Booklet JUKNIS Biakan OK PDF

Petunjuk Teknis
Pemeriksaan Biakan, Identifikasi, Dan

Uji Kepekaan Mycobacterium
tuberculosis pada Media Padat
KEMENTERIAN KESEHATAN RI
DIREKTORAT JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN
ii
Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Idenfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium

tuberculosis dengan Media Padat
DIREKTORAT JENDERAL PENGENDALIAN PENYAKIT DAN

PENYEHATAN LINGKUNGAN
2012
KATA PENGANTAR
Kekebalan Mycobacterium tuberculosis
terhadap Obat Anti TB merupakan
permasalahan yang harus segera ditanggulangi di Indonesia. Laporan global ke-3

tentang surveilans resistensi OAT menunjukkan beberapa daerah di dunia menghadapi
endemi dan epidemi TB-MDR, dan di beberapa wilayah terdapat angka resistensi yang
sangat tinggi. Saat ini menurut WHO Indonesia menduduki peringkat ke delapan dari 27
negara dengan jumlah kasus MDR tertinggi.
Peran laboratorium dalam menegakkan mendiagnosis dan melakukan follow
up dengan pemeriksaan sensitifitas OAT lini pertama dan kedua sangat diperlukan,
sehingga laboratorium harus meningkatkan kemampuan pemeriksaan biakan dan DST.
Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis
pada media padat.
Pemeriksaan biakan, identifikasi dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis
terhadap OAT disusun untuk menjadi acuan laboratorium pemeriksa TB agar terjamin
mutunya, disamping untuk memudahkan perencanaan, pelaksanaan, pengawasan dan
pengembangan laboratorium.
Kami mengucapkan terima kasih kepada Kelompok Kerja Laboratorium TB dan
semua pihak yang telah bekerja sama untuk menyusun Pedoman Pemeriksaan Biakan
dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dari saluran pernapasan.
Harapan kami semoga petunjuk teknis ini bermanfaat bagi semua
laboratorium khususnya laboratorium pemeriksa biakan dan uji kepekaan M.TB dalam
Katalog Dalam Terbitan. Kementerian Kesehatan RI
616.995 1
Ind
p
Indonesia. Kementerian Kesehatan RI. Direktorat

Jenderal Bina Upaya Kesehatan
Petunjuk teknis pemeriksaan biakan, indentifikasi,
dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis
pada media padat,-- Jakarta : Kementerian
Kesehatan RI. 20121
menjamin mutu pemeriksaannya.
Jakarta, Desember 2011

Direktur Jenderal Bina Upaya Kesehatan
ISBN 978-602-235-144-3
1. Judul
I. TUBERCULOSIS - DIAGNOSIS
II. TUBERCULOSIS - LABORATORY MANUALS
III. MICROSCOPY - LABORATORY MANUALS
IV. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
dr. Supriyantoro, SpP, MARS

KATA SAMBUTAN
Bina Upaya Kesehatan tentang petunjuk teknis pemeriksaan

biakan, identifikasi dan uji kepekaan M.tuberculosis pada media
padat;
Mengingat
: 1.
2.
Undang-Undang Nomor 29 Tahun 2004 tentang Praktik

Kedokteran (Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2004
Nomor 116, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia
Nomor 4431);
Undang-Undang Nomor 36 Tahun 2009 tentang Kesehatan
(Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2009 Nomor 144,
Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 5063);
3.
Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 411/Menkes/Per/III/ 2010

tentang Laboratorium Klinik;
4.
Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 1144/Menkes/Per/ XI/2010

tentang Organisasi dan Tata Kerja Kementerian Kesehatan RI;
5.
Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 1647/Menkes/SK/ XII/2005

tentang Pedoman Jejaring Pelayanan Laboratorium Kesehatan;
6.
Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 364/Menkes/SK/V/ 2009

tentang Pedoman Penanggulangan Tuberkulosis;
7.
Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 831/Menkes/SK/IX/ 2009

tentang Standar Reagen Ziehl Neelsen;
8.
Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 835/Menkes/SK/IX/ 2009

tentang Pedoman Keselamatan dan Keamanan Laboratorium
Mikrobiologik dan Imunologik.
Manajemen Terpadu Pengendalian TB Resisten Obat bertujuan untuk menemukan

sebanyak mungkin pasien TB MDR sehingga dapat pemutus rantai penularan pasien TB
MDR. WHO memperkirakan terdapat 440.000 kasus TB MDR pada tahun 2008 dengan
angka kematian sekitar 150.000. Di Indonesia, diperkirakan terdapat 6.100 pasien TB
MDR setiap tahunnya. Sesuai dengan data survei resistensi OAT yang dilaksanakan
di Jawa Tengah, diperoleh data resistensi sebesar 1,9% untuk kasus baru dan 17,1%
untuk kasus dengan pengobatan ulang.
Laboratorium TB merupakan unit terdepan dalam diagnosis dan evaluasi
penatalaksanaan pasien TB MDR. Diagnosis pasien TB MDR dilakukan melalui
pemeriksaan biakan dan uji kepekaan kuman Mycobacterium tuberculosis. Laboratorium
yang melaksanakan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan harus mengikuti standar
internasional dan terpantau mutunya.
Saat ini terdapat banyak metode pemeriksaan biakan, identifikasi, dan uji kepekaan
Mycobacterium tuberculosis dengan keunggulan dan kelemahan masing-masing.
Pemeriksaan laboratorium yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian yang besar
bagi pasien, keluarga, masyarakat, dan pemerintah.
Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Identifikasi dan Uji Kepekaan
Mycobacterium tuberculosis dengan media padat ini disusun untuk memberikan panduan
bagi laboratorium agar dapat melaksanakan pemeriksaan biakan, identifikasi dan uji
kepekaan Mycobacterium tuberculosis lini pertama sesuai standar.
Kami mengucapkan terima kasih kepada Kelompok Kerja Laboratorium TB dan
semua pihak yang telah bekerja sama untuk menyusun petunjuk teknis ini. Semoga
buku ini bermanfaat bagi semua laboratorium khususnya laboratorium yang melakukan
pemeriksaan biakan dan uji kepekaan TB dalam menjamin mutu pemeriksaannya.
Jakarta, Agustus 2012
Direktur Jenderal PP dan PL
Prof Dr. Tjandra Yoga Aditama

NIP. 195509031980121001
vi


iii
TIM PENYUSUN
Prof. Dr. Agus Sjahrurachman, Sp.MK, PhD
- Dept. Mikrobiologi FKUI
Dra. Ning Rintiswati, MSc
- Bag. Mikrobiologi FK UGM
Dr. Tintin Gartinah, Sp.PK
- BLK Provinsi Jabar
Drs. Isak Solihin
- BLK Provinsi Jabar
Dr. Endang Woro, Sp.PK
- RS Persahabatan
Dr. Renaldi Panjaitan, Sp.MK
- RS Persahabatan
Dr. Endriyana Soerjat, Sp.PK
- BBLK Surabaya
Dr. Koesprijanti, Sp.PK
- BBLK Surabaya
KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA
NOMOR : HK.02.04/V/1808/2012
.
TENTANG
PETUNJUK TEKNIS PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN
UJI KEPEKAAN MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PADA MEDIA PADAT
DENGAN RAHMAT TUHAN YANG MAHA ESA
DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN,
Menimbang
Dr. I Wayan Diantika
- Subdit TB, Dit. P2ML
Dr. Irfan Ediyanto
Dr. Retno Kusuma Dewi
Dr. Sri Widyastuti
- Subdit MI, Dit. BPPM
Dr. A.W. Praptiwi
Dr. Wiwi Ambarwati
Agus Susanto, SKM
Dr. Harini Janiar, Sp.PK
- KNCV
Roni Candra, S.Si, M.Biomed
- KNCV
: a.
bahwa penyakit Tuberkulosis merupakan penyakit menular

yang masih menjadi masalah kesehatan masyarakat dan salah
satu penyebab kematian sehingga perlu dilaksanakan program
pengendalian secara berkesinambungan;
b.
bahwa pelayanan laboratorium Tuberkulosis merupakan

komponen
kunci
pengendalian
Tuberkulosis
yang
diselenggarakan oleh berbagai jenis laboratorium pada berbagai
tingkat pelayanan laboratorium;
c.
bahwa peran laboratorium dalam menegakkan diagnosis dan

melakukan follow up dengan pemeriksaan OAT lini pertama dan
kedua sangat diperlukan;
d. bahwa untuk menjamin mutu pelayanan laboratorium dalam
pemeriksaan biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tb perlu
adanya acuan yang bisa segera digunakan bagi petugas teknis
laboratorium dalam melakukan pemeriksaan;
e.
iv

bahwa berdasarkan pertimbangan sebagaimana dimaksud pada

huruf a, b, c dan d perlu ditetapkan Keputusan Direktur Jenderal

VI. ALUR KERJA BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN

Mycobacterium tuberculosis ..............................................................................43
VII. PRAKTEK LABORATORIUM .............................................................................51
A. Pengambilan, Pengiriman dan Penerimaan Spesimen .................................51
B. Pembuatan Media Lowenstein-Jensen...........................................................54
C. Biakan Mycobacterium tuberculosis ..............................................................57
D. Pembacaan Hasil Biakan .................................................................................62
MEMUTUSKAN :
Menetapkan
Kesatu
: KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN

TENTANG PETUNJUK TEKNIS PEMERIKSAAN BIAKAN,
IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN MYCOBACTERIUM
TUBERKULOSIS PADA MEDIA PADAT.
: Petunjuk Pelaksanaan sebagaimana dimaksud dalam Diktum
Kesatu sebagaimana terlampir dalam Lampiran Keputusan ini.
: Petunjuk Pelaksanaan sebagaimana dimaksud dalam Diktum Kedua
agar digunakan sebagai acuan bagi petugas teknis laboratorium
yang terkait dalam melakukan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan
Mycobacterium tuberculosis.
: Pembinaan dan pengawasan pelaksanaan Keputusan ini dilakukan
oleh Direktur Jenderal Bina Upaya Kesehatan, Direktur Jendaral
Pengendalian
Penyakit dan Penyehatan Lingkungan, Dinas
Kesehatan Provinsi dan Dinas Kesehatan Kabupaten/ Kota sesuai
tugas dan fungsinya masing-masing.
: Keputusan ini mulai berlaku pada tanggal ditetapkan.
E. Subkultur Isolat Mycobacterium tuberculosis ..............................................63

F. Identifikasi Mycobacterium tuberculosis .......................................................69
G. Pembuatan Media untuk Uji PNB dan Resistensi .........................................75
H. Pembuatan Suspensi Kuman untuk Uji Kepekaan........................................79
I. Uji Resistensi Mycobacterium tuberculosis Cara Proporsi ..........................81
Kedua
Ketiga
J. Interpretasi Hasil Uji Kepekaan .......................................................................84

K. Preservasi Kuman pada Suhu -70oC..............................................................87
L. Resusitasi Mycobacterium tuberculosis dari -70oC .....................................89
Keempat
M. Pengiriman Isolat ke Laboratorium Rujukan .................................................89

N. Pengelolaan Limbah.........................................................................................90
VIII. PEMANTAPAN MUTU BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN .....................................93
A. Tujuan Pemantapan Mutu ................................................................................93
Kelima
B. Komponen Pemantapan Mutu Laboratorium Tuberkulosis .........................93

IX. PENCATATAN DAN PELAPORAN .....................................................................103
Ditetapkan di :
Jakarta
Pada tanggal : 27 September 2012
DIRJEN BINA UPAYA KESEHATAN;
SUPRIYANTORO


vii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR .......................................................................................................i
KATA SAMBUTAN .......................................................................................................iii
TIM PENYUSUN ..........................................................................................................iv
KEPUTUSAN DIRJEN BINA UPAYA KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN
REPUBLIK INDONESIA NOMOR : HK.02.04/V/1808/2012 ......................................v
DAFTAR ISI .................................................................................................................ix
DAFTAR TABEL ..........................................................................................................xi
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................xii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................xiii
DAFTAR SINGKATAN ...............................................................................................xiv
I. PENDAHULUAN .......................................................................................................1
A. Latar Belakang ....................................................................................................1
B. Tujuan Petunjuk Teknis ......................................................................................4
II. MANFAAT PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN
PADA PROGRAM PENGENDALIAN TB .................................................................5
A. Biakan Mycobacterium tuberculosis ................................................................7
B. Uji kepekaan ( Drug Susceptibility Test/ DST) .................................................9
III. KARAKTERISTIK MYCOBACTERIA .................................................................... 11
IV. SUMBER DAYA LABORATORIUM .......................................................................15
A. Ruang laboratorium .........................................................................................15
B. Peralatan dan penjaminan kinerja alat, termasuk kalibrasi .........................23
V. KEAMANAN KERJA UNTUK BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN ............................29
A. Desain Laboratorium........................................................................................29
B. Pedoman Umum Keamanan Laboratorium ....................................................29
C. Pedoman Khusus .............................................................................................32
D. Penanganan Limbah. .......................................................................................38
E. Penanganan Tumpahan Infeksius ...................................................................39
viii


ix
DAFTAR SINGKATAN
AKMS
Am
APD
BSC
BTA
CPC
DOTS
DST
E
EQA
Fasyankes
Gerdunas TB
HEPA
HIV
ISTC
INH (H)
Km
LJ
MDR
MGIT
MODS
MOTT
NASBA
NRA
NTM
OAT
PCR
PME
PMI
PMO
PNB
PPE
R
RAN
S
SDA PCR
TB
WHO
XDR
Z
xiv
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
Advokasi, Komunikasi, Mobilisasi Sosial

Amikasin
Alat Pelindung Diri
Biological Safety Container
Bakteri Tahan Asam
Cetyl Piridium Chloride
Directly Observed Treatment Shortcourse
Drug Susceptibility Test
Ethambutol
External Quality Assurance
Fasilitas Pelayanan Kesehatan
Gerakan Terpadu Nasional TB
High Efficiency Particulate Air
Human Immunodeficiency Virus
International Standar for TB Care
Isoniazid
Kanamisin
Lowenstein Jensen
Multiple Drugs Resistance
Mycobacteria Growth Indicator Tube
Mycroscopic Observation of Drug Susceptibility
Mycobacterium Other Than Tuberculosis
Nucleic Acid Sequence Based Amplification
Nitrate Reduction Assay
Non Tuberculosis Mycobacteria
Obat Anti Tuberkulosis
Polymerase Chain Reaction
Pemantapan Mutu Eksternal
Pemantapan Mutu Internal
Pengawas Menelan Obat
Para Nitro Benzoic Acid
Personal Protective Equipment
Rifampisin
Rencana Aksi Nasional
Streptomisin
Strand Displacement Amplification
Tuberkulosis
World Health Organization
Extremely Drugs Resistance
Pyrazinamid

DAFTAR TABEL
Tabel 1
Tabel 2
Tabel 3
Tabel 4
Tabel 5
Tabel 6
Tabel 7
Tabel 8
Tabel 9
Jumlah BTA apusan, konsentrasi basil dalam spesimen dahak, dan

kemungkinan mendapatkan hasil positif................................................
Mycobacteria yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia..........
Kisi-kisi hubungan antar ruang di laboratorium dan laboratorium Mycobacterium tuberculosis.........................................
Peralatan laboratorium biakan dan uji kepekaan dengan media padat
untuk beban kerja 6000 uji/tahun ...................
Alat pendukung (beban kerja 6000 uji/tahun) .......
Bahan habis pakai untuk Biakan dan uji kepekaan Mycobacterium
tuberculosis .................................
Diferensiasi diantara Mycobacterium tuberculosis complex ..................
Pendugaan Spesies Mycobacteria .....
Pembuatan larutan sesuai dengan kebutuhan ........

5
13
18
24
25
27
45
46
60
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1
Gambar 2
Gambar 3
Gambar 4
Gambar 5
Gambar 6
Gambar 7
Gambar 8
xii
Contoh denah laboratorium sederhana untuk biakan dan uji

kepekaan Mycobacterium tuberculosis ( WHO 1998)..
Contoh lay out laboratorium pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis dengan fasilitas biomolekuler.....
Tanda baku biohazard international
Skema wadah spesimen rujukan .
Skema aliran udara pada BSC Kelas II .
Alur Biakan dan Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
Alur Kerja Identifikasi Rutin
Alur Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis .

DAFTAR LAMPIRAN
16
20
30
34
36
43
47
48
Lampiran 1
Lampiran 2
Log Book Pembacaan Uji Kepekaan .

Format Pembacaan Hasil Uji Resistensi ...........................
104
105
Lampiran 3
Lampiran 4
Lampiran 5
Lampiran 6
Lampiran 7
Lampiran 8
Form TB.05 MDR (Permohonan Lab TB MDR) .................

Form TB 04 MDR (Register Laboratorium TB MDR) .........
Form TB.06 MDR (Register Suspek TB MDR) ..................
Rekapitulasi hasil biakan ...................................................
Rekapitulasi hasil uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis .....
Tabel Pemeliharaan dan Kalibrasi Alat ......................................
106
107
108
109
110
Lampiran 9
111
Formulir Pemantapan Mutu Internal .......................................... 113

xiii
pemeriksaan biakan dan uji kepekaan; pengelolaan pasien TB MDR menggunakan
LAMPIRAN
KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN
NOMOR : HK.02.04/V/1808/2012
TANGGAL : 27 SEPTEMBER 2012
strategi pengobatan yang tepat dengan OAT lini kedua; jaminan ketersediaan OAT lini
kedua yang berkualitas dan tidak terputus serta pencatatan pelaporan secara baku.
I. PENDAHULUAN
Diagnosis yang akurat dan tepat waktu merupakan tulang punggung program TB.
Resistensi OAT harus didiagnosis secara tepat sebelum dapat diobati secara efektif.
penemuan kasus TB MDR dilakukan dengan pemeriksaan apusan dahak mikroskopis,
biakan dan uji kepekaan di laboratorium yang terjaga mutunya. Selain itu, dengan
meningkatnya kasus HIV/AIDS, diagnosis TB secara mikroskopik tidak memadai. Hal ini
memerlukan upaya pengembangan kemampuan laboratorium yang mampu melakukan
biakan, identifikasi, dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT atau
Drug Sensitivity Test (DST).
A. Latar Belakang
Tuberkulosis (TB) adalah suatu penyakit infeksi yang menular, disebabkan oleh
kuman Mycobacterium tuberculosis. Penularan langsung terjadi melalui aerosol yang
mengandung kuman TB. Penyakit ini dapat menyerang semua kelompok umur dan
semua organ tubuh manusia, terutama paru. Gejala umum TB paru pada orang dewasa
adalah batuk yang terus-menerus dan berdahak, selama 2 - 3 minggu atau lebih. Bila
tidak diobati maka setelah lima tahun sebagian besar (50%) pasien akan meninggal.
Uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap obat bermanfaat bagi klinisi dalam
mengarahkan jenis obat yang akan diberikan kepada penderita. Ini sangat penting
Sejak tahun 1995 Indonesia mulai menerapkan strategi DOTS (Directly Observed
karena pemberian OAT yang tidak tepat, tidak hanya akan menyebabkan kegagalan
Treatment Shortcourse) untuk digunakan sebagai satu-satunya strategi pengendalian
pengobatan, tetapi juga menyebabkan penularan terus berlangsung dan mempercepat
TB di Indonesia, yang dimulai pelaksanaannya di Puskesmas sebagai ujung tombak
kejadian dan penyebaran TB MDR dan XDR.
pelayanan kesehatan di Indonesia.
Saat ini terdapat banyak metode pemeriksaan biakan, identifikasi, dan uji kepekaan
Mycobacterium tuberculosis dengan keunggulan dan kelemahan masing-masing.
Namun hasil uji kepekaan dengan cara yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian
yang besar bagi pasien, keluarganya, masyarakat, dan pemerintah. Oleh karena itu
perlu disusun Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Identifikasi dan Uji Kepekaan
Mycobacterium tuberculosis yang meliputi : sumber daya manusia, fasilitas laboratorium,
Strategi DOTS telah dibuktikan dengan berbagai uji coba lapangan dapat memberikan
angka kesembuhan yang tinggi. Strategi DOTS merupakan strategi kesehatan yang
paling cost effective. Satu studi cost benefit yang dilakukan oleh WHO di Indonesia
menggambarkan bahwa setiap satu dolar Amerika yang digunakan untuk membiayai
program penanggulangan TB, akan menghemat sebesar 55 dolar Amerika selama 20
bahan habis pakai, metode pemeriksaan, pemantapan mutu serta pencatatan dan
tahun. Agar berhasil baik, diperlukan implementasi dari lima komponen strategi DOTS,
pelaporan.
yaitu :
B. Tujuan Petunjuk Teknis
1. Komitmen politis dari para pengambil keputusan, termasuk dukungan dana.
1. Pemeriksaan biakan, identifikasi dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis

terhadap OAT terjamin mutunya.
2. Memudahkan perencanaan, pelaksanaan, pengawasan dan pengembangan
laboratorium
3. Memudahkan pengembangan program baru berbasis data yang akurat.
2. Diagnosis TB dengan pemeriksaan dahak secara mikroskopik.

3. Kesinambungan persediaan OAT jangka pendek.
4. Pengobatan dengan paduan Obat Anti Tuberkulosis (OAT) jangka pendek dengan
pengawasan langsung oleh Pengawas Menelan Obat (PMO).
5. Pencatatan dan pelaporan secara baku untuk memudahkan pemantauan dan
evaluasi program TB.


