dapat dilihat pada tabel

Tabel 7. Diferensiasi diantara Mycobacterium tuberculosis complex

Kata- Hidro- Kepe-

Gambar 7. Alur Kerja Identifikasi Rutin

*Subkultur hanya dilakukan apabila

2. Cara pengumpulan dahak :

1) Bahan a. Spesimen diterima di bagian penerimaan di laboratorium

B. Pembuatan Media Lowenstein-Jensen dan kering

a. Bahan dasar Medium LJ dengan komposisi : b. Pembuatan media LJ :

Cara pengolahan dahak c. Pengolahan dengan NaOH 4%

kuat. 4) Tambahkan larutan PBS sampai volumen > 45 ml dengan menggunakan

Cara kerja Reagen

Alat dan bahan :

4. Inkubasi dengan cara sebagai berikut :

Misalnya lebih dari 10 kali Bahan yang diperlukan :

M. Pengiriman Isolat ke Laboratorium Rujukan

Pengiriman subkultur ke laboratorium dilakukan untuk tujuan mengidentifikasi isolat,

g. Uji Biokimia B. Komponen Pemantapan Mutu Laboratorium Tuberkulosis

2. Pemantapan Mutu External (PME) atau External Quality Assurance (EQA)

b. Supervisi/ on site evaluation/ pembinaan yaitu pemantauan mutu dan bimbingan

3. Peningkatan mutu (Quality Improvement)

Supervisor laboratorium harus memahami semua aspek teknis laboratorium TB dan

Format laporan hasil seperti pada lampiran.

Jml koloni Estimasi/Jml Proporsi

PENANGGULANGAN TB NASIONAL TB.05 MDR

FORMULIR PERMOHONAN LABORATORIUM TB MDR UNTUK PEMERIKSAAN DAHAK

Uji cepat Nanah lendir : S Bercak darah : S Air liur : S

HASIL PEMERIKSAAN LABORATORIUM

+++ ++ + 1-9***) Neg M.TB Neg

Spesimen dahak*) Hasil Uji Kepekaan****

*) Diisi sesuai dengan kode huruf sesuai identitas sediaan/

KASUS PUTUS GAGAL KAMBUH No. Alat Pemeliharaan Dilakukan oleh