1 1
Untuk menjamin keberhasilan penanggulangan TB kelima komponen tersebut di atas
HDL). Titik berat manajemen program meliputi: perencanaan, pelaksanaan,
harus dilaksanakan secara bersamaan.
monitoring dan evaluasi serta menjamin ketersediaan sumber daya (dana, tenaga,
Kebijakan DOTS di Indonesia :
1. Penanggulangan TB di Indonesia dilaksanakan sesuai dengan asas desentralisasi

dengan Kabupaten/Kota sebagai titik berat program yang meliputi: perencanaan,
pelaksanaan, monitoring dan evaluasi, serta menjamin ketersediaan sumber daya
(dana, tenaga, sarana dan prasarana).
2. Upaya penanggulangan dilaksanakan secara terintegrasi di Fasilitas Pelayanan

Kesehatan (Fasyankes) berdasar kemitraan, dengan menggunakan strategi DOTS,
peningkatan mutu pelayanan, Obat Anti TB (OAT) diberikan secara cuma-cuma,
serta mempertahankan dan meningkatkan mutu pelayanan laboratorium TB.
3. Kebijakan lain untuk mendukung keberhasilan Program Pengendalian TB (P2TB)
sarana dan prasarana)

2. Penanggulangan TB MDR dilaksanakan dengan menggunakan strategi DOTS
dimana setiap komponen yang ada lebih ditekankan kepada penata laksanaan TB
MDR dan disebut sebagai PMDT (Programmatic Management of Drug Resistant
TB).
3. Penguatan kebijakan untuk meningkatkan komitmen para pelaksana terhadap
program penanggulangan TB MDR
4. Penguatan PMDT dan pengembangannya ditujukan terhadap peningkatan mutu
pelayanan, kemudahan akses untuk penemuan dan pengobatan sehingga mampu
memutuskan rantai penularan dan mencegah terjadinya TB XDR.
adalah mempertahankan dan meningkatkan komitmen daerah, advokasi, komunikasi
5. Tatalaksana penanggulangan TB MDR mengacu kepada strategi DOTS dan ISTC.
dan mobilisasi sosial (AKMS) terhadap sektor terkait, dalam wujud Gerakan Terpadu
6. Pengembangan wilayah disesuaikan dengan rencana pengembangan PMDT yang
Nasional Penanggulangan TB (Gerdunas TB).
4. Diagnosis kasus terutama didasarkan atas pemeriksaan mikroskopik BTA, kecuali

untuk kasus pada anak.
5. DOTS mengasumsikan bahwa semua Mycobacterium tuberculosis yang menjadi

penyebab masih peka terhadap semua OAT lini primer.
ada dalam Stranas TB dan RAN PMDT, secara bertahap sehingga seluruh wilayah
Indonesia dapat mempunyai akses terhadap pelayanan TB MDR yang bermutu.
7. Titik berat pelayanan pasien TB MDR adalah pada fasyankes rujukan dan jejaringnya.
8. Pembiayaan penatalaksanaan pasien TB MDR menjadi tanggung jawab Pemerintah
pusat dan daerah, melalui mekanisme yang ada.
Tingginya angka default serta penggunaan obat-obat TB lini pertama dan kedua yang
9. Laboratorium TB merupakan unit yang terdepan dalam diagnosis dan evaluasi
tidak rasional khususnya oleh rumah sakit dan sektor swasta serta kecenderungan
penata laksanaan pasien TB MDR sehingga kemampuan dan mutu laboratorium
peningkatan kasus HIV memberikan tantangan ke depan yang besar dalam masalah
harus sesuai standar internasional dan selalu dipertahankan kualitasnya untuk
TB-MDR. Dewasa ini kasus TB-MDR dan bahkan TB-XDR telah ditemukan di Indonesia.
biakan dan uji kepekaan M. Tuberculosis. Diagnosis TB MDR harus berdasarkan
Menurut perkiraan WHO secara nasional angka MDR sekitar 2-3% untuk kasus baru. Dari
hasil pemeriksaan uji kepekaan, tidak boleh berdasarkan klinis saja
data survei resistensi OAT yang dilaksanakan di Jawa Tengah, diperoleh data resistensi
sebesar 1,9% untuk kasus baru dan 17,1% untuk kasus dengan pengobatan ulang.
Penatalaksanaan kasus TB MDR (Manajemen Terpadu Pengendalian TB Resisten Obat)
dimulai dengan suatu uji pendahuluan di 2 wilayah pada tahun 2009, yang saat ini telah
menjadi bagian dari Program Nasional TB dengan mengambil kebijakan sebagai berikut:
10. Pemerintah menyediakan OAT TB MDR yang berkualitas untuk pasien TB MDR.
11. Mempersiapkan sumber daya manusia yang kompeten dalam jumlah yang memadai
untuk meningkatkan dan mempertahankan kinerja program.
12. Meningkatkan dukungan masyarakat bagi pasien TB dan keluarga.
13. Memberikan kontribusi terhadap komitmen global.
1. Penanggulangan TB MDR di Indonesia dilaksanakan sesuai tatalaksana
penanggulangan TB yang berlaku saat ini dengan mengutamakan tata hubungan
Strategi penerapan Manajemen Terpadu TB Resisten Obat membutuhkan komitmen yang
sarana kesehatan rujukan dan sarana kesehatan dasar (Hospital DOTS Linkage/
berkesinambungan dari semua pihak; penemuan pasien TB MDR yang rasional melalui


Dengan meningkatnya kasus-kasus HIV/AIDS maka masalah NTM juga meningkat.

Diagnosis NTM pada kasus HIV/AIDS secara mikroskopis mempunyai sensitivitas
yang rendah, karena itu diperlukan pemeriksaan biakan. Pemeriksaan biakan dapat
meningkatkan sensitivitas untuk diagnosis dan sekaligus membedakan Mycobacterium
tuberculosis dan NTM.
Ada peningkatan kepekaan untuk mendeteksi BTA dengan biakan, secara mikroskopis
II. MANFAAT PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN

PADA PROGRAM PENGENDALIAN TB
Pengunjung poliklinik dengan gejala saluran pernafasan merupakan kelompok prioritas
penemuan pasien, karena pasien BTA (+) yang merupakan sumber penularan, terdapat
pada kelompok tersebut. Saat ini pasien BTA positif adalah kelompok terbesar pasien
TB yang ditemukan dan dilaporkan di negara berkembang.
untuk mendapatkan 50% kesempatan BTA positif diperlukan kuman BTA dalam dahak
5000 kuman per ml jika diperiksa 300 Lapang Pandang, sementara dengan teknik biakan
Dalam buku Pedoman Nasional Pengendalian TB pada tahun 2011 yang diterbitkan
yang baik hasil positif dapat terjadi walau kuman hidup berkisar antara 10-100 kuman
Kementerian Kesehatan, diagnosis TB paru dilakukan dengan pemeriksaan 3 spesimen
per ml. Pada umumnya biakan dahak akan meningkatkan penemuan kasus sekitar 20
dahak, salah satu di antaranya adalah dahak pagi hari, yang lain adalah dahak sewaktu
30 % dari jumlah keseluruhan TB Paru BTA positif. Oleh sebab itu pemeriksaan biakan
yang diambil saat pasien datang ke Fasyankes. Dahak pagi biasanya lebih sering
sangat bermanfaat untuk kasus pausibasiler (kasus dengan jumlah kuman sedikit)
memberikan hasil BTA positif dibanding dengan dahak sewaktu.
seperti pada TB ekstra paru, TB anak dan TB pada kondisi penekanan sistem imun.
Pemeriksaan dahak secara mikroskopis adalah metode pemeriksaan yang paling
Biakan dahak merupakan suatu metode pemeriksaan yang kompleks, membutuhkan
sederhana, cepat, terpercaya dan paling murah untuk diagnosis pasien TB. Sekitar
sarana, prasarana dan peralatan yang lebih mahal serta sumber daya manusia dengan
70 80 % TB Paru BTA positif dapat terdeteksi, bila penemuan tersangka TB dilaksanakan
keterampilan khusus.
sesuai pedoman yang telah dikeluarkan oleh Kementerian Kesehatan. Pada negara yang
Indikasi utama pemeriksaan biakan dan uji kepekaan adalah sebagai berikut :
Sesuai kriteria suspek TB MDR
1.
Pasien TB pengobatan kategori 2 yang gagal (Kasus kronik)
2.
Pasien TB pengobatan kategori 2 yang tidak konversi
3.
Pasien TB yang pernah diobati pengobatan TB Non DOTS
4.
Pasien TB gagal pengobatan kategori 1
5.
Pasien TB pengobatan kategori 1 yang tidak konversi setelah pemberian
sisipan.
6.
Pasien TB kambuh
7.
Pasien TB yang kembali setelah lalai/default
8.
Suspek TB yang kontak erat dengan pasien TB-MDR
9.
ODHA dengan gejala TB/ koinfeksi TB.
Evaluasi pengobatan MDR/ XDR

kasus Non Tuberculosis Mycobacterium (NTM) masih rendah, spesifisitas pemeriksaan

berkisar 99%.
Uraian lebih lengkap dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Jumlah BTA dalam sediaan apus, konsentrasi basil dalam dahak, dan kemungkinan mendapatkan hasil positif.
Jumlah basil ditemukan
secara mikroskopik (ZN)
0 dlm 100 l.p
1-2/ 300 l.p
1-9/ 100 l.p
1-9/ 10 l.p
IUATLD
1-9/ l.p
10/ l.p
Perkiraan konsentrasi
basil/ ml,dlm spesimen
Kurang dari 1.000
5.000 10.000
~ 30.000
~ 50.000
~ 100.000
500.000
Kemungkinan
hasil positif
Kurang dari 10 %
50 %
80 %
90 %
96,2 %
99.95 %

Pada tahun 2011 angka keberhasilan pengobatan yang dicapai oleh program DOTS
2. Kesalahan yang biasa terjadi pada pengelolaan pengobatan TB adalah :
untuk Indonesia adalah 86.7% dengan angka kesembuhan adalah 80.4% (Data :
Manajemen kasus yang buruk (pengobatan tidak dengan pengawasan penuh
Laporan situasi terkini perkembangan Tuberkulosis di Indonesia, Januari-Desember
=DOT/ Directly Observed Treatment, terutama pada tahap intensif).
2011). Sedangkan kesimpulan National TB Program Managers Meeting European
Pasien kesulitan mendapatkan semua OAT yang diperlukan secara adekuat.
Region tahun 2000 menyatakan bahwa untuk meminimalisasi kejadian MDR (Multiple
3. Pengetahuan pasien kurang karena informasi kurang atau penjelasan yang tidak
Drug Resistant) diperlukan angka kesembuhan minimal 95%. Oleh karena itu pendataan
tentang prevalensi TB MDR dan TB XDR harus dilaksanakan secara berkesinambungan.
Multiple Drug Resistance
TB MDR (Multiple Drug Resistance) adalah suatu keadaan dimana Mycobacterium
tuberculosis telah resisten terhadap INH dan Rifampisin saja atau resisten terhadap
INH dan Rifampisin serta OAT lini pertama lainnya.
adekuat sebelum mulai pengobatan.

Pengobatan kasus TB MDR sangat sulit, selain biayanya sangat mahal, efek samping
obat lebih besar juga angka kesembuhannya lebih rendah dibandingkan dengan hasil
pengobatan kasus bukan TB MDR. Karena itu strategi terbaik untuk mengendalikan TB
MDR adalah mencegah kejadian TB MDR dengan melaksanakan pengobatan kasus
bukan TB MDR sebaik-baiknya dan melaksanakan program pengendalian TB MDR
sesuai pedoman. Agar terlaksana dengan baik, diperlukan komitmen semua pihak dan
Fenomena amplifikasi dan penyebaran kasus resistensi TB atau TB MDR seluruhnya
mobilisasi sumber daya. Perlu diingat bahwa dalam 1 tahun satu kasus TB MDR dapat
adalah akibat perbuatan manusia. Telah dibuktikan bahwa kejadian resistensi
menularkan pada 6 orang lain.
Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT adalah akibat mutasi alami. Amplifikasi

Mycobacterium tuberculosis yang resisten selanjutnya terjadi akibat kesalahan manusia,
seperti tersebut di bawah ini :
1. Kesalahan pengelolaan OAT.
2. Kesalahan manajemen kasus TB.
3. Kesalahan proses penyampaian OAT kepada pasien.
4. Kesalahan hasil uji DST
5. Pemakaian OAT dengan mutu rendah
Kesalahan medis yang biasa terjadi yang menyebabkan resistensi basil, adalah :
1. Pemberian pengobatan yang tidak adekuat, baik dosis, kombinasi OAT maupun
lama pengobatan. Misalnya
hanya 2-3 OAT pada tahap intensif untuk penderita BTA positif dengan kuman
yang resisten primer terhadap INH
hanya menambahkan satu jenis OAT pada kasus gagal
terus menambahkan OAT lain, pada saat pasien kambuh setelah pengobatan
Extremely Drug Resistant

TB XDR merupakan TB MDR disertai resistensi terhadap salah satu obat golongan
fluorokuinolon dan salah satu dari OAT injeksi lini kedua (kapreomisin, kanamisin
dan amikasin) Hasil berbagai kajian di luar negeri memperlihatkan bahwa terdapat
kecenderungan peningkatan insidensi TB MDR dan TB XDR. TB XDR juga sudah
dikonfirmasi keberadaannya di Indonesia. Jalan untuk menghambat laju kenaikan
masalah TB XDR dimulai dengan keharusan menjalankan program DOTS sebaikbaiknya dan tidak dengan mudah menjalankan pengobatan dengan OAT lini kedua. Jika
akan melakukan pengobatan dengan OAT lini kedua, hendaknya konsisten mengacu
pada pedoman yang telah terbukti validitasnya.
A. Biakan Mycobacterium tuberculosis
Untuk mendiagnosis TB MDR dan TB XDR diperlukan pemeriksaan biakan, identifikasi
yang kemudian dilanjutkan dengan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap
OAT.
dengan obat tunggal.


Dari sudut pandang kecepatan tumbuh dan jenis pigmen, dua parameter yang mudah
diamati pada pemeriksaan biakan, Mycobacterium dapat secara sederhana dibagi atas :
1.
2.
3.
Uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT berguna untuk mengarahkan
Photochromogen dengan pigmen koloni kuning .
jenis obat yang akan diberikan kepada pasien. Ini sangat penting karena pemberian OAT
Kuman golongan ini koloninya akan berwarna jika inkubasi dilakukan dengan
yang tidak tepat, tidak hanya akan menyebabkan kegagalan pengobatan, tetapi juga
pencahayaan. Termasuk dalam golongan ini adalah M. kansasii, M. marinum, M.
menyebabkan penularan terus berlangsung dan mempercepat kejadian dan penyebaran
simiae, M. asiaticum.
TB MDR dan TB XDR.
Non photochromogen ( tanpa pigmen pada koloni ).
Banyak metode untuk melakukan uji kepekaan; menggunakan media padat atau
Termasuk dalam golongan ini adalah : M. tuberculosis complex, M. terrae complex,
cair, metode radiometrik atau nir radioisotop, metode seluler atau molekuler. Semua
M. gastrii, M. malmoense, M. avium complex, M. haemophilum, M. xenopi.
metode mempunyai keunggulan dan kelemahan. Karena itu apapun caranya, hasil
Scotochromogen ( dengan pigmen koloni jingga )
akan mempunyai arti jika cara yang dipakai telah terstandarisasi. Di antara cara yang
Kuman golongan ini koloninya akan berwarna jika inkubasi dilakukan dalam
terstandarisasi adalah cara proporsi pada media LJ, cara radiometric dengan alat Bactec,
keadaan gelap. Termasuk dalam golongan ini adalah : M. szulgai, M. flavesens,
cara end point inhibition pada media semi solid, cara break point pada media cair
M.thermoresistible, M. gordonae, M. scrofulaceum, M. xenopi

4.
B. Uji kepekaan ( Drug Susceptibility Test/ DST)
Rapid grower.
Diantaranya adalah M. flavescens, M. thermoresistible, M. marinum, M. fortuitum-
seperti MGIT, NRA ( Nitrate Reduction Assay), MODS, kalorimetrik. Hasil uji kepekaan
dengan cara yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian yang besar bagi pasien,
keluarga, masyarakat, dan pemerintah.
chelonae complex. Kebanyakan kuman dari golongan ini tidak patogen bagi
Pada saat ini Kementerian Kesehatan mengambil kebijakan untuk melakukan uji
manusia
kepekaan menggunakan cara proporsi pada media LJ dan cara break point (MGIT)
dengan mempertimbangkan berbagai faktor termasuk ketersediaan sumber daya
Kuman yang tidak termasuk rapid grower mempunyai waktu pembelahan puluhan jam,
karena itu koloni yang diisolasi dari spesimen biasanya mulai tampak setelah 2 (dua)
minggu. Sementara koloni kuman yang termasuk rapid grower biasanya akan tampak
dalam waktu kurang atau sampai 1 (satu) minggu.
laboratorium.
Catatan :
Uji diagnosis lain yang tersedia di pasaran sudah banyak. Diperlukan kehati-hatian yang
sangat tinggi agar uji tersebut tidak disalahgunakan untuk diagnosis. Banyak uji yang
belum terstandarisasi atau sangat selektif penggunaannya. Di antaranya adalah :
1. Uji serologi untuk mendeteksi/mengukur kadar antibodi terhadap komponen
mycobacteria. Pada tahun 2011, WHO mengeluarkan pernyataan bahwa uji serologis
yang tersedia tidak direkomendasikan untuk diagnosis paru dan ekstra paru
2. Uji serologi untuk mendeteksi antigen.
Sampai saat ini belum ada kit yang direkomedasikan oleh W.HO untuk diagnosis TB
paru dan ekstra paru.
12


3. Uji deteksi/pengukuran interferon gamma.

Uji ini dapat dilakukan dengan jalan mengukur kadar interferon gamma pada serum atau
III. KARAKTERISTIK MYCOBACTERIA
plasma dan mengukur kadar interferon gamma yang dihasilkan oleh sel limfosit T yang
Mycobacteria merupakan mikroba tahan asam, serupa dengan Rhodococcus dan
diisolasi dari pasien dan direaksikan dengan komponen M. tuberculosis. Sensitifitas
Nocardia. Tingkat ketahanan Mycobacteria terhadap asam bervariasi. Mycobacteria ada
dan spesifisitas uji ini dalam menegakkan diagnosis TB paru dewasa juga masih lebih
yang bersifat patogen dan ada juga yang tidak patogen. Mycobacteria tidak patogen
rendah dibandingkan dengan pemeriksaan BTA mikroskopis SPS. Sampai saat ini uji
ditemukan di lingkungan manusia, khususnya dalam air. Mycobacteria lingkungan ini
deteksi interferon gama tak dapat membedakan antara sakit dan infeksi TB laten.
merupakan kontaminasi yang harus diantisipasi agar tak mengacaukan hasil pemeriksaan
4. Amplifikasi asam nukleat M. tuberculosis dari spesimen.

Sudah banyak cara yang dikembangkan. Misalnya dengan cara reaksi rantai
biakan dan uji kepekaan.

Termasuk dalam Mycobacteria yang secara medis penting adalah :
polimerasa konvensional (konventional PCR), realtime PCR, NASBA, SDA PCR, PCR
isothermal dan sebagainya. Untuk TB paru uji amplifikasi asam nukleat yang bukan
1.
M. tuberculosis
real time telah dibuktikan tidak lebih sensitif dibandingkan dengan pewarnaan BTA
2.
M. bovis
tiga kali. Kelebihan cara amplifikasi asam nukleat adalah kemampuannya mendeteksi
3.
M. africanum
4.
M. microtii
kasus TB MDR. Pada tahun 2011, WHO merekomedasikan penggunaan teknologi
5.
M. ulcerans
PCR real time yaitu GenXpert yang lebih sensitif dibandingkan dengan pemeriksaan
6.
M. leprae
mikroskopik. Namun baru digunakan untuk kasus TB pada HIV dan dugaan TB
7.
M. kansasii
MDR. Apabila dibandingkan dengan GeneXpert, LPA lebih sukar pelaksanaannya,
8.
M. marinum
9.
M. simiae
10.
M. scrofulaceum
11.
M. szulgai
ketahanannya tertinggi pada mycobacteria. Dengan demikian pewarnaan BTA dengan
12.
M. xenopi
cara Ziehl-Neelsen ataupun auramin juga akan mendeteksi spesies mycobacteria
13.
M. gordonae
lain. Namun karena prevalensi infeksi oleh mycobacteria yang bukan Mycobacterium
14.
M. flavescens
tuberculosis (MOTT/ NTM) saat ini sangat rendah, maka hasil positif lebih mengarah
15.
M. fortuitum-chelonae complex
16.
M. thermoresistible
17.
M. avium-intracellulare complex
18.
M. terra-triviale complex
beberapa species Mycobacteria lain dengan cepat.

Pada tahun 2012, WHO merekomendasikan LPA (Line Probe Assay) untuk penapisan
tetapi memiliki kelebihan dibanding GeneXpert yaitu mampu mendeteksi kekebalan

terhadap obat lini kedua.
5. Pewarnaan BTA.
Mycobacteria, Nocardia dan Rodococcus merupakan kuman tahan asam. Derajat
pada Mycobacterium tuberculosis. Yang perlu diwaspadai adalah BTA lingkungan

yang banyak mencemari air.
Nomor 1 sampai 4 digolongkan sebagai M. tuberculosis complex.
10


11
dalam 30-45 menit. Resiko infeksi akan sangat dikurangi jika pengerjaan spesimen dan
Tabel 2. Mycobacteria yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia
isolat dilakukan dalam Bio Safety Cabinet (BSC) dikerjakan sesuai dengan baku praktek
laboratorium minimal untuk baku praktek laboratorium dengan tingkat keamanan 3
Mycobacteria
Habitat
(tiga). Jika menggunakan exhaust fan, gunakan yang mempunyai kapasitas minimal
23.6 liter per detik.
Gambar 1: contoh denah laboratorium paling sederhana untuk biakan dan uji
kepekaan Mycobacterium tuberculosis ( WHO 1998 )
Keterangan:
1. Biosafety Cabinet
2. Sentrifuse
3. Deep freezer -70 0C
4. Wastafel
5. Bak pewarnaan
6. Timbangan analitik (nefelometer)
7. Mikroskop
8. Meja
9. Inkubator
10. Meja
11. Meja cuci
12. Lemari Es (refrigerator)
13. Analitikal Balans
14. Penangas air
15. Lemari Bakar
16. Autoclave
17. Heat sterilisator
18. Lemari Administrasi
19. Meja Administrasi
16
A :Ruang administrasi, penerimaan

contoh uji
B : Ruang kerja lab
C : Ruang Cuci dan sterilisasi
D : Ruang pembuatan media
Mycobacterium tuberculosis complex

M. tuberculosis
M. bovis
M. canetti
Photochromogen
M. kansasii
M. marinum
M. simiae
M. asiaticum
Scotochromogen
M. scrofulaceum
M. szulgai
M. gordonae
M. flavescens
M. xenopi
Non photochromogen
M. avium-intracellulare
M. ulcerans
M. gastri
M. terrae
E : Exhause
L : Loket penerima bahan
AC : Air Conditioner

Rapid grower
M. fortuitum
M. abcessus
M. chelonae
M. smegmatis
M. leprae
Organ yang umum

diserang
Manusia
Manusia,ternak
Hewan
Semua organ
Usus dan jaringan lunak
Kelenjar limfe
Air,ternak
Ikan,air
Tulang
Kulit dan jaringan lunak
Bronkopulmonal
Paru
Primata
Primata
Tanah,air,ternak,burung
Tak jelas
Air
Air,tanah
Air
Kelenjar limfe
Bronkopulmonal
Paru
Paru
Bronkopulmonal
Tanah,air,ternak,burung
Paru,kel limfe,sistemik
Tidak jelas
Kulit dan jaringan lunak

Paru
Paru
Tanah,air
Tanah,air
Tanah,air,hewan darat dan laut
Permukaaan lembab, flora
urogenital
Manusia
Kulit, jaringan lunak, sistemik

Paru
Kulit, jaringan lunak,sistemik

13
Dalam pedoman ini akan dijelaskan bagaimana melakukan biakan dan uji kepekaaan
untuk Mycobacterium tuberculosis complex. Walaupun demikian masih terdapat
pertanyaan-pertanyaan yang tidak dijelaskan dalam pedoman ini yaitu :
1) Bagaimana membedakan Mycobacterium tuberculosis dengan anggota
Mycobacterium tuberculosis complex lainnya?
IV. SUMBER DAYA LABORATORIUM

Laboratorium TB yang melakukan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan harus memiliki
sumber daya laboratorium yang memungkinkan proses kegiatan praktik laboratorium
dapat berjalan lancar, berkualitas dan aman bagi pekerja serta lingkungan. Sumber
Daya Manusia disusun berdasarkan kompetensi teknis/latar belakang pendidikan dan
2) Apakah galur isolat Mycobacterium tuberculosis satu sama lainnya sama?
beban kerja
3) NTM mana yang perlu-tidak perlu dilaporkan?
Penanggung Jawab
: 1 orang Dokter Spesialis Mikrobiologi Klinik/ Patologi Klinik
Tenaga Teknis :
a. Mikroskopis
b. Media
c. Biakan
d. Petugas pencatatan dan :

pelaporan
e. Pekarya
:
DIII Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TB

Beban kerja : 20 Sediaan/hari/teknisi
D III Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TB
Jumlah tenaga disesuaikan dengan beban kerja
biakan dan uji kepekaan.
D III Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TB
Beban kerja : 20 biakan/ hari/teknisi
1 orang, minimal SLTA
Minimal SLTP, 1 (satu) orang
Tugas : pencucian alat dan sterilisasi
A. Ruang laboratorium
Ruang laboratorium harus menjamin keamanan petugas dan orang lain di sekitarnya
dari spesimen dan isolat yang ditangani. Infeksi
oleh Mycobacterium tuberculosis
bersifat airborne melalui mikrodroplet, maka pengaturan aliran udara menjadi
sangat
penting. Udara harus mengalir dari area bersih ke area kotor/ tercemar. Udara yang
dikeluarkan dari laboratorium ke lingkungan sebaiknya telah melalui filter bakteri dengan
arah menjauhi tempat berkumpul orang banyak, pemukiman dan lalu lalang.
Sirkulasi udara di laboratorium harus dilakukan melalui pertukaran udara minimal 6
(enam) sampai 12 (dua belas) kali per jam, dengan cara ini 99 % partikel akan dibuang
14


15
Gambaran aliran udara pada laboratorium di atas adalah sebagai berikut
Gambar 2. Contoh lay out laboratorium pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis

dengan fasilitas biomolekuler
Keterangan Denah :
-
Ruang A :
Pintu masuk ke laboratorium melalui ruang yang dapat dimanfaatkan untuk
administrasi, penyimpanan laporan, buku register, alat tulis dll. Di ruang ini terdapat
juga loket penerimaan dan penilaian spesimen secara makroskopik. Misalnya
tentang data spesimen, volume, tanggal dan cara pengambilan, kondisi wadah dan
sebagainya. Ruangan ini berfungsi sebagai ruang persiapan pekerja laboratorium,
menggunakan Alat Pelindung Diri (APD).
Ruang B :
Ruang ini adalah tempat melakukan pemeriksaan, terdapat fasilitas pengolahan
dan inokulasi contoh uji/spesimen. Sebaiknya tempat cuci tangan di ruang ini
menggunakan kran yang dapat dibuka dengan siku atau kaki atau sensor outlet.
Pada bagian terkotor ditempatkan BSC dan sentrifus.
Pada bagian lain di ruang ini disediakan meja kerja untuk pemeriksaan mikroskopis,
pengamatan dan pencatatan hasil biakan.
Ruang C :
Di ruang ini dilakukan sterilisasi, pencucian alat dan pembuangan limbah sementara.
APD dilepaskan dan disterilisasi di ruang ini.
20


17
Ruang D
Untuk mengetahui hubungan antar ruang dengan menggunakan tabel III,adalah dengan
Ruang ini tempat menyiapkan dan membuat media,
menyimpan peralatan yang
sudah steril dan reagensia.
mencari titik temu antara kategori ruang

Misalnya :
Dengan bagan tata ruang seperti diatas diharapkan kegiatan di laboratorium biakan
Ruang penerimaan spesimen (1) dan ruang miroskopis (2)
dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dilaksanakan dengan mudah dan
langsung (HL)
menjamin keamanan kerja. Jika petugas laboratorium kidal, pengaturan dapat ditata
seperti bayangan kaca.
Catatan: Sejalan dengan kebutuhan akan kemanan kerja (biosafety), modifikasi
Tabel 3.
berhubungan secara
Ruang sterilisasi (4) dengan ruang tempat inkubator berhubungan dekat (DK)
Ruang penerimaan spesimen(1) dan ruang biakan (3) harus terpisah (TP).
rancangan ruang laboratorium sebaiknya dilakukan dengan memperhatikan
Gambar dibawah merupakan contoh lay out laboratorium pemeriksaan Mycobacterium
kaidah-kaidah keamanan kerja. Prinsip dasarnya dapat dilihat pada tabel 3.
tuberculosis dengan fasilitas pemeriksaan biomolekuler dan menggunakan tata aliran
Kisi-kisi hubungan antar ruang di laboratorium dan laboratorium
udara yang diatur secara mekanik.
Mycobacterium tuberculosis
Kategori ruang
(1)
Penerimaan spesimen (1)
(2)
(3)
HL
TP
Ruang mikroskopi (2)
HL
Ruang biakan (3)
TP HL
Ruang sterilisasi (4)

Ruang media (5)
HL
DK
TP
HL
Ruang inkubator (8)*
DK
Penyimpanan gas (10)
DK
HL
DK
(6)
(7)
HL
(8)
(9)
HL
HL
DK
DK
HL
HL
(10)
HL
DK
HL
DK
DK
DK
HL
DK
DK
DK
HL
DK
Gudang (9)
(5)
TP
HL
HL
Ruang mikroskop fluoresen (6)

Ruang pendingin (7)
(4)
HL
HL
DK
DK
HL
DK
DK
DK
DK
Keterangan : DK : dekat
HL : hubungan langsung
TP : terpisah
*) walk in incubator
18


19
Tabel 4. Peralatan laboratorium biakan dan uji kepekaan dengan media padat
untuk beban kerja 6000 uji/tahun
No
Alat
9
10
mixed load pressure cooker type atau 1

gravity displacement type dengan
pembuangan uap otomatik
Timbangan
Top loading. Untuk membuat media
1
Biological safety cabi- Kelas II dan sesuai standar
2
net
Smart flame/incenera3
tor electric
Sentrifus
Biocontained type ( rotor miring, bertutup 1
rapat ) dengan daya endap minimal 3000
g. Lebih diutamakan yang refrigerated
Homogenizer/mixer
Untuk homogenisasi telur, dapat diotoklaf/ 1
dsiterilkan
Inspisator/hot
oven Pengatur suhu pada 80-85oC Kapasitas 1
double blower
tergantung beban kerja,
Mikroskop
Binokuler, pembesaran total 1000 kali. 1
Dianjurkan menggunakan lensa anti jamur
dan kondensor bukan plastik. Sediaan
lampu cadangan
Refrigerator
Suhu 2-8oC
1
Vortex
3
11
Inkubator
2
3
4
5
6
7
8
Spesifikasi/penggunaan
Gambar berikut adalah contoh lay out laboratorium biakan dan uji kepekaan tanpa
fasilitas biomolekuler dengan pengaturan aliran udara secara mekanik
Jumlah
Otoklaf
Rak dari alumunium atau stainless steel. 1 ( walk in

Jika beban kerja tinggi maka digunakan incubator )
walk in incubator dengan kipas pengatur
udara
Dilengkapi dengan termometer dan 2
termostat
1
Ruang laboratorium TB harus memenuhi syarat sbb.:

Lantai :
Tidak mempunyai sambungan, dengan demikian tidak memakai bahan keramik.
Sebaiknya memakai bahan epoksi yang tahan asam dan basa kuat. Pertemuan
lantai dan dinding tidak bersudut.
Dinding :
Terbuat dari bahan yang mudah dibersihkan, permukaan rata, cat dinding berwarna
terang, tidak mengkilat. Pertemuan antar dinding tidak bersudut agar mudah dibersihkan.
12
Penangas air
13
Freezer -20oC
14
Freezer -70 C
minimal 23.6 liter per detik.Udara yang dikeluarkan dari laboratorium ke lingkungan
15
16
Laminary airflow
Untuk membuat media
1
Destilator/water purifier Destilator tidak menggunakan metal type 1
. Sumber air memenuhi persyaratan.
sebaiknya telah melalui filter bakteri dengan arah menjauhi tempat berkumpul orang
24

Exhauster :
Ditempatkan di area kotor, berlawanan dengan air condition dan mempunyai kapasitas
banyak, pemukiman dan lalu lalang.

Air Condition :
21
Daya disesuaikan dengan luasan ruang. Penempatan AC harus memperhatikan posisi
Shower dan eye wash
teknisi saat bekerja dan tidak mengganggu tirai udara BSC.
Alat ini harus ditempatkan di ruang kerja laboratorium TB, digunakan untuk melakukan
Pintu :
netralisasi bila terjadi kecelakaan kerja berupa percikan larutan asam atau basa kuat
Dilengkapi dengan alat yang dapat otomatis menutup pintu, dibuat dari bahan yang
dan bahan infeksius. Karena biasanya dalam laboratorium tidak digunakan asam atau
mudah dibersihkan dan memudahkan evakuasi dalam keadaan darurat.
basa kuat dalam jumlah banyak, shower tidak merupakan keharusan
Bila ruang laboratorium TB terletak dilantai atas, maka tangga harus aman untuk dilalui
Meja kerja
orang ( pegangan pada kedua sisi, tidak licin, ruang tangga terang dan dapat dilalui paling
Dibuat permanen dari beton, tinggi 75 cm dari lantai, permukaan rata, tidak mempunyai
sedikit oleh 2 orang secara berdampingan). Sebaiknya ruang laboratorium memiliki pintu
sambungan, sebaiknya dilapisi epoksi.
darurat atau ada bagian dinding yang dapat dipakai sebagai jalan keluar dalam keadaan
darurat.
Kursi
Pasokan listrik
yang mudah dibersihkan dan tidak menyerap cairan (plastik/kulit), bersifat ergonomik
Rangka terbuat dari bahan logam yang tidak mudah berkarat dan dudukan dari bahan
Harus tersedia 24 jam, karena itu harus dilengkapi dengan generator listrik yang dapat
berfungsi secara otomatis dengan daya yang mencukupi untuk alat-alat yang harus
Lemari penyimpan bahan media dan reagensia :
selalu operasional (deep freezer, incubator, refrigerator)
Dibuat dari logam yang tidak mudah berkarat dan kaca.
Pasokan Air
Catatan :
Harus tersedia dengan kualitas baik dan kuantitas yang cukup.
Bangunan dan peralatan laboratorium harus dirancang berdasarkan hazard risk
Bak cuci tangan
assesment . Risiko lebih besar saat melakukan uji kepekaan dibandingkan melakukan
Diletakkan di dekat pintu, dilengkapi dengan kran yang dibuka/tutup dengan siku atau
biakan, risiko akan bertambah besar bila melakukan biakan dan uji kepekaan TB MDR,
kaki atau sensored outlet
pemeliharaan sarana tidak sesuai, dan beban kerja tinggi. Karena itu WHO menganjurkan
Bak cuci alat
biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dilakukan dalam laboratorium
Bak ini harus cukup besar dan dalam untuk menampung alat-alat yang sedang dicuci
dengan standard keamanan BSL 3 dan dilakukan dengan baku praktek laboratorium
(panjang 1m, lebar 75cm, dalam 50 cm) ,dibuat dari bahan yang kuat agar tidak mudah
tingkat 3. Karena mahalnya biaya pembuatan dan pemeliharaan laboratorium BSL 3.
bocor (porselin, stainles), permukaan rata dan mudah dibersihkan.
Di Indonesia laboratorium yang mengisolasi TB khususnya TB MDR sebaiknya bukan

laboratorium sederhana tetapi sesuai kategori BSL 2 plus dan dikerjakan dengan baku
Bak pewarnaan
praktek laboratorium BSL 3.
Bak ini khusus dipakai untuk proses pewarnaan sediaan BTA. Kedalaman bak sedemikian
rupa sehingga mencegah percikan air keluar ( 30-50 cm)
B. Peralatan dan penjaminan kinerja alat, termasuk kalibrasi
Dibuat dari bahan yang tidak mudah bocor, kuat dan mudah dibersihkan dengan
Peralatan yang penting untuk laboratorium biakan yang menggunakan media padat
permukaaan yang rata tanpa sambungan dan tidak bersudut.
dengan beban kerja 6000 uji per tahun tertera dalam tabel 4.
22


23
Peruntukan
Nama
Gliserol
Volume/batch
30 ml
Telur yang sudah homogen dan 1000 ml

disaring
Final pH
6.2
Uji kepekaan
a. Rifampicin
b. Isoniazid
40 mg/L
0,2 mg/L
c. Ethambutol
2 mg/L
d. Streptomycin sulphate
4 mg/L
e. Dimetil formamide
(sesuai konsentrasi
rifampicin)
f. Aquades
Identifikasi
Larutan PNB
a. PNB
b. Dimetil formamide
0,1 g
3 ml
Uji Niacin dengan

paper strip
a. Aquades
2 ml
b. 1 Paper strip/tabung
Pengawet dahak
Dekontaminasi
Homogenisasi
10 mg CPC + 20 gr NaCl dalam ana, bila pekat 2 x volume

1000ml aquades
dahak
NaOH 4%(1N)
Ana atau 2x volume dahak
Aquadest atau
Tween 80,0,1%
(1 ml Tween 80 + 99 ml aquades)
Penyimpanan koloni Skim milk bubuk dalam PBS

pada -700C
28
2 tetes/isolat
100 mg dalam 1 L

No
Alat
Jumlah
17
18
19
Dessicator
Dry sterilizer
Timbangan
analitik
(nefelometer)
Magnetic stirrer
Blender stainless steel
Untuk menyimpan bahan higroskopis

Suhu mencapai 200oC. Tidak mutlak ada
Kepekaan mencapai minimal 0,1 mg (4
desimal)
Untuk mempermudah pelarutan
Untuk homogenisasi telur, volume 1,8 L
2
1
1
20
21
2
1
Tabel 5. Alat pendukung (beban kerja 6000 uji/tahun)

No
Alat
1
2
3
Kertas aluminium
Yang kuat ( heavy duty )
Label/spidol
Untuk identitas pot dahak
Kertas indikator otoklaf
8 gulung
7000/ sc
12 gulung
4
5
Botol bertutup ulir

50, 100 ml
Mangkok gerusan dan 30 x 50 cm
mortir
Wadah pipet (stainless Tempat sterilisasi pipet
steel)
@ 10
4
7
8
9
11
Tabung sentrifus
Kapas
Rak botol biakan
Rak tabung
@ 7000
2 kg
10
5
12
13
14
Wadah limbah
Nampan limbah
Corong
15
16
18
19
20
Kertas saring
Desinfektan
Labu erlenmeyer
Sarung tangan
Kaca pembesar
Tutup ulir bukan logam, 15 ml dan 50 ml

Absorben
Kapasitas 50 botol
Kapasitas 48 tabung, polipropilen atau
metal
Tahan tusuk, tidak mudah bocor, bertutup
polipropilen
Gelas, 45-60 mm dan 90-125 mm garis
tengahnya
Diameter 15 mm, Whatman no 4, no1.
Lisol 5% atau hipoklorit 5%
250 dan 500 ml
Sekali pakai

Jumlah
2
3
@2
@ 4 kotak
40 l
@2
400
1
25
No
Alat
Jumlah
No
Alat
Jumlah
21
22
Ose disposable
Buku register
bahan plastik
7000
2-4
51
Glass beads
Diameter 1,5 3 mm
23
7000
52
53
Kain kasa
Mikropipet
Penyaring telur
24
Formulir
permintaan
pemeriksaan
Formulir laporan
Secukup
nya
1 roll
25
Kertas lensa
Untuk membersihkan lensa mikroskop
26
27
28
29
Masker
Botol Mc Cartney
Gelas ukur
Gelas objek
N95
14 atau 28 ml,bertutup minimal 3 ulir
25,100,250 dan 1000 ml
30
Baju lab
7000
Secukup
nya
400
9000
@2
7000
Tabel 6. Bahan habis pakai untuk Biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis
Peruntukan
Nama
Media Lowenstein a. Potasium dihidrogen fosfat
Jensen
b. Magnesium sulfat heptahidrat
Volume/batch
2,4 gram
0,24 gram
2 per orang
per tahun
2 gulung
c. triMgdisitrat 14-hidrat
0,6 gram
d. L asparagin
3,6 gram
e. Potato meal
30 gram
f. Malachite green 2%
20 ml
g. Aquades
600 ml
h. Gliserol
12 ml
31
Kertas tissue
32
34
37
36
37
Pipet Pasteur
Volume Pipet
Rak untuk inspisasi
Botol reagensia
Pippet bulb
Disposable, 1 dan 2,5 cc

1ml , 5 ml, 10 ml
Stainless steel kemiringan 30o
Kapasitas 50-1000 ml
@7000
@5
10
@ 25
@5
38
39
40
Gunting
Rak gelas objek
Kotak sediaan
Stainless steel, 25 cm
Plastik, kapasita 25 slide
4
4
20
41
42
Spatula
Pot dahak
Natrium glutamate
0.5g
Glycerol
4ml
Distilled water
100ml
Homogenised whole eggs
200ml
2% Malachite green solution
4ml
Final pH
6.4
43
44
Botol reagen
Rak pewarnaan
Stainless steel
4
Bening, diameter minimal 4 cm, bertutup 6000
ulir, volume 50 ml
Gelas berwarna gelap
3
2
45
46
47
48
49
50
Keranjang
Batang pengaduk
Tabung reaksi
Tutup tabung
Termometer
Stopwatch
Stainless steel, diameter sesuai otoklaf

Gelas, panjang 20-30 cm
Gelas, 16 x 152 mm
Alumunium, Cap O
o
C (uji suhu inkubator, refrigerator)
0-60 menit
26

2
5
200
600
2 tiap alat
2
i. Telur yang sudah homogen dan 1000 ml

disaring
Modified Ogawa 3% Kalium dihydrogen phosphate
2g
(untuk kultur)
Magnesium citrate (KH2PO4)
0.1g
Acidified Ogawa 3% Mono Kalium dihidrogen fosfat

(untuk kultur)
(KH2PO4)
Natrium glutamat
15 gram
5 gram
Malachite green 2%
30 ml
Aquades
500 ml

27
8. Petugas harus mencuci tangan dengan sabun dan air mengalir dan selanjutnya
V. KEAMANAN KERJA UNTUK BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN
dengan alkohol 70% atau antiseptik untuk kulit lainnya, setiap masuk ke laboratorium,
selesai menangani bahan tercemar, dan setelah
bekerja. Untuk mengeringkan
tangan dilarang memakai handuk, pakailah pengering sekali pakai.

9. Petugas harus menanggalkan baju laboratorium saat akan meninggalkan ruang
laboratorium.
10. Pekerjaan yang beresiko menimbulkan aerosol seperti membuka wadah, mengocok,
menggerus, waktu membuat sediaan apus, dan memipet bahan tercemar harus
dilakukan dalam BSC dengan blower dinyalakan
11. Pemusingan dilakukan dengan alat biocontained centrifuge yang tidak memungkinkan
aerosol keluar dari alat. Lakukan sentrifugasi dalam fixed angle rotor (sudut rotor
tidak berubah pada saat dilakukan pemusingan). Dilarang menggunakan rem mesin
sentrifus, biarkan berhenti sendiri.
12. Penggunaan semprit dan jarum harus dibatasi. Hanya semprit dengan jarum yang
dapat dikunci/ berulir yang boleh dipakai. Jarum dilarang dibengkokan, dilepas
A. Desain Laboratorium
Kegiatan Laboratorium untuk biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis
harus mengikuti standar keamanan yang ada. Menurut pedoman WHO, terdapat
beberapa ketentuan pada kemanan tingkat 3, yakni:
1. Sebelum masuk ruang laboratorium, sebaiknya terdapat dua ruang pemisah,
yaitu vestibulum (ruang bersih, tempat alat pelindung diri bersih dikenakan) dan
anteroom (ruang bersih, tempat alat pelindung diri dilepaskan).
2. Pintu ruang antara dapat menutup otomatik dan interrlocking, sehingga hanya
satu pintu yang terbuka pada suatu saat.
3. Permukaan dinding, lantai dan atap harus kedap air dan mudah dibersihkan.
4. Ruang laboratorium harus tahan desinfektan. Pipa udara harus tahan terhadap
dekontaminasi dengan gas.
dari sempritnya ataupun ditutup ulang. Semprit dan jarum yang telah dipakai harus
5. Jendela selalu ditutup, terbuat dari kaca dan kedap udara.
diletakkan pada wadah tahan tusukan dan disterilisasi dengan otoklaf atau insinerator.
6. Didekat pintu keluar ruang laboratorium
Sebelum disterilkan, jarum dapat direndam dalam desinfektan selama 24 jam.
disediakan tempat cuci tangan yang
dilengkapi dengan pengaturan otomatis tanpa menggunakan tangan.
13. Sebelum memakai alat, selalu perhatikan dan ikuti petunjuk pemakaian alat tersebut.
Sistem ventilasi dibuat sedemikian rupa sehingga tidak mengalir ke dalam ruang
14. Jangan membuka langsung wadah yang baru saja dikocok atau disentrifugasi,
lain dalam gedung. Sebaiknya digunakan filter high efficiency particulate air
biarkan dahulu selama minimal 10 menit.

C. Pedoman Khusus
(HEPA), sehingga udara setelah bersih dapat dialirkan kembali di dalam ruang
laboratorium. Bila udara dari laboratorium (selain dari BSC) akan dialirkan kearah
luar
Kesalahan petugas, teknik kerja yang tidak benar dan penggunaan alat yang salah
akan menyebabkan kecelakaan kerja infeksi akibat kerja. Teknik-teknik kerja yang perlu
diperhatikan untuk menghindari atau mengurangi masalah yang timbul akibat kerja pada
pelaksanaan kultur dan DST-TB :
1. Alat pelindung diri / Personal Protective equipment (PPE)
Baju laboratorium harus dipakai setiap saat bekerja di laboratorium. Baju
laboratorium harus menutup seluruh permukaan depan mulai leher sampai
32

gedung harus tidak mengenai bagian lain dalam gedung dan terpisah
dari udara masuk. Ventilasi dan air-conditioning (AC) dapat dipasang dengan
menjaga agar tekanan udara negatif tetap ada di laboratorium. Sistim pengaliran
udara dalam laboratorium tidak boleh mengganggu tirai aliran udara BSC
7. Semua filter HEPA harus dipasang dengan memungkinkan bagi dekontaminasi
menggunakan gas dan mudah di cek.
8. Biological Safety Cabinet (BSC) sebaiknya tidak ditempatkan di tempat untuk lalu
lalang petugas laboratorium dan tidak menghadap ke pintu dan sistem ventilasi.

29
B. Pedoman Umum Keamanan Laboratorium

Laboratorium harus memiliki peraturan dan pedoman keselamatan kerja yang
komprehensif. Keselamatan kerja di laboratorium merupakan tanggung jawab
semua anggota baik supervisor maupun pekerja laboratorium. Perlu dibentuk komite
keselamatan kerja yang bertanggungjawab mengembangkan kebijakan institusional
tentang keselamatan kerja, melakukan penilaian terhadap resiko kerja dan memastikan
pedoman praktek kerja di laboratorium dilaksanakan oleh setiap pekerja laboratoium.
Prosedur kerja merupakan unsur terpenting dalam keamanan di laboratorium. Tim

keamanan kerja harus dibentuk untuk mengelola keamanan kerja di laboratorium.
Ketentuan di bawah ini harus diketahui dan dilaksanakan oleh setiap petugas:
1. Akses laboratorium : tanda pada gambar 1 diatas harus dipasang pada pintu masuk.
Laboratoriun TB hanya boleh dimasuki oleh petugas yang telah terlatih dalam hal
prosedur penanganan mikroorganisme patogen. Orang dan petugas yang tak terkait,
tidak diperkenankan masuk ke dalam ruang laboratorium. Petugas kebersihan dan
teknisi alat atau orang lain dengan alasan kuat hanya diperkenankan masuk setelah
Laboratorium biakan dan uji kepekaan harus ditandai sebagai lokasi yang infeksius
mendapat penjelasan, mematuhi penjelasan dari petugas laboratorium dan izin dari
dan harus terpasang lambing biohazard untuk membatasi akses ke laboratorium.
penanggung jawab laboratorium.
Tanda baku biohazard international yang ditempel pada Laboratorium yang menangani
mikroorganisme beresiko klas 2 atau diatasnya, menyebutkan tingkat keamanan,
penanggung jawab, alamat yang harus dihubungi bila terjadi kedaruratan.
2. Dilarang memakai perhiasan pada tangan selama bekerja. Gunakan sarung tangan
jika menangani dahak dan bahan tercemar.
3. Pekerjaan harus mengikuti prosedur tetap (Protap/ SOP) yang ada dan dikerjakan
hati-hati.
4. Semua permukaan tempat kerja harus didesinfeksi tiap selesai bekerja dan segera
setelah terjadi tumpahan kecil . Desinfeksi permukaan kerja segera setelah pekerjaan
selesai dengan handuk/kertas yang telah dibasahi oleh larutan 5 % senyawa fenol
(lysol, kresol, karbol) atau 70% etanol atau larutan natrium hipoklorit 1 : 100 - 200
(natrium hipoklorit terdapat pada larutan pemutih pakaian. Untuk membuat larutan 1
: 100 - 200 yang benar, perhatikan konsentrasi natrium hipoklorit pada label pemutih
tersebut).
Lantai laboratorium secara berkala (tiap hari segera setelah selesai
bekerja) harus dipel dengan desinfektan.

5. Semua limbah infeksius dan bahan lain yang tercemar harus di otoklaf atau
insenerasi/ karbonisasi sebelum dibuang. Jika proses ini oleh suatu sebab menjadi
tertunda maka bahan-bahan limbah tersebut harus dikemas dalam container yang
kedap bocor. Semua limbah infeksius dibuang sesuai dengan Protap. Barang dan
bahan (berpotensi) tercemar yang tidak dipakai lagi harus segera disterilisasi dengan
Gambar 3. Tanda baku biohazard international
otoklaf, pemanasan kering atau insenerator/ carbonizer. Pencucian barang boleh

dilakukan setelah dilakukan sterilisasi.
Seperti telah disebutkan diatas, penularan TB terjadi melalui inhalasi partikel infektif.
Bahaya terjadinya partikel infektif terutama terjadi saat pengumpulan dahak, pencampuran
larutan lain dan dahak/biakan, homogenisasi, penggunaan sengkelit, pemipetan serta
sentrifugasi.
30
6. Dilarang memakai kosmetik di dalam laboratorium. Demikian juga dengan menyimpan

makanan dan minuman dalam lemari es di laboratorium.
7. Ruang laboratorium harus selalu bersih, rapi dan bebas dari bahaya fisik (misalnya :
sengatan listrik, tergelincir, dsb).


31
melewati lutut, tanpa kerah dan tidak menggunakan tali yang panjang sebagai
5. Penggunaan BSC kelas II

Dianjurkan menggunakan BSC yang dasarnya tak berpori dan alasnya terbuat
dari stainless steel
Digunakan untuk melakukan tindakan pada bahan (tersangka) tercemar, seperti
saat membuka wadah bahan, membuat sediaan mikroskopis, melakukan
sentrifugasi (jika alatnya tidak bio-contained), melakukan pengocokan/
pengguncangan, melakukan inokulasi bahan pada media, dsb.
Prosedur tetap pemakaian BSC harus tertulis dan tersedia di laboratorium serta
mudah dibaca oleh tiap pekerja. Harap selalu diperhatikan bahwa BSC tidak
dirancang untuk melindungi pekerja dari tumpahan yang luas, pecahan atau
tehnik laboratorium yang buruk.
BSC yang rusak jangan dipakai.
Skema aliran udara pada BSC klas 2 menjamin agar udara dari ruangan (kotor)
masuk ke arah bawah di dalam kabinet, sebagian akan dimasukkan kembali
kedalam ruang kabinet setelah difiltrasi, sebagian yang lain dilepas keatas setelah
melalui filter. Kabinet ini melindungi petugas dan spesimen dari kontaminasi.
pengikat. Panjang lengan harus mencapai pergelangan tangan dan pada bagian
pergelangan tangannya, digunakan karet. Baju laboratorium harus ditanggalkan
saat keluar laboratorium dan dimasukkan dalam kantong tertutup atau direndam
dalam desinfektan sebelum disterilkan dan selanjutnya dicuci.
Sarung tangan harus dipakai saat bekerja di laboratorium. Setelah selesai
setiap tindakan, sarung tangan dilepas secara aseptik. Ganti sarung tangan jika
terkontaminasi, sobek atau jika diperlukan. Gunakan 2 pasang sarung tangan
jika perlu misalnya dalam penanganan tumpahan. Sarung tangan yg sudah
dipakai tidak boleh dicuci dan digunakan lagi. Buang sarung tangan bersama
limbah laboratorium lain. Selanjutnya cuci tangan sesuai protokol yang tepat.
Dianjurkan pula memakai
masker. Masker harus mempunyai kemampuan
menyaring 95% partikel dengan ukuran 1-5 mikrometer. Ukuran masker

disesuaikan dengan hasil fit test. Masker yang tidak fit tidak ada gunanya.
Tidak boleh mengenakan alas kaki terbuka di laboratorium
Kacamata pelindung, pelindung muka atau alat pengaman lain hanya dipakai jika
perlu untuk melindungi mata dan wajah dari percikan pada saat terjadi tumpahan.
Semua alat pelindung diri tidak boleh dipakai di luar laboratorium .
2.
Penanganan dan Pengiriman Spesimen
Pengumpulan spesimen, pengiriman dan penanganan spesimen yang tidak benar

merupakan risiko penularan infeksi.
Wadah Spesimen
Sebaiknya dari plastik dengan tutup ulir rapat dan tahan pecah atau bocor,
ukuran sesuai anjuran agar contoh uji tidak tumpah.
Diberi label dengan benar sebelum digunakan
Pengiriman spesimen ke laboratorium lain
Wadah spesimen yang tertutup rapat ditempatkan di wadah kedua untuk mengantisipasi
Gambar 5. Skema aliran udara pada BSC klas 2
36

pecah atau bocor. Sebagai wadah kedua dapat digunakan kotak kardus, atau plastik

33
tahan pecah dan bocor yang besarnya tepat dengan wadah pertama sehingga dapat
tetap tegak dan tidak bergoyang, dilengkapi dengan kertas yang dapat menyerap
tumpahan yang berasal dari wadah spesimen. Ditutup rapat dan diseal. Wadah kedua
harus dapat di-dekontaminasi. Selanjutnya wadah kedua dimasukan dalam wadah ketiga
yang terbuat dari karton dengan tanda seperti dalam gambar. Antara wadah kedua dan
wadah ketiga harus mempunyai jarak. Bila pengiriman menempuh waktu yang lama dan
dikhawatirkan terjadi kekurangan daya hidup kuman maka tambahkan dry ice dalam
wadah ketiga dan tempatkan kemasan sedemikian rupa sehingga proses penguapan
tidak terganggu. Informasikan pemakaian dry ice pada kurir.
kontaminasi pada alat bantu pipet. Sumbat kapas (stopper) harus cukup padat
dan kapas tidak keluar dari ujung pipet
Sebaiknya dipakai pipet berskala agar pemipetan tak perlu sampai habis benar
(ujung pipet biasanya lebih kecil dan ada kecenderungan penekanan kuat
agar semua cairan keluar sehingga resiko terjadinya droplet lebih besar). Saat
mengeluarkan cairan dari pipet, sentuhkan ujung pipet pada permukaan dalam
wadah dan alirkan perlahan-lahan.
Jangan meniupkan udara di atas bahan yang akan dipipet.
Rendam pipet dalam wadah berisi desinfektan segera setelah selesai tindakan.
Biarkan semalam (minimal 12 jam) sebelum disterilkan.
Sediakan kapas dibasahi desinfektan di dekat tempat kerja agar jika terjadi
tumpahan dapat segera didesinfeksi.
Untuk bahan tercemar, dilarang mengganti fungsi pipet dengan semprit karena
resiko aerosolisasi lebih besar.
Jika memakai mikropipetor, gagang mikropipetor tidak boleh menyentuh atau
menempel bagian dalam dan mulut dari wadah tercemar. Hanya tip yang boleh
masuk ke dalam wadah tercemar
Pemipetan bahan infeksius dilakukan dalam BSC
4. Penggunaan sengkelit/ ose/ loop
Bahaya penggunaan sengkelit adalah aerosolisasi
Gambar 4. Skema wadah spesimen rujukan

Penerimaan Spesimen
Laboratorium rujukan harus memiliki ruang khusus penerimaan spesimen.
Membuka kemasan spesimen
Harus dilakukan di dalam BSC
Spesimen dibuka diatas kertas yang dibasahi desinfektan
Tersedia pula larutan disinfektan untuk menangani tumpahan
3. Penggunaan pipet
Pada saat memipet selalu gunakan alat bantu pipet (pipet aid), dilarang
menggunakan mulut.
Semua pipet harus diberi sumbat kapas di ujungnya untuk mengurangi
34

Lingkaran sengkelit hendaknya penuh, lingkaran yang tidak penuh lebih berisiko
menggores media/gelas dan menimbulkan percikan. Makin panjang gagang
sengkelit, makin besar potensinya menimbulkan aerosol. Upayakan hanya
bagian lingkarannya yang menyentuh bahan yang (berpotensi ) tercemar bahan
infeksius.
Dianjurkan menggunakan sengkelit sekali pakai sehingga mencegah terjadinya
aerosol.
Untuk mencegah terjadinya droplet, sengkelit yang telah dipakai, dimasukkan
ke dalam botol berisi pasir-lysol, dibersihkan dengan jalan memutarnya di dalam
pasir dan tidak langsung pada pembakar Bunsen. Dapat juga dicelupkan pada
pasir-alkohol sebelum dibakar dengan pembakar bunsen. Lakukan desinfeksi
setiap selesai melakukan tindakan.
Inokulasi bahan atau pembuatan sediaan dengan sengkelit hendaknya dilakukan
dalam BSC. Lakukan dengan hati-hati.
35
Komposisi Kit tumpahan biologi

Laboratorium penelitian biomedis dan mikrobiologi harus menyediakan kit tumpahan
biologis. Kit tumpahan adalah alat keamanan penting untuk kerja laboratorium dengan
agen mikrobiologi yang termasuk dalam BSL 2 atau diatasnya. Alat dan bahan berikut
harus ada dalam kit tumpahan:
1. Desinfektan (periksa tanggal kadaluwarsa setiap tahunnya)
2. Forsep, sapu dan serok autoclavable, atau alat mekanik lain untuk menangani
benda tajam.
3. Kertas tissue atau bahan penyerap lainnya
4. Kantong Biohazard untuk membuang tumpahan yang terkontaminasi
5. Tempat sampah benda tajam yang kosong
6. Sarung tangan
7. Pelindung wajah (kacamata dan masker atau pelindung wajah)
8. Sepatu boots kedap air
Pedoman Umum pada Insiden tumpahan
Pembukaan panel kaca kabinet saat bekerja sesuai dengan petunjuk pemakaian.
Nyalakan exhaust fan sebelum bekerja sesuai dengan petunjuk pemakaian
sampai dengan 5 menit setelah pekerjaan selesai.
Gunakan lampu UV sesuai petunjuk.
jangan menggunakan pembakar Bunsen dalam kabinet karena mempermudah
kerusakan filter. Pakailah mikro-incenerator atau ose sekali pakai.
Batasi jumlah bahan dan alat dalam kabinet sesedikit mungkin dan letakkan di
belakang daerah kerja. Bahan dan pengendali alat yang digunakan harus terlihat
melalui panel kaca. Bahan dan alat tidak boleh menghalangi aliran udara BSC
Lakukan pekerjaan di bagian tengah. Pisahkan barang bersih dengan kegiatan
yang dapat menghasilkan aerosol minimal 12 cm. Pisahkan peletakkan bahan
dalam tiga urutan, bersih ( misalnya larutan pengencer steril), tempat pengerjaan,
kotor (misalnya tempat pembuangan tip mikropipet).
Jangan biarkan botol dan tabung berisi bahan infektif terbuka. Segera tutup
kembali setelah dibuka.
Letakkan wadah berisi desinfektan dalam BSC untuk menampung limbah
Hindari menghirup material yang terkandung di udara dan segera tinggalkan
kegiatan atau wadah limbah lain yang dapat diotoklaf.
ruangan. Beritahu yang lain untuk meninggalkan ruangan
Hindari berkali-kali memasukkan dan mengeluarkan tangan. Hindari seminimal
2.
Tutup pintu dan pasang tanda bahaya
mungkin gerakan tangan menyamping dan berputar.
3.
Lepas pakaian yang terkointaminasi, balik bagian yang terkontaminasi ke dalam
Dilarang lalu lalang di muka kabinet bila sedang tak bekerja.
dan masukkan ke kantong biohazard.
Setelah selesai bekerja, kabinet dikosongkan, didesinfeksi, dan UV dinyalakan
4.
Cuci semua bagian kulit yang terpapar dengan sabun dan air.
selama 2 jam atau sesuai dengan petunjuk produsen lampu.
5.
Informasikan pada supervisor dan tim keamanan kerja
Fan kabinet harus dihidupkan 5 menit sebelum bekerja dan setelah pekerjaan di
1.
kabinet selesai
Pembersihan tumpahan
1. Biarkan aerosol hilang/ mengendap selama setidaknya 30 menit sebelum masuk
kembali laboratorium. Persiapkan alat untuk pembersihan (spill kit)
2. Kenakan alat pelindung diri (baju lab, pelindung wajah, sarung tangan lapis ganda
40
Kalibrasi BSC dilakukan secara berkala minimal 1x per tahun.

6. Penggunaan lemari pendingin.
Lakukan defrosting secara teratur.
dan sepatu boot). Buat demarkasi wilayah tumpahan dengan kertas tissue. Tutupi
Semua wadah harus diberi label yang jelas mencakup antara lain tanggal
daerah yang menuju pintu keluar lab. Tutup tumpahan dengan kertas tissue yang
pembuatan dan kadaluwarsa, nama bahan, nama penyimpan. Wadah berisi
mengandung disinfektan dan tuangkan desinfektan hati-hati ditempat tumpahan.
dahak harus tertutup rapat, berdiri tegak.
Gunakan desinfektan yang lebih tinggi konsentrasinya karena anak diencerkan oleh
Dilarang menyimpan makanan, minuman, kosmetika serta barang lain yang tak
tumpahan tersebut. Biarkan kontak selama 20 menit.
berkaitan dengan pekerjaan laboratorium.


37
Jangan menyimpan cairan yang mudah terbakar.
5. Insenerasi merupakan cara mengolah limbah sebelum atau setelah diotoklaf.
Jika ada percikan/tumpahan bahan tercemar, keluarkan barang yang pecah
Insenerasi idealnya dilakukan pada alat dengan dua ruang bakar, di mana
dengan memakai sarung tangan karet. Selanjutnya desinfeksi bagian dalam
pada ruang bakar pertama suhu mencapai 8000C dan pada ruang bakar kedua
lemari pendingin
mencapai 10000C. Waktu retensi gas dalam ruang bakar kedua minimal 0,5 detik.
Jangan mengisi wadah penuh jika akan dibekukan.
Insenerator yang hanya memiliki satu ruang bakar kurang efektif untuk menangani
bahan infektif. Jika memakai carbonizer pakailah sesuai petunjuk pemakaian.
D. Penanganan Limbah.
1. Limbah infektif dan tidak infektif, baik padat maupun cair harus dikumpulkan pada
tempat terpisah dalam wadah yang tidak bocor. Wadah untuk limbah tajam harus
kuat terhadap tusukan.
2. Wadah spesimen dan tutupnya, kaca sediaan yang sudah tak terpakai dan
limbah padat lain harus direndam dalam larutan lysol 5% atau desinfektan lain
yang cocok untuk desinfeksi Mycobacterium tuberculosis selama minimal 12
jam.
3. Limbah cair bekas pewarnaan ditampung dalam wadah yang mengandung lysol
sebelum dibuang ke saluran limbah. Limbah zat pewarna hanya dibuang ke
saluran air kotor yang tak akan mencemari badan air/ sungai untuk konsumsi.
Informasi lebih lanjut dapat ditanyakan kepada Badan Pengendalian Dampak
Lingkungan (Bapedal) daerah masing-masing.
4. Untuk membersihkan tumpahan dahak , petugas harus memakai sarung tangan
ganda dan sepatu kedap air, selanjutnya tutupi dahak dan wadah yang pecah
tersebut dengan kain atau kertas. Tuang larutan lysol 5% atau desinfektan lain
yang sesuai untuk Mycobacterium tuberculosis sampai
membasahi semua
kertas/kain dan biarkan selama 2 jam dalam keadaan basah. Lepas sarung
tangan terluar dan kumpulkan bersama wadah yang pecah, kertas/kain yang
dipakai tempatkan dalam wadah tertutup dan sterilkan. Pakai sarung tangan
lapis kedua baru, selanjutnya pel lantai dengan desinfektan. Sepatu baru dilepas
6. Untuk sterilisasi dengan otoklaf dibutuhkan suhu 1210C dengan tekanan udara
1,5 sampai 2 atmosfer selama minimal 20 menit (perhitungan waktu dimulai saat
suhu dan tekanan udara tersebut tercapai; jangan membuka otoklaf jika belum
dingin benar dan jangan mengisi air berlebihan). Jika jumlah yang di otoklaf
banyak, dianjurkan minimal 30 menit dan 45 menit untuk sterilisasi biakan.
Pastikan bahwa ada ruang kosong diantara barang yang di otoklaf. Pada saat
melakukan otoklaf, pastikan bahwa tidak ada wadah yang tertutup rapat. Wadah
harus sedikit dilonggarkan agar uap air mudah masuk ke dalam wadah. Dianjurkan
melakukan uji fungsi otoklaf secara berkala sebaiknya dengan memakai spora
B.thermophilus sebagai indikator dan ditempatkan di bagian paling tengah dari
bahan yang akan disterilkan. Jika menggunakan pemanasan kering, lakukan
pada suhu 1800C selama minimal 2 jam.
7. Tersedia spill kit yang berisi semua peralatan untuk menanggulangi kecelakaan
kerja berupa tumpahan bahan infeksius (terdiri atas : tissue, lap tebal, forcep,
desinfektan, sapu kecil dengan skop sampah yang bisa didesinfeksi, google,
respirator, sarung tangan, kantong plastik).
Spill kit harus disimpan di tempat yang mudah terjangkau, disertai dengan tulisan
spill kit dan prosedur penggunaannya.
8. Tersedia kotak PPPK yang berisi kapas, antiseptik, plester dll
E. Penanganan Tumpahan Infeksius
setelah alasnya diinjakkan pada kain yang dibasahi desinfektan. Jika percikan
terjadi dalam BSC, jangan matikan blower-nya. Biarkan tetap menyala agar filter
HEPA dapat membantu mengurangi cemaran dan tindakan desinfeksi dilakukan
seperti di atas. Untuk BSC yang tutup dasarnya berpori, lakukan desinfeksi untuk
Tumpahan limbah harus dibersihkan dengan cepat berdasarkan prosedur pembersihan

tumpahan sesuai jenis limbahnya. Harus tersedia Spill kit atau kit penanggulangan
tumpahan biologi.
tutup berpori dan setelah tutup diangkat, lakukan untuk permukaan dibawah tutup
38


39
Catatan :
3. Ambillah jika ada benda tajam dengan forsep dan buang dalam wadah benda tajam.
Pada sampel dahak SPS atau SP, kerjakan pemeriksaan biakan dalam
Tutup desinfektan dan tumpahan dengan menggunakan kertas tissue atau kain lap.
tabung yang sama. Kumpulkan dahak menjadi satu atau ambil dahak
Karena kemungkinan ada benda tajam dibawah kertas tissue, gunakan sapu dan
dengan hasil BTA terbanyak
serok autoclavable untuk membersihkan tumpahan dan letakkan dalam wadah
Identifikasi dikerjakan pada koloni murni dan jumlah memadai (confluent)
benda tajam. Pecahan kecil gelas dapat diambil dengan menggunakan kapas atau
Untuk bahan yang steril, misalnya cairan liquorserebrospinal, bronkolaveolar
kertas tissue yang dipegang dengan forsep. Jika tidak ada benda tajam dalam
lavage tidak perlu dilakukan dekontaminasi dan homogenisasi, cukup
tumpahan, buang material dalam kantong autoclave. Tanggalkan sarung tangan
dilakukan konsentrasi dengan sentrifugasi minimum 3000 g selama 15
terluar, ganti dengan yang baru
menit
Untuk bahan bilasan lambung biarkan sisa makanan mengendap, kemudian
desinfektan. Gerakan pembersihan dilakukan secara sirkuler dimulai dari bagian
dilakukan sentifugasi 3000g selama 15 menit terhadap supernatannya.
terluar menuju ke pusat tumpahan
Selanjutnya identifikasi Mycobacterium mengikuti langkah-langkah sebagai berikut :

1.
Pengamatan makroskopis
a. Amati keberadaan satu atau lebih jenis koloni. Deskripsikan ukuran koloni
dan sifat-sifat lain seperti: kasar, halus, cembung, menyebar, tepi bergerigi,
transparan, keruh, dan sebagainya
b. Amati pigmen pasca inkubasi (kuning, oranye, kuning muda, kuning-oranye).
Jika tak berpigmen, sebut sebagai buff.
c. Jika terdapat lebih dari satu jenis koloni, lakukan subkultur untuk tiap jenis koloni.
2.
5. Buang semua kertas tissue dan alat pelindung yang terkontaminasi dalam kantong
biohazard atau kantong autoclave.
6. Cucilah tangan dan area kulit yang terpapar dengan sabun cair dan air mengalir.
Pembersihan tumpahan di BSC.
1. Biarkan blower BSC menyala dan segera mulai membersihkan.
2. Bersihkan cabinet dari tumpahan, tutup daerah tumpahan dengan kertas tissue atau
kertas tissue yang mengandung disinfektan, jaga supaya wajah tetap dibalik kaca.
3. Jika perlu, genangi permukaan meja juga drain pans dan catch basins dibawah meja
Pewarnaan BTA dengan Ziehl-Neelsen.
kerja berisi disinfektan. Pastikan katup pengering tertutup sebelum menggenangi
Yakinkan tak ada cemaran mikroba yang tahan asam selain Mycobacteria.
area permukaan meja.
Rhodococcus spp, Nocardia spp, Legionella micdadei, kista Cryptopsoridium spp

dan Isospora spp juga tahan asam walau pada tingkat lebih rendah. Dengan cara
ini tidak dapat dibedakan MTB dan MOTT.
3.
4. Bersihkan area sekitarnya (dimana mungkin tumpahan terpercik) dengan
4. Bersihkan dinding kabinet, permukaan meja dan bagian dalam kaca dengan
desinfektan.
5. Jika permukaan meja dan drain pans dan catch basins dibawah permukaan meja
Kecepatan tumbuh.
telah digenangi dengan desinfektan tuanglah disinfektan pada permukaaan meja
Rapid grower akan tumbuh dalam 7 hari atau kurang, sedangkan slow grower akan
kerja. Letakkan wadah dibawah katup pengering dan keringkan disinfektan dibawah
tumbuh setelah itu. Namun hal tersebut tak selalu jelas batasnya. M. chelonae
meja kerja ke wadah tersebut.
subspesies chelonae atau M. thermoresistible pada suhu 35-37oC akan tampak
6. Bersihkan area dibawah permukaan kerja untuk membersihkan sisa disinfektan.
sebagai slow grower. M. chelonae subspesies chelonae menjadi rapid grower pada
7. Cucilah tangan dan kulit yang terpapar dengan sabun dan air.
suhu 25-30 oC dan M. thermoresistible pada suhu 45-52 oC.

4.
44
Pencahayaan.

41
Pembersihan tumpahan sentrifugasi

1. Selalu gunakan safety buckets yang tertutup atau rotor dengan cincin O yang
tertutup. Periksa cincin-O dan ganti jika sudah digunakan, pecah atau hilang. Periksa
tabung atau botol apakah terdapat tanda-tanda pecah dan kelainan bentuk sebelum
digunakan.
2. Selalu gunakan sentrifuse biocontainment dengan safety bucket yang berfungsi baik.
3. Tunggu 5 menit sebelum membuka sentrifus yang mengandung material biologis yang
berbahaya. Jika ditemukan tumpahan setelah sentrifus dibuka, tutup kembali secara
VI. ALUR KERJA BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN

Biakan Mycobacterium tuberculosis dilakukan untuk konfirmasi diagnosis, pemantauan
terapi dan penentuan kesembuhan. Pedoman ini memberikan petunjuk untuk melakukan
biakan, identifikasi dan uji kepekaan menggunakan media padat berbahan telur. Adapun
langkah-langkah untuk melakukan biakan dapat dilihat pada alur di bawah ini.
Gambar 6. Alur Biakan dan Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
hati-hati dan kosongkan laboratorium dan tutup pintu laboratorium. Petugas tetap
diluar laboratorium setidaknya selama 30 menit. Pasang tanda di pintu laboratorium
menunjukkan bahwa ada tumpahan biohazard dan dilarang masuk.
4. Lepaskan semua alat pelindung diri yang terkontaminasi dan masukkan dalam
kantong biohazard. Cuci tangan dan kulit yang terpapar dengan sabun dan air.
5. Masuklah ke laboratorium setelah 30 menit dengan APD dan spill kit.
6. Pindahkan rotor dan bucket ke dalam BSC. Rendam rotor dan bucket dalam alkohol
70% atau disinfektan non korosif yang efektif membunuh Mycobacterium tuberculosis.
Biarkan setidaknya 30 menit untuk kontak. Tabung yang utuh dapat dibersihkan dan
diletakkan dalam wadah yang baru. Ambil pecahan gelas dengan forsep dan buang
dalam wadah benda tajam berisi desinfektan.
7. Pecahan gelas yang lebih kecil dapat diambil dengan kapas atau kertas tissue yang
dipegang dengan forsep. Bersihkan dengan hati-hati bagian dalam centrifus dengan
disinfektan dan biarkan mengering. Jika digunakan pemutih, lanjutkan dengan
alkohol 70% untuk mencegah korosif.
8. Simpan bahan terkontaminasi dan APD yang sekali pakai dalam kantong autoclave
dan lakukan autoclave.
9. Cuci tangan dengan sabun dan air bersih mengalir.
42


43
Apabila terdapat indikasi untuk melakukan uji kepekaan maka uji kepekaan dapat
dilakukan bersamaan atau setelah uji identifikasi.
Gambar 8. Alur Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis
Mycobacteria yang termasuk photokromogen akan menghasilkan pigmen jika

dipaparkan cahaya. Namun pigmen hanya optimal jika koloni kuman terpisah. Jika
pertumbuhannya sangat padat, pigmen tak akan muncul.
5.
Identifikasi Mycobacteria yang lebih rinci dilakukan dengan berbagai cara :

a. Uji biokimia
Misalnya uji niasin, uji reduksi nitrat, uji katalase, uji katalase tahan panas, uji
hidrolisa tween, uji urease, uji arilsulfatase, uji iron uptake, uji penggunaan
sitrate, uji penggunaan inositol, uji penggunaan manitol, uji pirazinamidase dan
uji reduksi telurit.
b. Uji toleransi pada 5% NaCl atau hambatan oleh thiophene 2 carboxylic acid
hydrazide (TCH)
c. Uji pertumbuhan pada media McConkey tanpa kristal violet
d. Uji molekuler
e. Kromatografi cair atau tekanan tinggi.
Perbedaan diantara Mycobacterium tuberculosis complex dapat dilihat pada tabel

dibawah
Tabel 7. Diferensiasi diantara Mycobacterium tuberculosis complex
Urease
Hidrolisa
tween
10 hari
Kepekaan
pada
TCH
Species
Niasin
Nitrat
Katalasa
tahan
panas
M. tuberculosis
Pos
Pos
Neg/pos
Pos
Pos/Neg
Neg/Pos
Resisten
M. bovis
Neg
Neg
Neg
Neg
Pos/Neg
Neg/Pos
Peka
Pyrazinamidase
Pos/
Neg
Neg
Pos
Pos
Neg
Variabel
Neg
Neg/
Pos/
Pos
Pos/Neg Neg/Pos Variable
Neg
M. microti
Pos
Neg
Untuk keperluan praktis, diferensiasi spesies Mycobacterium tuberculosis complex tidak
harus dilakukan
M. africanum
48


45
Sebagian besar Mycobacterium tuberculosis complex dapat dibedakan dengan

Mycobacterium lain menggunakan uji Niasin dan PNB, sehingga untuk melakukan
identifikasi Mycobacterium tuberculosis minimum menggunakan 2 uji tersebut.
Gambar 7. Alur Kerja Identifikasi Rutin
*Subkultur hanya dilakukan apabila

jumlah koloni tidak memadai (<1+) atau
bila ditemukan beberapa koloni dengan bentuk yang berbeda
46


47
d. Periksa kekentalan, warna dan volume dahak. dahak yang baik untuk
pemeriksaan adalah berwarna kuning kehijauhijuan (mukopurulen), kental,
dengan volume 3 5 ml.
e. Jika dahak tidak dapat diinokulasikan dalam 3 (tiga) hari, tambahkan bahan
pengawet CPC 1% dalam NaCl 2%, sama banyak dengan dahak ke dalam pot.
Tutup pot dengan rapat. Dahak harus disimpan pada suhu ruang dan diproses
untuk biakan dalam waktu kurang dari seminggu. Untuk dahak yang dapat
diperiksa dalam 3 x 24 jam, tidak perlu memakai CPC, cukup disimpan dalam
keadaan dingin dengan suhu 6-100C.
Catatan :
Hasil yang dilaporkan adalah hasil pembacaan hari yang ke-28 apabila
isolat menunjukkan resisten pada semua OAT. Hasil yang sensitif untuk
laporan harus menunggu pembacaan hari ke-42.
Hasil uji kepekaan yang benar sangat bermanfaat sebagai panduan pengobatan
penderita. Telah dibuktikan bahwa jika proporsi isolat
resisten lebih dari 1% terhadap satu obat, maka pemakaian obat tersebut untuk tujuan
pengobatan tidak akan tercapai.
Bubuk CPC adalah senyawa higroskopis, bubuk yang telah menjadi basah
harus dianggap kadaluwarsa,
CPC merupakan desinfektan turunan amonium quartener,
Dahak yang dicampur CPC akan menjadi encer setelah paparan 24 jam,
CPC residu yang tidak dinetralisasi akan menghambat pertumbuhan
Mycobacterium tuberculosis terutama pada media berbahan dasar agar.
Sedapat mungkin, hindari pemakaian CPC. Mycobacterium tuberculosis
akan mati jika terlampau lama terpapar pada CPC atau jika konsentrasi CPC
lebih dari 1%
f. Dahak SPS diperiksa secara mikroskopis dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen

g. Bila yang terkumpul diduga bukan dahak (hanya air liur/ ludah) atau dahak
volumenya kurang, petugas harus meminta agar penderita batuk lagi sampai
volumenya mencukupi.
Catatan:
1) Setelah mengolah spesimen petugas harus cuci tangan dengan sabun dan air
mengalir
2) Jika tidak ada dahak yang keluar, pot dahak dianggap sudah terpakai.
Masukkan dalam kantong plastik dan harus dimusnahkan untuk menghindari
kemungkinan terjadinya kontaminasi oleh kuman TB
Terdapat dua pendekatan untuk melakukan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis

terhadap OAT, yaitu: uji fenotifik dan uji genotipik (molekuler). Uji fenotifik merupakan
pengujian atas fakta biologis dari kuman Mycobacterium tuberculosis, sedangkan uji
genotipik merupakan pengujian atas keberadaan gen-gen Mycobacterium tuberculosis
yang telah mutasi pada tempat tertentu.
Saat ini telah ditemukan berbagai cara untuk melakukan uji kepekaan, setiap cara
mempunyai kekurangan dan kelebihan. Dari berbagai cara yang tersedia, tujuh cara
yang paling sering digunakan adalah :
1. Cara proporsi,
2. Cara konsentrasi absolut,
3. Cara rasio resisten,
4. Cara media cair,
5. Cara deteksi perubahan metabolik,
6. Cara mycobacteriophaga dan
7. Cara molekuler.
Dari semua cara tersebut, cara proporsi, konsentrasi absolut dan rasio resisten
merupakan cara yang paling banyak dipakai. Ketiga cara tersebut menggunakan media
Tata cara merujuk spesimen :

1) Sebelum dikirim, hubungi dahulu laboratorium rujukan
2) Pengemasan dan pengiriman bahan rujukan dilakukan sesuai standar. Apabila
tidak tersedia bahan kemasan sesuai standar, maka lakukan:
52

padat yaitu dengan membandingkan pertumbuhan isolat Mycobacterium tuberculosis

dengan kuman kontrolnya. Hal yang paling kritis untuk ketiga cara tersebut adalah
jumlah dan viabilitas kuman dan homogenitas inokulum.

49
Cara proporsi
unggul dalam hal pengendalian besaran inokulum, dengan catatan
proses homogenisasi inokulum
yang diambil dari koloni yang kering harus lebih
lama atau melakukan subkultur lebih dahulu. Cara proporsi kurang mengantisipasi
potensi kesalahan konsentrasi obat. Untuk OAT lini pertama, ketiga cara diatas telah
terstandarisasi dengan baik. Tingkat ketepatannya sangat tinggi untuk rifampisin dan
isoniazid diikuti oleh etambutol dan streptomisin.
Saat ini berbagai penelitian terus berlangsung untuk mendapatkan cara biakan dan
uji resistensi Mycobacteria yang hasilnya cepat. Media yang dipakai merupakan media
cair, sebagian diantaranya menggunakan faktor yang mempercepat pertumbuhan
kuman. Pertumbuhan pada media cair lebih cepat dibandingkan media padat, namun
kemungkinan adanya cemaran harus dibuktikan dengan pewarnaan dan biakan lanjutan
VII. PRAKTEK LABORATORIUM

Praktek laboratorium akan dititikberatkan pada biakan dan identifikasi Mycobacterium
tuberculosis complex dari spesimen dahak dengan menggunakan media padat berbahan
telur. Dipilih sasaran Mycobacterium tuberculosis complex karena spesies terbanyak dari
Mycobacterium tuberculosis complex pada dahak adalah Mycobacterium tuberculosis
dan identifikasi sampai tingkat spesies tidak mudah. Dipilih spesimen dahak karena
merupakan spesimen terbanyak dan menjadi titik berat program pengendalian TB di
Indonesia dan menggunakan media padat berbahan telur, karena media ini yang paling
banyak digunakan di Indonesia serta relatif murah.
A. Pengambilan, Pengiriman dan Penerimaan Spesimen
Spesimen dahak
dengan agar darah.

1. Alat dan bahan yang diperlukan
a.
b.
c.
d.
e.
f.
Pot dahak steril bertutup ulir dan mulut lebar (diameter 4-5 cm)
Formulir permintaan pemeriksaan
Kantong plastik dengan pengaman (Clipped)
Stiker atau penanda tahan luntur
Pipet dengan bulb
Bahan pengawet Cetyl Piridinium Chloride (CPC) 1% digunakan apabila kultur
dikerjakan setelah 72 jam tanpa adanya fasilitas pendingin
2. Cara pengumpulan dahak :
a. Persiapkan pot dahak dengan nomor identitas pada stiker atau pada dinding pot
sebelah luar. Nomor identitas sesuai dengan pedoman nasional.
b. Pada waktu pasien datang, lakukan pengambilan dahak sewaktu. Pasien dibekali
dengan 2 pot dahak dan instruksikan untuk mengumpulkan dahak pagi hari,
dahak ke 3 (SPS) dikumpulkan pada saat pasien datang keesokan harinya.
c. Instruksikan pasien mengeluarkan dahak serta menampungnya dalam pot
dahak di ruang terbuka yang jauh dari pemukiman atau dalam ruang khusus
pengumpulan dahak.
Dahak terbaik untuk biakan adalah dahak yang dikeluarkan pertama kali saat
bangun pertama di pagi hari.
50


51
dalam inspisator yang telah dipanaskan sampai suhu 850C selama
a)
c)
Masukkan pot dahak dalam kantong plastik, kemudian sealed. Tiap

pot dahak memerlukan satu kantong plastik
Letakkan/masukkan pot dahak yang sudah berada dalam kantong
plastik pada kotak / box (styrofoam, plastik atau bahan lain yang tidak
mudah pecah) dengan posisi tegak, menghadap ke atas. Masukkan
formulir kedalam kantong plastik, sealed masukkan kedalam kotak/
box tadi, dan selanjutnya dikirim ke laboratorium rujukan.
Kotak/box harus ditutup rapat dan diberi seal serta cantumkan nama
d)
dan alamat laboratorium rujukan dan laboratorium

tanda peringatan agar jangan dibalik.
Rujukan spesimen dahak
45 menit (lakukan optimasi inspisator) Keluarkan dari inspisator,

b)
tutup botol dikencangkan dan diamkan sampai suhu kamar

c)
Bila kualitas media tidak baik : terlalu lembek, terjadi perubahan

warna, berlubang-lubang, atau terdapat gelembung-gelembung
pada permukaan, maka media tersebut tidak dapat dipakai.
Catatan :
1.
2.
3.
Media LJ dapat memakai potato meal atau tidak

Jika membuat dari media komersial, ikuti petunjuk dari pabrik
Untuk membuat larutan malachite green tersendiri. Lakukan sebagai berikut :
a. Timbang 2 gram Malachite green kristal dalam gelas kimia.
Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/uji kepekaan yang dapat ditempuh dalam 48
jam, kemasan dahak dikirim dalam suhu kamar.
Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/ uji kepekaan yang berjarak tempuh 72 jam,
kemasan dahak dikirim dalam suhu 4-80C dengan cara memasukkan pot dahak
kedalam kemasan yang berisi ice pack.
Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/ uji kepekaan yang memakai mesin MGIT, dahak
tidak boleh diawetkan dengan CPC 10% karena akan mengganggu pembacaan
oleh mesin.
Apabila memungkinkan, laboratorium dapat menjamin kualitas contoh uji dengan

menjaga suhu pada 4-8 0C segera setelah contoh uji diterima oleh laboratorium.
a. Tuang ke dalam mortir, gerus sampai halus, masukkan kembali ke dalam

gelas kimia dan tambah aquadest 100 ml.
b. Masukkan magnetic stirrer, tempatkan di atas stirring hot plate , inkubator

selama 2 jam atau suhu kamar semalaman agar larut sempurna
c. Saring dengan kertas saring Whatmann no 4.

d. Simpan dalam botol coklat, catat tanggal pembuatan pada label.
e. Larutan tahan 1 bulan pada suhu kamar, tetapi sebaiknya digunakan dalam
waktu 1 minggu
c. Kultur Mycobacterium tuberculosis dapat pula dilakukan pada media Ogawa
3% yang telah dimodifikasi ( inokulasi pada media ini tak perlu netralisasi
dengan HCl atau PBS, cukup homogenisasi dengan NaOH 4%)
1)
Bahan
Modified
a.
b.
c.
d.
e.
f.
56
KH2PO4
Magnesium sitrat
Na Glutamat
Glyserol
2% Malachite green
Aquadest steril
10.0 gr
0.5 gr
2.5 gr
20 ml
20 ml

Acidified
15 gr
Tidak ada
5 gr
30 ml
30 ml
500 ml
pengirim. Beri
3. Cara penerimaan spesimen rujukan :
a.
b.
c.
d.
Spesimen diterima di bagian penerimaan di laboratorium

Periksa kesesuaian identitas pada kemasan dan formulir permintaan
Catat data dalam buku register
Bila ada ketidak sesuaian identitas dan kualitas, segera hubungi pengirim untuk
klarifikasi. Jika perlu mintakan lagi dahak pagi hari
e. Kemasan dibuka dalam BSC
f. Gunakan sarung tangan saat menerima dan membuka kemasan contoh uji
g. Periksa apakah ada kebocoran pada kemasan contoh uji, jika terlihat ada
kebocoran kemasan harus langsung dibuang ke tempat sampah yang sudah
53
diberi desinfektan dan selanjutnya di otoklaf.

h. Bila pot dahak ada yang pecah, lakukan desinfeksi pot dahak yang lain dengan
kapas yang sudah dibasahi desinfektan.
2) Bilas dengan air mengalir hingga bersih, kemudian keringkan

3) Rendam dalam alkohol 70% selama 15 menit
4) Cuci dan desinfeksi tangan sebelum memegang telur yang telah bersih
dan kering
B. Pembuatan Media Lowenstein-Jensen
5) Pecahkan telur dan tampung dalam gelas ukur steril

1. Alat dan bahan yang diperlukan untuk membuat media :
Alat :
a. Timbangan analitik
b. Spatula / sendok
c. Gelas ukur 1000 ml steril
d. Gelas beaker 1000 ml steril
e. Pipet 10 ml, 25 ml steril
f. Labu Erlenmeyer 250 ml, 1000
ml steril
g. Botol McCartney
h. Bunsen
i. Power pipet/pipetor
Bahan :
6) Homogenisasi dengan blender, atur kecepatan sedemikian rupa agar

tidak terbentuk gelembung.
7) Saring larutan telur menggunakan corong steril yang telah dialasi kasa
j. pH meter
k. Otoklaf
l. Inspisator/ Hot Air Oven
m. Blender stainless steel
n. Magnetic stirrer & magnetic bar steril
o. Corong steril
p. Kain kasa steril
q. Lap pembersih telur
a. Bahan dasar Medium LJ dengan komposisi :

1) Potassium dihydrogen phosphate
2) Magnesium sulfate heptahydrate
3) Tri-magnesium dicitrate 14-hydrate
4) L-asparagin
5) Potato meal
6) Malachite green2 %
b. Aquadest
c. Glyserol
d. Telur homogen sampai dengan
steril.
8) Ukur dengan gelas ukur steril sampai didapatkan 1 liter.
9) Catatan :
a)
Tidak diperkenankan menggunakan telur dari peternakan yang

menggunakan antibiotika dalam pakannya. Karena umumnya
peternakan bebek dilakukan secara tradisional, telur bebek lebih
kecil kemungkinannya mengandung antibiotika.
b)
Homogenisasi telur agar dilakukan dalam laminar flow/ BSC, untuk

meminimalisasi pencemaran oleh mikroba udara.
b.
:
:
:
:
:
:
:
:
:
2,5 gr
0.24 gr
0.6 gr
3.6 gr
30 gr
20 ml
600 ml
12 ml
1000 ml
Pembuatan media LJ :
1) Larutkan garam-garam, L-Asparagine ( dan potato meal ) media LJ dalam
600 ml aquades, pH 6.8-7.0
2) Tambahkan 12 ml glycerol
3) Tambahkan 20 ml larutan malachite green 2%
4) Setelah tercampur sempurna, sterilkan dalam otoklaf selama 15 menit
pada suhu 1210C
5) Dinginkan sampai suhu + 500C
6) Tambahkan telur homogen 1 liter yang telah dipersiapkan secara
steril, aduk perlahan-lahan, hindari terbentuknya gelembung. Jika ada
Cara pembuatan Media LJ :

a.
Homogenisasi telur :
1) Bersihkan telur ayam/bebek segar yang berumur tidak lebih 7 hari dengan
cara menggosoknya dengan lap, air dan sabun
54

gelembung, diamkan beberapa waktu lamanya untuk menghilangkan

gelembung.
a)
Tuangkan ke dalam botol McCartney steril sebanyak 6 8 ml.
b)
Tutup botol dengan longgar dan letakkan pada kemiringan 300

55
media. Hal ini dianjurkan jika pengolahan dahak dilakukan pada
g.
Telur bebek (homogenisasi

dengan blender dan disaring
melalui kain kasa)
pH akhir
tabung 15 ml.
d. Pengolahan dengan dengan N-Acetyl L-cystein-NaOH( NALC-NaOH)
h.
1000 ml
6,4
6,2
1) Tuang contoh uji ke dalam tabung sentrifus 50 ml
2) Cara kerja
a) Pembuatan larutan garam
2) Ditambah NALC NaOH sama banyak

3) Kocok sampai homogen, tidak lebih dari 30 detik dan diamkan selama 15
menit pada suhu kamar.
(1) Masukkan KH2PO4 dan Na Glutamat ke dalam labu
4) Tambah PBS sampai volume 45 ml. Bolak-balik tabung beberapa kali
erlenmeyer, larutkan dengan aquadest.
5) Timbang agar posisi pada waktu sentrifus seimbang.
(2) Homogenkan di atas hot plate dengan magnetic stirrer
6) Centrifuge selama 20 menit, 4 C, 3000 g

o
sampai larut sempurna.
7) Buang supernatant kemudian ditambah 1 ml PBS
(3) Otoklaf 121oC selama 15 menit, biarkan dingin
8) Inokulasi pada 2 media LJ sebanyak 100 l (4 tetes pipet plastik vol 1 ml)
(4) Ke dalam erlenmeyer yang telah berisi beberapa glass beads
9) Inkubasi pada suhu 37oC.
(diameter 3mm) masukkan glyserol dan malachite green

kemudian lakukan homogenisasi.
Catatan :
(5) Campurkan larutan (1) ke dalam larutan (4)
Pembuatan larutan Natrium sitrat

i.
Timbang 29 g Natrium sitrat dihidrat atau 26 g Na-sitrat anhidrat,
b) Pembuatan media
larutkan dalam 1000 ml aquades
(1) Campur 1000 ml telur yang telah dihomogenisasi dengan
ii.
Buat larutan NaOH 4% seperti di atas
iii.
Campur sama banyak larutan Natrium sitrat dan NaOH.
larutan garam dengan magnetic stirrer, diamkan selama 30
iv.
Otoklaf 121oC selama 15 menit. Dinginkan di suhu ruang
menit.
v.
Simpan di lemari es
(2) Tuang ke dalam botol Mac Cartney kira - kira 6-8 ml, letakkan
botol dalam rak dengan kemiringan 30o.
Larutan NALC-NaOH dibuat sbb :
(3) Masukkan dalam inspisator 80-85oC selama 45 menit.
Larutan ini harus selalu dibuat baru setiap kali akan melakukan
(4) Dinginkan pada suhu kamar.
pemeriksaan (tidak bisa disimpan > 24 jam ). Pembuatan sesuai

kebutuhan, dan sesuai dengan tabel :
C. Biakan Mycobacterium tuberculosis
Tabel 9. Pembuatan larutan sesuai dengan kebutuhan:

N-Acetyl cystein
Stok A ( ml )
Stok B ( ml )
ml
( gr )
NaOH 4%
Na Citrat 2,9%
60
Alat dan bahan yang diperlukan:

1. Untuk pengolahan bahan pemeriksaan
a. Tabung sentrifus 50 ml
0,025
2,5
2,5
50
0,25
25
25
b. Rak tabung
100
0,5
50
50
c.

Biocontained-centrifuge pada gaya gravitasi 3000 g (bukan 3000 rpm)

57
2. Untuk inokulasi
a.
Media LJ
b.
Pipet pasteur steril atau mikropipet 100 ul
c.
Tip mikropipet
Catatan :
timbang bahan 10 kali lipat. Larutan kerja dibuat dengan jalan

menambahkan 1 bagian volume PBS 10 x dengan 9 bagian
volume aquades,pH 7.0
3. Inkubator
4. BSC Class II
c.
1. Dahak tanpa CPC diolah sebagai berikut :
Pengolahan dengan NaOH 4%

1) Tuangkan dahak ke dalam tabung sentrifus 50 ml. Jika lebih dari 10 ml,
pilih 10 ml bagian yang purulen.
Pembuatan larutan NaOH 4% (1 N)

1) Timbang 4 g pelet NaOH kering (jangan biarkan botol NaOH terbuka
karena NaOH sangat higroskopis). Gunakan APD (kaca mata, lab jas,
sarung tangan) saat menimbang NaOH karena NaOH bersifat kaustik
kuat.
2)
menjadi panas.
Tambahkan NaOH 4% sama banyak
3) Campur dengan vortex mixer sampai homogen. Diamkan dalam

suhu ruang tidak lebih dari 15 menit (jika lebih lama, kuman akan mati
4) Tambahkan larutan PBS sampai volumen > 45 ml dengan menggunakan
pipet. (Jika menuang PBS dari botol, gunakan botol dengan volumen 100
2) Masukkan ke dalam beaker yang berisi 100 ml akuades. Beaker akan
ml, buang sisa PBS.)

5) Tutup tabung dengan rapat, sentrifus minimal 3000 g selama 15-20 menit
3) Biarkan menjadi dingin
6) Tuangkan supernatan ke dalam wadah berisi desinfektan. Usap bibir
4) Pindahkan ke dalam botol dan masukkan ke dalam otoklaf 121oC selama

15 menit. Volume NaOH tiap botol upayakan tidak lebih dari 100 ml
5) Simpan di suhu ruang
b.
tabung dengan 95% etanol (jangan sampai masuk ke dalam tabung ).

7)
Tambahkan 1 ml PBS ke dalam sedimen, kocok agar homogen.
8)
Olahan contoh uji siap diinokulasikan. Jangan lupa membuat sediaan

untuk diwarnai dengan ZN pada sisa inokulum
Pembuatan 0.067 M PBS pH 6.8

1) Timbang Na2HPO4 anhidrat 9.47 g, larutkan dalam 1000 ml aquades atau
timbang Na2HPO4 12H2O 23.68 gr dan dilarutkan dengan 1000 ml aquadest
Catatan :
2) Timbang 9.07 g KH2PO4, larutkan dalam 1000 ml aquades, campur,

Atur pH dengan menambahkan
Jika dalam evaluasi ternyata 4% NaOH terlampau kuat, ganti

dengan NaOH 2%. Selalu gunakan larutan steril untuk mencegah
masukkan dalam botol bertutup ulir.

3)
HCl adalah asam kuat. Jika terjadi tumpahan, segera siram

dengan air sebanyak mungkin
Cara pengolahan dahak

a.
PBS dapat dibuat dalam bentuk konsentrat 10x. Untuk itu
cemaran Mycobacteria lingkungan. NaOH adalah senyawa

sedikit asam atau basa agar
higroskopis. Bubuk yang sudah lembab sebaiknya tak dipakai.
mencapai pH 6.8
Apabila menggunakan NaOH 4% dan angka cemaran mencapai

>5% ganti menjadi NaOH 6%
4) Otoklaf 121 oC selama 15 menit, dinginkan di suhu ruang, simpan di lemari

es
Jika menggunakan medium Ogawa 3% untuk inokulasi, setelah

dihomogenisasi dengan NaOH 4% dan didiamkan selama 15
menit, contoh uji yang sudah diolah langsung ditanam pada
58


59
Mycobacterium tuberculosis mempunyai sifat :
200
1,0
100
100
Tidak terjadi perubahan warna koloni setelah terpapar cahaya
300
1,5
150
150
Uji akumulasi niasin positif
500
2,5
250
150
Uji reduksi nitrat positif
1000
500
500
Uji katalase tahan panas 68C negatif

Uji PNB negatif
F. Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
2. Dahak dengan CPC diolah sebagai berikut :

a.
Tuangkan dahak yang sudah bercampur CPC ke dalam tabung sentrifus.
b.
Campur sampai homogen dengan menggunakan vortex, tunggu 10 menit agar

tidak terjadi aerosol. Dahak yang telah seluruhnya mencair dan homogen, tak
Identifikasi Mycobacterium tuberculosis harus dikerjakan pada isolat subkultur yang
perlu di vortex
berumur 2-3 minggu. Bila koloni terkontaminasi, lakukan dekontaminasi dan subkultur
c.
Tambahkan PBS steril sampai tanda batas tertinggi pada tabung sentrifus.
ulang atau subkultur saja jika koloni terduga Mycobacterium tuberculosis terpisah dari
d.
Sentrifus pada 3000 g selama 15 menit, tunggu/diamkan sampai 15 menit
e.
Buang supernatan.
f.
Campur endapan dengan menggunakan vortex, tunggu 10 menit agar tidak
koloni cemaran. Tidak satupun uji tunggal yang dapat dengan pasti membedakan
Mycobacterium tuberculosis dengan Mycobacteria lainnya, teknik molekuler paling
spesifik untuk hal ini.
Jika kondisi laboratorium masih tidak memadai, identifikasi
Mycobacterium tuberculosis minimal didasarkan pada hasil pewarnaan, kecepatan

tumbuh, morfologi koloni, uji PNB dan uji niasin.
Beberapa uji identifikasi yang dapat digunakan adalah sebagai berikut :
1. Uji Niasin
Semua mycobacteria menghasilkan asam nikotinat waktu tumbuh. Kebanyakan
terjadi aerosol.
g.
sentrifus.
h.
Sentrifus pada 3000 g selama 15 menit , tunggu/diamkan sampai 15 menit.
i.
Buang supernatan.
j.
Tambahkan 1ml larutan PBS pH 7,2, campur sampai homogen dengan

menggunakan vortex, diamkan 10 menit untuk menghindari adanya aerosol.
galur Mycobacterium tuberculosis dan beberapa galur M. simiae dan M. chelonae

tidak mampu memetabolisme asam nikotinat tersebut. Asam nikotinat terakumulasi
dalam media. Jumlah asam nikotinat yang dibentuk terbanyak pada media LJ dan
bukan media lain. Karena itu uji niasin memerlukan isolat yang koloninya penuh
k.
Sedimen siap digunakan untuk diinokulasikan pada media.
Inokulasi bahan pada media :
pada media LJ. Udara saat biakan sangat penting dalam metabolisme niasin, karena
1. Pipet 100 ul sedimen ke dalam media LJ, buat duplo
itu tutup tabung biakan harus sedikit longgar selama proses inkubasi.
2. Tutup botol, tetapi jangan terlalu rapat
Uji Niasin dengan Chloramine T

Alat dan bahan yang diperlukan
a.
b.
c.
d.
64
Tambahkan PBS dengan pH 7,2 sampai tanda batas tertinggi pada tabung
Tabung reaksi 5 ml
Ose/sengkelit
Pipet steril dengan bulb
Otoklaf

3. Sebar secara merata bahan pemeriksaan tersebut di atas permukaan media dengan
cara menggerak-gerakkan botol
4. Letakkan botol-botol pada rak dengan kemiringan 300 selama 24 jam pada incubator
dengan suhu 35 - 370C.
5. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung dengan
posisi tegak dan lanjutkan inkubasi.
61
6. Amati pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis setiap minggu.

Pengamatan dilakukan sampai 8 minggu. Hasil negatif dinyatakan jika tak ada
pertumbuhan setelah 8 minggu. Untuk contoh uji yang berasal dari kasus yang
telah mendapat OAT atau pausibasiler, dianjurkan diinkubasi sampai 12 minggu
Tanda khas koloni Mycobacterium tuberculosis adalah :
a. Akan tampak pertumbuhan dalam waktu 2 4 minggu
b. Koloni bewarna putih kekuning-kuningan (buff coloured), permukaan kering dan
rapuh dengan tepi yang tidak beraturan (seperti bunga kol)
c. Konfirmasi dengan membuat sediaan dari koloni dengan pewarnaan Ziehl
Neelsen. Mycobacterium tuberculosis akan memberikan gambaran BTA yang
bergerombol berbentuk khas (serpentine cord, typical cord). Bila hasil BTA
negatif, tidak dilanjutkan dengan subkultur
7. Lakukan pengamatan pertumbuhan koloni setiap minggu
8. Catat hasil pengamatan setiap minggu pada buku catatan biakan
E. Subkultur Isolat Mycobacterium tuberculosis

Subkultur diperlukan untuk memurnikan koloni dan meremajakan kuman sebelum
dilakukan uji kepekaan terhadap OAT, uji identifikasi dan jika akan disimpan pada -70oC
Alat dan bahan yang diperlukan :
1.
Media LJ
2.
Tabung reaksi dengan tutup ulir
3.
Glass beads, diameter 1.5-3 mm
4.
Vortex mixer
5.
Aquades steril
6.
Micropipette 100 l
7.
Tip mikropipet
Cara kerja :
1. Pilih hasil biakan dengan pertumbuhan koloni yang paling baik untuk dilakukan
subkultur, minimal satu untuk tes niacin, satu untuk uji PNB, satu untuk disimpan
D. Pembacaan Hasil Biakan

PEMBACAAN
PENCATATAN
> 500 koloni

200 500 koloni
100 200 koloni
20 100 koloni
1 19 koloni
Tidak ada pertumbuhan
4+
3+
2 +
1 +
Jumlah koloni
Negatif
Keterangan :
- Bila terdapat kontaminasi pada biakan, laporkan segera dan ulangi pembuatan
biakan
- Bila biakan POSITIF dan pertumbuhan dinilai sebagai Mycobacterium
tuberculosis, laporkan segera pada pihak yang berkepentingan
- Pada minggu ke 4 dapat dibuat laporan sementara
- Pada minggu ke 8 dibuat laporan akhir (final)
pada -70 oC dan satu untuk uji kepekaan.

2. Ambil koloni sebanyak 1 (satu) sengkelit penuh
3. Masukkan dalam tabung reaksi yang telah diisi dengan 1 ml aquadest steril dan
glass bead, tutup tabung reaksi.
4. Homogenisasi dengan menggunakan vortex mixer selama 1 menit
5. Diamkan minimal selama 15 menit
6. Ambil suspensi kuman dari bagian terbawah 1/3 atas sebanyak 100 l. Lakukan
inokulasi pada setiap botol Mc Cartney yang telah berisi media LJ, botol ditutup
kembali.
7. Sebarkan inokulum secara merata di atas permukaan media dengan cara
menggerak-gerakkan botol
8. Tutup botol dilonggarkan, letakkan pada rak dengan kemiringan 300, simpan
dalam inkubator dengan suhu 35 - 370C selama 24 jam
9. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung
dengan posisi tegak dan lanjutkan inkubasi sampai 2-3 minggu
10. Amati pertumbuhan tiap minggu
62


63
3.
Dalam cairan
asam, sianogenbromida akan menghidrolisis
hydrocyanic acid yang mudah menguap dan sangat toksik.

Buanglah semua tabung reaksi ke dalam larutan disinfektan
yang alkalis dengan menambahkan sama banyak larutan 10
% NaOH
e.
f.
g.
h.
Larutan KCN 1%
NaOH 4 %
Kontrol positif biakan Mycobacterium tuberculosis H37RV
Cara kerja :
a.
Catatan
pembuatan larutan sianogen bromida dapat juga dilakukan
dengan menambahkan 50 ml air dalam botol berisi 25 gr
b.
c.
Gores media LJ dengan menggunakan ose steril sampai terbelah

Masukkan pada otoklaf 1210 C selama 60 menit dengan posisi
horizontal sehingga semua cairan menutupi permukaan media
sianogen bromida dan dibiarkan minimal semalam. Sianogen

bromida yang terlarut mempunyai konsentrasi sekitar 10%
Tambahkan 1 ml aquadest steril pada subkultur Mycobacterium

tuberculosis dengan jumlah koloni penuh/hampir penuh
Kristal sianogen bromida sangat sukar larut. Karena itu
d.
Keluarkan botol dari otoklaf dan letakkan pada posisi tegak, diamkan
selama 5 menit
Cara kerja
1. Tambah 1-2ml aquades atau 0.85% NaCl kedalam botol biakan
Larutan Chloramin T 5%
yang
koloninya penuh
2. Gores media sampai terbelah
3. Biarkan selama satu malam
e.
f.
g.
h.
4. Ambil 1 ml cairan , tambah sama banyak berturut-turut larutan 4% anilin

dan larutan 10% sianogen bromida
5. Amati timbulnya warna kuning setelah 5 menit
Tambahkan 0,5 ml larutan Chloramin T 5%

Tambahkan 0,5 ml larutan KCN 1%
Campur sampai homogen. Amati perubahan warna sampai 5 menit
Positif
: terbentuk warna kuning
Negatif
: tidak berwarna
Sebelum isi tabung dibuang, lakukan netralisasi dengan menambahkan

NaOH 4%
Catatan :
Gunakan kontrol pada tiap pengerjaan. Kontrol positif menggunakan biakan
Pipet 0,5 ml cairan ekstrak dan masukkan ke dalam tabung reaksi 5ml
i.
Mycobacterium tuberculosis H37RV. Kontrol negatif menggunakan media
Bila koloni mempunyai ciri-ciri spesifik tetapi hasil tes Niacin negatif,
maka tes Niacin diulang
LJ yang tidak ditanami spesimen/media steril

Asam nikotinat akan berdifusi ke dalam media. Jika permukaan media
penuh dengan koloni kuman, maka proses ekstraksi asam nikotinat dengan
aquades/dapar akan terganggu. Itu sebabnya media harus tergores.
Jumlah koloni yang terlampau sedikit juga menyebabkan negatif palsu.
Pakailah subkutur dengan jumlah koloni minimal 50
Warna kuning akan lebih jelas jika pencampuran reagensia dan suspensi
kuman dilakukan perlahan-lahan. Warna kuning akan tampak sebagai
cincin diantara kedua larutan. Jika terkocok, warna kuning akan terencerkan
menjadi lebih pudar.
68

Uji Niasin dengan Paper Strip

a.
Pilih paper strip yang telah direkomendasikan oleh WHO atau yang
hasil meta analisisnya paling sensitif
b.
Ikuti prosedur dari pabrik.
Uji Niasin dengan Anilin atau Benzidine

Bahan
1.
Larutan anilin 4% atau benzidine 3% dalam etanol 95%

a. Catatan cara pembuatan

65
Oleh karena anilin atau benzidine dapat berubah warna
alumunium foil, tulis berat yang tertera pada secarik kertas
bila terpapar dengan udara dan cahaya, sebaiknya larutan
3. Masukkan 5 g kristal sianogenbromida dalam gelas beaker
dipersiapkan dengan segar sewaktu diperlukan.Gunakan anilin
berpenutup allumunium foil tersebut
atau benzidine yang jernih dan tidak berwarna.
4. Tambahkan akuades dalam gelas beaker sejumlah 10x berat
Campur dan kocok anilin atau benzidine dengan etanol dalam
kristal sianogenbromide yang tertimbang
botol berwarna coklat untuk menghindari udara dan cahaya .
5. Tutup gelas beaker dengan alumunium foil dan letakkan pada

lemari asam pada suhu kamar selama 24 jam sampai kristal
b. Penyimpanan reagen
sianogenbromide larut dalam air
1. Simpan dalam botol coklat
6. JANGAN lewatkan larutan pada api bunsen
2. Label tiap botol dengan nama reagen, dan tanggal pembuatan
7. Tuangkan hati-hati dalam botol warna coklat kemudian tutup
reagen
rapat
3. Simpan ditempat yang gelap dan dalam lemari pendingin
8. Simpan dalam lemari pendingin.
4. Jangan gunakan larutan anilin yang warnanya telah berubah
9. Bila akan dipakai, hangatkan dahulu pada suhu kamar untuk
menjadi kuning
melarutkan presipitat yang terjadi selama penyimpanan.

10. Buatlah larutan secukupnya oleh karena sianogenbromide
c. Kendali mutu
1. Reagen tidak berwarna
mudah menguap dan akan kehilangan potensinya selama
2. Buang reagen bila larutan berubah warna menjadi kuning atau
penyimpanan
terdapat endapan
c. Penyimpanan reagen
1. Simpan dalam botol coklat dan botol harus ditutup dengan rapat
d. Keamanan kerja
1. Anilin merupakan onkogenik dan dapat penetrasi melalui kulit.
oleh karena larutan ini mudah menguap. Penguapan dapat
2. Bekerjalah dengan memakai sarung tangan dan dengan hati-
mengurangi potensi larutan ini dan akan memberikan hasil

negatif palsu.
hati
2. Label tiap botol dengan nama reagen dan tanggal pembuatan
3. Kerjakan dalam lemari asam
reagen
2.
SianogenBromida 10%
a.
Bahan
1. Kristal sianogenbromide
2. Akuades
b.
3. Simpan dalam lemari es

5
gr
50
ml
1.
Sianogenmerupakan lacrimator kuat dan toksik bila dihirup;
Cara pembuatan
bekerjalah dalam lemari asam selama pembuatan reagen dan
1. Kerjakanlah dalam lemari asam atau dalam BSC dengan
dalam BSC selama melakukan uji biokimiawi
penghisap udara. Hindari kontak yang terlalu lama dengan

kristal sianogenbromide selama proses penimbangan
2. Timbang gelas beaker kosong yang sudah ditutup dengan
66
d. Keamanan kerja

2.
Sianogenbersifat onkogenik dan dapat penetrasi melalui kulit,

oleh karena itu bekerjalah dengan memakai sarung tangan dan
dengan hati-hati

67
1)
Larutan stok
0.067M Na2HPO4 anhidrat (9.47 g dalam 1000 ml aquades)
0.067M KH2PO4 (9.07 g dalam 1000 ml aquades)
0.067M Na3PO4 (25.47 Na3PO4.12H2O dalam 1000 ml aquades)
1% phenophtalein (1 g dalam 100 ml aquades)
1% bromthymolblue (1 g dalam 100 ml etanol 95%)
0.01% bromthymolblue (1 ml larutan no 5 dalam 99 l aquades)
2)
Dapar kerja
Campur 35 ml larutan stok 1 dengan 1.5 ml larutan stok 2 dan 100 ml
larutan stok 3 diatas
3)
Cara membuat larutan standar

Deretkan 8 tabung bersih yang sama dengan tabung uji.
Masukkan 2 ml dapar kerja dalam tiap tabung, kecuali tabung 1
Buat larutan 7 dengan cara mencampur 0.1ml larutan stok 4 dengan 0.2
ml larutan stok 6 dan 9.7 ml dapar kerja ( ini standar +5 )
Kedalam tabung nomor 2, masukkan 2 ml larutan stok 7, kocok ( ini
menjadi standar +4 ).
Ambil 2 ml dan pindahkan ke tab no 3, kocok ( standar +3).
Ambil 2 ml dari standar+3, pindahkan ke tabung no 4, kocok ( standar +2 ). Lakukan hal sama untuk standar +1 dan 0.
Buang kelebihan 2 ml dari standar 0.
Otoklaf dan simpan pada lemari es
Cara kerja
a Masukkan 0,2 ml 0.85% larutan NaCl dalam tabung
b Ambil 2 sengkelit penuh koloni ,
c Masukkan 2 ml reagen nitrat dalam tabung, suspensikan kuman
d Inkubasi dalam penangas air ( bukan inkubator ) pada suhu 37 oC selama 2 jam
e Tambah 1 tetes HCl 50% , campur sampai rata
f Tambah 2 tetes Sulfanilamide 0,2% + 2 tetes N-Naphtylenediamine 0,1%,
campur
g Baca segera dengan membandingkan pada larutan standar
Pembacaan :
72

Metode ekstraksi asam nikotinat dari medium bermacam-macam. Ada

yang mengekstraksi pada suhu ruang selama 30 menit atau 24 jam dalam
inkubator, pendidihan bahkan otoklaf. Tiap lab dapat melakukan optimasi
dengan kuman standar.
Uji niasin dengan menggunakan anilin dan sianogen bromida merupakan
cara terbaik dibandingkan kedua cara lain.
2. Uji Katalase Tahan Panas
Katalase akan menghidrolisis hirogen peroksida menjadi air dan oksigen. Gas
oksigen akan menyebabkan timbulnya gelembung-gelembung dalam larutan. Semua
Mycobacteria, kecuali beberapa galur Mycobacterium tuberculosis yang resisten
isoniazid dan M. bovis menghasilkan katalase dalam jumlah dan sifat tahan panas yang
berbeda. Pengujian jumlah dilakukan dengan uji katalase semikuantitatif, sedangkan
sifat tahan panasnya diuji pada suhu 68oC. Mycobacterium tuberculosis dan beberapa
mycobacteria lainnya kehilangan aktifitasnya jika dipanaskan sampai 68 oC.
Alat
a. Tabung reaksi 20 x 125 mm
b. Aplikator steril/ ose
c. Waterbath/ penangas air
d. Pipet ( otomatik )
Reagen
a. Buffer Phosphat 0,067 M pH 6.8
1) Timbang 9.47 g Na2HPO4, larutkan dalam 1000 ml aquades, sterilkan
dengan otoklaf
2) Timbang 9.07 g KH2PO4, larutkan dalam 100 ml aquades, sterilkan
dengan otoklaf
3) Campur sama banyak, tera pH dan atur sampai pH 6.8. Bekerjalah
dengan cara aseptik
b. H2O2 30%
1) Tersedia di pasaran dalam bentuk larutan 30%. Larutan ini dapat
menyebabkan terbakarnya kulit dan mata
2) Simpan dalam lemari pendingin dengan tutup rapat
69
c. Tween 80, 10%
Alat
1) Hangatkan Tween 80 dan 90 ml aquades pada penangas air 50 C
a. Tabung reaksi plastik ( beberapa tabung gelas mengandung residu nitrit )
2) Pipet 10 ml Tween 80. Buang kelebihan Tween pada permukaan luar pipet
b. Ose/ sengkelit
3) Masukkan Tween ke dalam aquades hangat. Bilas Tween dalam pipet
c. Inkubator
sampai bersih. Biarkan dalam penangas air sampai semua Tween terlarut
4) Simpan pada lemari es
Cara kerja
d. Pipet pasteur
e. Pipet ukur
Reagen
a. Buat campuran H2O2 30% dan Tween 80 10% sama banyak.
a. Reagen nitrat 0,01M
b. Pipet 1 ml PBS pH 7,0 kedalam tabung reaksi.

c.
NaNO3 ..................................................................0,085 gr
Tambahkan beberapa sengkelit penuh koloni bakteri umur 2-3 minggu
KH2PO4 ..............................................................0,117 gr
d. Pindahkan 0.5 ml kedalam tabung lain. Sehingga akan didapat dua set tabung
Na2HPO4 ............................................................0.193 gr
berisi kuman.
Aquadest .............................................................100 ml
e. Tabung pertama diinkuba si pada suhu 68oC dalam penangas air selama 20
Atur pH sampai 7.0
menit. Tabung kedua diinkubasi pada suhu ruang.

f.
Sterilkan dengan otoklaf
Keluarkan dan biarkan sampai suhu kamar.
Simpan pada lemari es
g. Tambah 0,5 ml campuran H2O2 dan Tween 80 segar. Jangan digoyang karena
akan terbentuk gelembung, amati selama 20 menit.
Pembacaan :
b. HCl 50%
50 ml konsentrat HCl ditambah 50 ml aquadest
c. Sulphanilamide 0,2%
Positif : terbentuk gelembung, walau kecil

Negatif : tidak terbentuk gelembung sampai 20 menit
Larutkan dengan sempurna di dalam botol coklat 0,2 gr sulphanilamide

dengan 100 ml aquades . Untuk memudahkan pelarutan, lakukan dalam
penangas air 47-50 oC.
Jangan gunakan sulphanilamide yang tak larut sempurna. Reagensia
3. Uji Nitrat
dapat dipakai
Spesies Mycobacteria mempunyai kemampuan berbeda dalam mereduksi nitrat.

Mycobacterium tuberculosis merupakan spesies terkuat dalam mereduksi nitrat
dibandingkan mycobacteria lain. Uji harus dilakukan pada kuman terduga Mycobacterium
tuberculosis yang tumbuh subur usia 3-5 minggu. Jangan menggunakan biakan yang
lebih dari 5 minggu. Media yang dianjurkan untuk menumbuhkan Mycobacterium
tuberculosis untuk uji nitrat adalah LJ.
selama 1 bulan
d. N-naptyl ethylenediamine dihydrochloride 0,1%

Larutkan dalam botol coklat 0,1 gr N-naptyl ethylenediamine dihydrochloride
dengan 100 ml aquades. Simpan dalam lemari es. Larutan dapat dipakai selama
1 bulan.
e. Bubuk Zink
f. Standar warna
70


71
Potassium dihydrogen phosphate .
2,4 gr
Magnesium sulfate heptahydrate .
0.24 gr
Positif : warna pink dengan standar minimal +3. Ulangi pengujian jika
hasilnya +2.
Tri-magnesium dicitrate 14-hydrate
0.6 gr
Negatif : hasil sesuai dengan standar warna 0 atau +1
L-asparagin 3.6 gr
Potato meal 30 gr
Malachite green
Aquadest ..600
b. Glyserol
Kontrol negatif ditambah bubuk zink, jika berubah menjadi pink berarti
kontrol negatif benar
0.4 gr
Catatan: Uji nitrat dalam bentuk paper strip tersedia di pasaran. Ikutilah petunjuk pabrik
dalam pengerjaannya.
ml
. 12 ml
4. Uji Paranitro-Benzoic Acid ( PNB )
c. Telur homogen... 1000 ml

2.
Untuk membuat stock solution OAT & working solution obat
Alat :
a. Labu ukur steril
b. Filter membrane 0.22 micron disposable
c. Cryo tube 1 ml steril + rak tube
d. Pipet steril + bulb
e. Micropipet + tip steril
Bahan :
a. Rifampicin (susceptibility test grade ) 40 mg/lt
b. Isoniazid (susceptibility test grade)
0.2 mg/lt
c. Ethambutol (susceptibility test grade ) . 2

d. Streptomycin sulfate (susceptibility test grade)
mg/lt
e. Dimethyl formamide (Analytical grade )

f. Aquades
mg/lt
Alat dan bahan :

1. Media LJ yang mengandung PNB ( cara pembuatan media mengandung PNB
dapat dilihat pada cara pembuatan media dengan obat )
2. Inkubator
3. Rak tabung
Cara kerja :
1. Ambil 100 ul suspensi 1 mg/ml stok dan inokulasi pada media LJ yang
mengandung PNB dan satu tabung tanpa PNB
2. Tutuplah botol agak longgar.
3. Sebarkan bahan pemeriksaan tersebut secara merata di atas permukaan
media dengan cara menggerak-gerakkan botol.
4. Letakkan botol-botol pada rak dengan kemiringan 300 selama 24 jam pada
incubator dengan suhu 35 - 370C
5. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung
dengan posisi tegak dan lanjutkan inkubasi (copy paste)
6. Amati pertumbuhan M. tuberculosis setiap minggu. Jika sesudah minggu ke 4
tidak terlihat adanya koloni, pengamatan dilakukan sampai 8 minggu sebelum
hasilnya dinyatakan tidak ada pertumbuhan.
7. Catat hasil pengamatan setiap minggu pada buku catatan biakan
8. Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis akan dihambat oleh PNB
Catatan: Uji PNB langsung dari hasil olahan dahak tidak dianjurkan. Uji PNB
dianjurkan dilakukan dari isolat terduga Mycobacterium tuberculosis
5. Uji Pyrazinamide
76


73
Uji resistensi terhadap pyrazinamide sukar pelaksanaannya. Hasil uji pyrazinamidase

dapat memperkirakan apakah Mycobacterium tuberculosis masih sensitif atau resisten
terhadap pyrazinamide. Selain itu dapat digunakan untuk membedakan antara M. avium
complex, M. marinum dengan M. kansasii dan M. bovis yang negatif pada uji niasin.
Bahan
Timbulnya warna merah jambu
: Positif
Warna tak berubah
: Negatif
Catatan :
1. Media
Positif menunjukkan bahwa isolat Mycobacterium tuberculosis mungkin resisten
a. Larutkan 6.5 g kaldu Dubois base dalam 1000 ml aquades
terhadap pyrazinamide
b. Tambahkan
Pyrazinamide murni
Selalu sertakan kontrol positif ( M. intracellulare ATCC 13950 ) dan kontrol negatif
.. 0.1 g
( M. Kansasii ATCC 12478 ), medium tanpa inokulum dan reagen saja
Natrium piruvat 2.0 g

Agar .. 15.0 g
G. Pembuatan Media untuk Uji PNB dan Resistensi
c. Larutkan dalam penangas air

d. Masukkan 5 ml dalam tabung tutup ulir dalam posisi tegak
e. Otoklaf 121oC selama 15 menit
f. Simpan pada lemari es. Medium dapat tahan selama 6 bulan

1.
Untuk membuat media :
Alat :
bila tidak kering atau tercemar
a. Timbangan analitik
2. Reagen 1 % amonium ferosulfat
b. Spatula / sendok
a. Masukkan 0.1 g amonium ferosulfat dalam tabung tutup ulir

b. Larutkan dalam 10 ml aquades steril
c. Reagen tidak dapat disimpan, harus dibuat segar
d. Gelas beaker
e. Pipet 10 ml, 25 ml steril
f.
Cara kerja
1. Inokulasikan satu sengkelit penuh isolat usia 2-3 minggu pada permukaan media
secara duplo.
Labu Erlenmeyer 250 ml, 1000 ml steril
g. Botol Mc Cartney
h. Elpiji & Bunsen
2. Tutuplah tabung agak longgar, inkubasi pada suhu 37 C
i.
Power pipet
3. Setelah 4 hari, keluarkan 1 tabung dan tambahkan 1.0 ml reagen.
j.
pH meter / kertas pH
4. Amati warna merah jambu yang terbentuk pada perbatasan permukaan agar dan
k. Otoklaf
reagen setelah 30 menit pada suhu ruang. Jika tidak ada warna, masukkan ke
l.
lemari es selama 4 jam, kemudian baca ulang.
m. Blender stainless steel
5. Jika masih tak muncul warna, lanjutkan inkubasi sampai 7 hari dan ulangi
6. Pengamatan. Jika tidak terbentuk warna berarti negatif.
Pembacaan
74
c. Gelas ukur

Inspisator
n. Magnetic stirrer & magnetic bar steril

Bahan :
a. Bahan Medium LJ base dengan komposisi :
75
Cara kerja :
Cara pembuatan :
1. Isi tabung bertutup ulir dengan 10-15 glass beads diameter 1.5 mm atau 5-10 jika
1. Buat stock solution (SS) dan working solution (WS) obat dengan cara :
diameternya 3 mm, kemudian tambah Tween 80, 0.1% 2 tetes untuk membasahi
glass beads kemudian disterilkan dalam otoklaf.
2. Timbang tabung tsb, misalnya M1
3. Ambil satu ose penuh koloni bacilli yang berumur 2 4 minggu dan masukkan dalam
tabung di atas. Tutup tabung dengan rapat
4. Timbang tabung, misalnya M2. Jadi berat bacilli adalah M2 M1 = M3
5. Vortex 2 menit, kemudian diamkan 15 menit
6. Tambahkan aquades steril sesuai dengan volume M3 ml
7. Homogenkan dengan menggunakan vortex mixer selama maximum 2 menit
a. Contoh Rifampicin murni dengan potensi bahan hanya 95% :

Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 105.26 mg obat + 10 ml dimethyl formamide
Konsentrasi 8.000 mg/lt (WS) : 4 ml + 1 ml dimethyl formamide (buat tabel)
SS disterilkan dengan filter membrane yang disposable, kemudian
pengenceran selanjutnya dilakukan secara steril
Semua larutan obat, terutama untuk SS dimasukkan dalam cryo tube
Cryo tube diberi catatan nama obat, pengenceran & tanggal pembuatan
WS dibagi dalam aliquot sesuai kebutuhan
Catatan : SS yang disimpan pada -70oC dapat bertahan 2 tahun
WS yang disimpan pada -20oC dapat bertahan 3 bulan
8. Diamkan 15 menit. Yakinkan suspensi telah homogen.

9. Ambil suspensi dari bagian terbawah 1/3 atas dan buat pengenceran serial 10 kali
lipat (lihat uji kepekaan)
Jika metode penimbangan tidak dapat dilakukan, gunakan kepekatan kuman menurut Mc
b. Contah isoniazid murni dengan potensi bahan 100%

Cara kerja dan penyimpanan sama seperti Rifampicin
Cara membuat pengenceran adalah sebagai berikut :
Farland untuk inokulum. Gunakan kepekatan antara 0.5-1.0 skala Mc Farland. Kepadatan
Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 100 mg obat + 10 ml aquades steril
kuman dalam suspensi terbaik dilakukan dengan nefelometer atau penimbangan. Jika
Konsentrasi 1.000 mg/lt
: 0.5 ml + 4.5 ml aquades steril
tidak ada, lakukan standarisasi makroskopik seperti dibawah
Konsentrasi 100 mg/lt
Konsentrasi 20 mg/h (WS)
: 1 ml + 4 ml aquades steril
Cara penyediaan kuman untuk mencapai standar Mc Farland dapat dilihat dibawah :
a. Bahan
0.1 g
BaCl2
H2SO4 pekat
1.0 ml
b.
80
Cara membuat
1) Larutkan 0.1 g barium klorida dalam 10 ml aquades (larutan 1)
2) Campur 1.0 ml asam sulfat pekat dengan 10 ml aquades (larutan 2).
Bekerjalah seperti menangani asam klorida. Asam sulfat adalah asam
kuat
3) Campur larutan 1 dan larutan 2 dengan komposisi seperti dalam tabel
dibawah
Standar
0.25
0.5
1.0
2.0
3.0
Larutan 1 ( ml )
0.025
0.05
0.1
0.2
0.3
Larutan 2 ( ml )
9.975
9.95
9.9
9.8
9.7
c. Contoh ethambutol murni dengan potensi bahan 100%

-
Konsentrasi 200 mg/lt (WS)
d. Contoh streptomycin murni dengan potensi bahan 100%

-
Konsentrasi 800 mg/lt (WS)

77
Catatan :
Isoniazid 20 mg/lt diambil 1.5 ml lalu tambahkan ke erlemeyer II
Sediaan obat banyak yang tersedia dalam bentuk konjugat atau terhidrasi,
Ethambutol 200 mg/lt diambil 1.5 ml lalu tambahkan ke erlemeyer III
maka diperlukan faktor koreksi.
Streptomycin 800 mg/lt diambil 0.75 ml lalu tambahkan ke erlemeyer IV

PNB diambil 2.25 ml lalu tambahkan ke erlemeyer V
Misal : streptomisin sulfat dan dihidro streptomisin. Jika sediaan adalah

streptomosin sulfat anhidrat dengan potensi 100%, maka jumlah obat yang
h. Putar perlahan-lahan erlemeyer I V dengan menggunakan magnetic stirrer
ditimbang harus dilebihkan menjadi 120%.

Untuk perhitungan koreksi, lihat rumus faktor koreksi pada lampiran.
supaya obat merata.

i.
2. Pembuatan larutan PNB :

a.
Timbang 0.1 gr PNB dan larutkan dalam 3 ml dimethyl formamide
b.
Pada setiap 150 ml media LJ tambahkan 2,25 ml larutan PNB atau Timbang
dan larutkan 250 mg PNB dalam 10 ml propylene glycol.
dengan jenis obat. Hindari terjadinya gelembung dengan cara mengalirkan media
melalui dinding botol tanpa menyentuhkan ujung pipet pada dinding botol.
j.
a. Larutkan 37.5 gr LJ medium base dalam 600 ml aquades
Tutup botol rapat dan letakkan pada nampan dengan kemiringan 300, masukkan
ke dalam inspisator yang telah dipanaskan 850C selama 45 menit.
Dalam hal ini media dibuat dengan menambahkan 2 ml larutan PNB dalam 98 ml LJ
3. Pembuatan media dengan obat dan media dengan PNB :
Bagikan media @ 7 ml kedalam botol-botol steril yang telah diberi kode sesuai
k. Keluarkan dari inspisator dan diamkan pada suhu kamar.

l.
Bila kualitas media tidak baik (terjadi perubahan warna, berlubang-lubang, atau
b. Tambahkan 12 ml glycerol
terdapat gelembung-gelembung pada permukaan) maka media tersebut tidak
c. Setelah tercampur sempurna, sterilkan dengan otoklaf selama 15 menit pada
dapat dipakai.
suhu 1210C
d. Dinginkan sampai suhu + 500C
e. Tambahkan telur homogen 1 liter yang telah dipersiapkan secara steril, campur
perlahan-lahan agar tidak terbentuk gelembung.
f.
Tuangkan dalam erlenmeyer steril yang masing-masing telah diisi magnetic bar
steril :
Erlenmeyer I : 150 ml media LJ kurangi 0.7 ml untuk Rifampicin
a. Media dengan kualitas yang baik dicatat tanggal pembuatannya dan disimpan
dalam refrigerator (suhu 4 80C )
b. Penyimpanan dapat sampai 4 minggu dengan tabung ditutup rapat.
H. Pembuatan Suspensi Kuman untuk Uji Kepekaan
Erlenmeyer II : 150 ml media LJ kurangi 1.5 ml untuk Isoniazid
Erlenmeyer III : 150 ml media LJ kurangi 1.5 ml untuk Ethambutol
1. Tabung tutup ulir steril atau botol Mc Cartney
Erlenmeyer IV : 150 ml media LJ kurangi 0.75 ml untuk Streptomycin
2. Glass beads steril diameter 1.5-3 mm
Erlenmeyer V : 150 ml media LJ kurangi 2.25 ml untuk PNB
3. Timbangan
Erlenmeyer VI : 850 ml media LJ tanpa obat
4. Vortex mixer
g. Siapkan WS dari obat :

Rifampycin 8.000 mg/lt diambil 0.75 ml, lalu masukkan ke erlemeyer I
78
4. Penyimpanan media

5. Koloni berumur 2 <4 minggu.

6. Aquades steril
7. Tween 80, 0.1%
79
tabung kuman jika tidak sedang diperlukan.
4)
c. Jangan meneteskan inokulum. Tempelkan ujung tip pada permukaan media,

keluarkan
inokulum
dari
tip
perlahan-lahan.
Aerosolisasi
tidak
Masukkan 5-10 ml standar ke dalam tabung dengan dinding bening,

rata dan cukup lebar dan sama dengan tabung yang akan dipakai untuk
hanya
membuat inokulum. Tutup dengan rapat.
membahayakan keselamatan petugas tetapi dapat juga menyebabkan bias hasil
5)
uji resistensi.
Untuk membandingkan kepekatan inokulum dan standar, letakkan tabung

berisi kuman diantara standar 0.5 dan 1.0 dengan latar belakang hitam
d. Jika menggunakan mikropipet, yakinkan gagang pipet melekat erat pada tip.
yang tidak mengkilat. Volume pembanding dan yang dibandingkan harus
Jangan pakai tip yang lnggar atau ujungnya telah meruncing, yakinkan tidak ada
sama. Amati titik tengah larutan sejajar mata pengamat Kocok dahulu
gelembung pada tip.
standar sebelum dibandingkan dengan suspensi inokulum
J. Interpretasi Hasil Uji Kepekaan
6)
Standar harus diganti tiap 6 bulan atau jika telah ada gumpalan.
Pembacaan
Pembacaan pertama kali dilakukan pada hari ke 28, jika hasilnya adalah resisten
tidak perlu diadakan pembacaan ulang. Kuman tersebut dapat diklasifikasikan
I. Uji Resistensi Mycobacterium tuberculosis Cara Proporsi

1. Timbangan dengan sensitivitas 0.1 mg.
Alat:
sebagai resisten. Jika hasilnya adalah sensitive maka perlu diadakan pembacaan
1. Sengkelit
ulang pada hari ke 42 untuk meyakinkan hasil pembacaan pada hari ke 28. Jadi
2. Tabung 10 ml bertutup ulir steril
pembacaan pada hari ke 42 berfungsi pula sebagai alat kontrol.
3. Tabung 15 ml bertutup ulir steril

4. Glass beads diameter 1.5-3 mm steril
Jumlah koloni pada permukaan media harus dihitung dengan tepat. Pada botol Mc
5. Vortex mixer
Cartney dengan volume 14 ml, jumlahnya kurang dari 100 koloni. Hasil ini mungkin
6. Pipet volumetrik 1 ml dan 10 ml steril
teramati pada media tanpa obat pada pengenceran 10-5 atau pada media dengan
7. Automatic pipette 100 l dan tip pipet
obat pada pengenceran 10-3. Idealnya jumlah koloni antara 50-100 terdapat pada
8. Botol Mc Cartney
salah satu pengenceran yang ditanam pada media tanpa obat. Hindari pendugaan
9. Inkubator
jumlah koloni pada permukaan media, kecuali sangat padat.

Skala pembacaan dapat dilihat pada tabel dibawah ini :
Pembacaan
Laporan
> 500 koloni

4 + ( konfluen)
200 500 koloni
3 + (hampir konfluen)
100 - 200 koloni
2+
20 100 koloni
1 + (hitung jumlah koloni)
1 19 koloni
Tulis jumlah koloni
Tidak tumbuh
Negatif
Jika jumlah koloni pada pengenceran 10-5 lebih dari 100, uji kepekaan harus diulang.
84

10. Inspisator
Bahan
1.
Aquades steril
2.
Media LJ
3.
Media LJ yang mengandung OAT dengan konsentrasi sbb:

a. Isoniazid (INH)
: 0.2 g/ml
b. Streptomycin
: 4 g/ml (bila menggunakan Dihydrosteptomycin,

konsentrasi harus sebanding dengan 4 mg/ml basa)
c. Rifampicin
: 40 g/ml
d. Ethambutol
: 2 g/ml

81
d.
Cara kerja :
1.
Siapkan suspensi kuman dengan konsentrasi 1 mg/ml atau Mc Farland 0.5-1.0
baru dan inokulasi pada botol media yang mengandung INH, kemudian
2.
Buat pengenceran 10-3 dan 10-5 dari suspensi kuman tersebut sebagai berikut:
ratakan inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan

botol perlahan-lahan
a.
Ambil 5 buah tabung reaksi steril
b.
Masing-masing tabung isi dengan 4.5 ml aquades steril
c.
Ambil 0.5 ml suspensi kuman konsentrasi 1 mg/ml
baru dan inokulasi pada botol media yang mengandung INH , kemudian
d.
Masukkan dalam tabung reaksi I dan campur dengan melakukan pemipetan
minimal 10 kali sampai homogen, sehingga dihasilkan larutan kuman
e.
pengenceran 10-1. Goyang-goyang tabung diantara pemipetan.

e.
f.
f.
g.
Larutan kuman pengenceran 10 :
4.
a.
Masukkan botol-botol tersebut dengan posisi horizontal dengan sudut

kemiringan 300 dalam incubator suhu 370C selama satu malam dengan tutup
longgar.
b.
Setelah inkubasi satu malam, perhatikan permukaan media harus sudah

kering, eratkan tutup botol dan tegakkan posisi botol.
Larutan kuman pengenceran 10-5 :

dalam tabung V, homogenisasi dengan pipet
5.
Lakukan pembacaan pertumbuhan koloni pada hari ke 28 dan 42 serta dicatat

dalam Tabel Pembacaan seperti terlampir
Inokulasi pada media tanpa OAT dan media dengan OAT sebagai berikut :
Siapkan 4 buah botol media LJ tanpa OAT dan media LJ mengandung OAT,
Catatan :
a Untuk menjamin hasil uji kepekaan yang baik,
pada tiap kali pengerjaan harus
2 botol untuk setiap jenis OAT.
disertakan kuman kontrol : H37RV yang peka terhadap semua OAT lini pertama,
Homogenkan suspensi dengan pemipetan. Ambil 100 l suspensi bacilli
Mycobacterium tuberculosis dengan tingkat resisten sedang terhadap streptomisin
pengenceran 10 , inokulasikan pada botol I dan II media tanpa OAT kemudian
dan rifampisin serta kuman Mycobacterium tuberculosis yang resisten sedang
terhadap isoniazid dan etambutol. Tidak dianjurkan memakai kuman kontrol yang
resisten terhadap isoniazid dan rifampisin. Usia kuman kontrol juga harus antara
-3
c.
Inkubasi dengan cara sebagai berikut :
Larutan kuman pengenceran 10-4 :
Ambil 0.5 ml larutan kuman pengenceran 10-4 dengan pipet baru, masukkan
b.
Tutuplah botol-botol tersebut agak longgar
-3
dalam tabung IV, homogenisasi dengan pipet
a.
yang
botol media yang mengandung Streptomycin
3.
untuk botol media
dalam tabung III, homogenisasi dengan pipet
h.
Lakukan hal yang sama pada butir d dan e
mengandung Rifampicin, botol media yang mengandung Ethambutol dan
g.
Ambil 100 l suspensi bacilli pengenceran 10-5 dengan menggunakan tip
Larutan kuman pengenceran 10 :

-2
dalam tabung II, homogenisasi dengan pipet
82
Ambil 100 l suspensi bacilli pengenceran 10-3 dengan menggunakan tip
Ambil 100 l suspensi bacilli pengenceran 10 dengan menggunakan tip

-5
2-3 minggu
baru dan inokulasi pada botol III dan IV media tanpa OAT, kemudian ratakan
b. Hindari kontaminasi silang. Jangan sampai batang pipetor menyentuh bibir tabung
inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan botol
berisi kuman. Ganti tip pipet setiap menginokulasikan tiap pengenceran dan tiap
perlahan-lahan
isolat. Dianjurkan menggunakan tip dengan stopper (komersial).


Selalu tutup
83
Hasil perhitungan koloni layak dilaporkan sebagai sensitif atau resisten jika :
Alat yang diperlukan :

1. Otoklaf
1. Jumlah koloni pada media tanpa obat pada pengenceran 10-3 dan 10-5
2. Botol Mc Cartney atau tabung bertutup ulir volume 10 ml
berbeda secara proporsional.
3. Glass beads
2. Jumlah koloni pada permukaan media dapat dihitung tepat.
4. Vortex mixer
3. Jumlah koloni minimal pada media tanpa obat adalah 5. Jika jumlahnya
5. Pipet 1 ml steril
kurang dari 5, hasil tidak dapat disimpulkan.
6. Cryo vial 2 ml steril
Untuk media tanpa obat, jumlah koloni berdasarkan prioritas sbb :
7. Ultra deep freezer ( -700C )
1. 20 100 koloni, jika tidak ada yang seperti ini, pilih yang ke 2
8. Biological Safety Cabinet II
2. 5 19 koloni
4. Untuk perhitungan, pakai jumlah koloni tertinggi, bukan jumlah rata-rata.
Cara kerja :
1. Suspensikan 100 gr bubuk susu skim dalam 1 liter PBS (volume dapat diperkecil
tergantung kebutuhan, tetapi perbandingan tetap seperti di atas) masukkan ke dalam
botol bertutup ulir, tutuplah botol jangan terlalu rapat
Catatan.
a. Koloni yang sangat kecil ( pin point ) pada media yang mengandung etambutol
atau streptomisin jangan diperhitungkan.
2. Sterilkan botol tersebut dalam otoklaf pada tekanan 15 lbs dan suhu 121 C selama
0
10 menit (jangan lebih dari 10 menit sebab akan terjadi caramel)

3. Setelah dingin tutup botol dikencangkan
4. Siapkan biakan Mycobacterium tuberculosis pada media LJ yang berumur 2 3
minggu
5. Kerok koloni tersebut dan masukkan ke dalam botol Mc Cartney yang telah berisi
larutan PBS steril dan glass beads secukupnya
6. Homogenkan dengan menggunakan vortex mixer selama + 30 detik
7. Diamkan selama minimal 15 menit supaya gelembung yang terbentuk dapat
mengendap. Sesuaikan kekeruhan suspensi kuman sama dengan Mc Farland 1.0
8. Pipet suspensi kuman tersebut sebanyak 0.5 ml dan masukkan dalam cryo vial yang
b. Jika jumlah koloni pada hari ke 28 dan ke 42 berbeda mencolok, hasil tidak boleh
disimpulkan. Uji kepekaan harus diulang
Perhitungan penetapan resistensi
Jumlah koloni pada permukaan media yang mengandung obat menandakan jumlah
kuman yang resisten. Jumlah koloni pada permukaan media yang mengandung obat
dibagi dengan jumlah koloni pada permukaan media yang tanpa obat akan menghasilkan
proporsi kuman yang resisten untuk galur tersebut. Jika proporsi kuman terhadap obat
tertentu dibawah 1 (satu) persen, maka kuman dinyatakan sensitif terhadap obat tersebut.
Jika proporsinya 1 % maka kuman dinyatakan resisten terhadap obat tersebut.
Untuk menilai proporsi kuman yang resisten, tetapkan angka tertinggi pada media tanpa
telah berisi 0.5 ml suspensi susu skim. Simpanlah sebanyak-banyaknya, minimal 50
obat, baik yang didapat pada hari ke 28 atau hari ke 42.
vial
Untuk media yang mengandung obat, pilih pengenceran yang menghasilkan jumlah
9. Simpan dalam ultra deep freezer. Kuman dapat bertahan puluhan tahun sepanjang
suhunya stabil. Ini merupakan generasi 1
10. Lakukan hal yang sama untuk mendapatkan generasi ke 2. Simpanlah lebih banyak
koloni antara 20-100 sebagai prioritas utama, jika tak ada pilih pengenceran dengan
jumlah koloni 5-19.
Berdasarkan kriteria diatas, proporsi dapat dihitung sbb ;
dari generasi 1
11. Untuk kuman kontrol, ambil dari vial generasi 2 dan lakukan subkultur bersamaan
dengan subkultur kuman yang akan ditentukan kepekaannya
88

Jumlah koloni pada media dengan obat

% resistensi =
X 100 %
Jumlah koloni pada media tanpa obat

85
Secara teoritis perbedaan jumlah koloni antara pengenceran 10-3 dan 10-5 adalah 100
Contoh 1 : pembacaan jumlah koloni hari ke 42

Suspensi (1mg/ml
107/ ml )
Pengenceran (estimasi
jumlah kuman per ml )
(106)
10-1
10-2
(105)
10-3
(104)
10-4
(103)
(102)
10-5
Proporsi resistensi
Media bebas
Obat
Obat/konsentrasi (mg/L)
S (4)
H (0.2) R (40)
E (2)
4+, 4+
4
+ 1
(>500)
3+
2+
36, 45*
45
0
<0.1%
12
27%
0
0.2%
20
44.4%
Hasil dilaporkan
kali. Jika dalam kenyataan, perbedaan itu terlalu jauh, hasil uji kepekaan seharusnya tak
dibaca. Pemeriksaan harus diulang
Contoh - 2 : pembacaan jumlah koloni hari ke 42
Suspensi (1mg/ml 107/ Media bebas obat
ml )
Pengenceran ( estimasi
jumlah kuman per ml )
(106)
10-1
10-2
(105)
10-3
10-4
(104)
(103)
* pilih angka tertinggi dari jumlah koloni pada media tanpa obat sebagai dasar
(102)
10-5
Proporsi resistensi
perhitungan.
Hasil dilaporkan
Obat/Konsentrasi (mg/L)
S (4)
H (0.2)
R (40)
E (2)
4+, 4+
4+ (>500) 1
30
2+
36, 45*
45
0
<0.1%
12
20
44.4%
Koloni yang dipakai dalam perhitungan pada tabel contoh diatas adalah :
H (12) pada 10-5; E (20) pada 10-5 & R (8) pada 10-3) dan S (1) pada 10-3).
Interpretasi untuk Isoniazid:
Jika dihitung maka tampak sebagai berikut :

Streptomycin
Isoniazid
Rifampicin
Ethambutol
:1/4,500
:12/45
: 8/4,500
: 20/45
x 100%
x 100%
x 100%
x 100%
Pada contoh ini kontradiksi terjadi pada interpretasi untuk isoniazid dan rifampisin.
= <0.1 %
= 27.0%
= 0.2%
= 44.4%
(Sensitif)
(Resisten)
(Sensitif)
(Resisten)
Hasil uji resistensi tidak selalu dapat dibaca sekali. Kadang-kadang perlu pengulangan
pengujian, yaitu pada keadaan :
a. Isoniazid:
12/45
27.0% (Resisten)
b. Isoniazid:
30/4500
0.07% (Sensitif)
Kondisi ini biasanya dapat timbul karena petugas kurang teliti atau kurang terampil
dalam homogenisasi inokulum.
K. Preservasi Kuman pada Suhu -70oC
Sub kultur kuman kontrol tidak boleh dilakukan terus menerus karena risiko mutasi
a.
Hasil pengujian pada kuman kontrol tidak sesuai
menjadi lebih besar. Sub kultur kuman kontrol paling banyak dilakukan tiga kali. Untuk
b.
Kriteria untuk pembacaan/interpretasi pertumbuhan pada media yang
mengatasi hal tersebut, kuman kontrol harus disimpan sebagai aliquot dalam jumlah
mengandung obat dan media yang tidak mengandung obat belum dicapai.
besar sehingga ketersediaannya terjamin. Preservasi juga mempunyai manfaat untuk
Jika terjadi perbedaan jumlah koloni yang terlalu besar pada duplo kontrol.
penelitian.
Misalnya lebih dari 10 kali
Bahan yang diperlukan :
Terjadi kontradiksi interpretasi (contoh 2)
1. Bubuk susu skim ( laboratory grade )
c.
d.
2. Aquades
86


87
8. NaOH adalah dekontaminan sekaligus mukolitik. Daya mukolitik maksimum pada

konsentrasi akhir 2%. Namun harus diingat bahwa pada konsentrasi tersebut,
NaOH juga berefek kurang baik untuk mycobacteria. Karena itu waktu paparan
terhadap NaOH harus sangat terkendali. Jika dengan konsentrasi 2%, cemaran
masih tinggi. naikkan konsentrasi akhir menjadi 3-4% dan jangan memanjangkan
waktu paparan. Seandainya cemaran dengan Pseudomonas aeruginosa tetap
menjadi masalah besar, gunakan cara dekontaminasi dengan asam oksalat
9. Untuk menilai kemampuan dekontaminasi reagen baru, lakukan dekontaminasi
pada 4-6 spesimen dahak dan tanam hasilnya pada agar darah. Reagensia yang
baik hanya menyebabkan pertumbuhan minimal dalam 24-48 jam. Angka cemaran
yang baik berkisar antara 3-5%. Lakukan analisa bulanan/tahunan
10. Jika tersedia, penambahan fraksi V bovine albumin 0.2 % dalam inokulum akan
memperkuat penempelan kuman pada media
11. Temperatur inkubator untuk isolasi Mycobacterium tuberculosis harus pada suhu
35-37oC. Idealnya mengngunakan inkubator CO2 dengan kadar 5-10%. Jika
menggunakan inkubator tersebut, tutup botol dapat dikendorkan untuk minggu
pertama dan setelah itu ditutup rapat untuk menghindari pengeringan.
12. Biakan baru dinyatakan negatif jika dalam 8 minggu tak ada pertumbuhan. Jika hasil
pemeriksaan mikroskopis dahak BTA positif, biakan dinyatakan negatif setelah 12
minggu tak ada pertumbuhan
13. Adanya serpentine cord formation pada pemeriksaan mikroskopik mengarah
pada Mycobacterium tuberculosis. Tetapi tidak boleh melakukan identifikasi hanya
berdasar temuan mikroskopik tersebut
Catatan :
a. Prosedur no 6-9 dilakukan dalam BSC
b. Kuman yang belum dipasasi merupakan generasi ke 0, dan yang disimpan
pertama kali merupakan generasi ke 1. Agar sifat kuman mencerminkan
generasi asalnya, kuman hanya dapat dipakai sampai generasi ke 3.
c. Suspensi susu skim dalam PBS dapat diganti dengan larutan steril gliserol
8% dalam larutan proteose pepton (Proteose peptone no 3 sebanyak 10g,
gliserol 80 ml dan aqubidestilata 1000 ml kemudian sterilkan)
L. Resusitasi Mycobacterium tuberculosis dari -70oC
Cara :
1. Ambil satu atau secukupnya tabung berisi kuman dari -70oC
2. Biarkan pada suhu ruang sampai mencair
3. Buka cryo vial, masukkan sengkelit steril (diameter 3 mm) tegak lurus sampai
dasar. Putar sengkelit beberapa kali perlahan-lahan. Tanam satu sengkelit pada
seluruh permukaan media LJ dengan jalan menggoreskannya. Alternatifnya,
homogenkan suspensi kuman dengan pipet dan tanamkan 0.1 ml pada seluruh
permukaan media LJ
4. Selanjutnya amati biakan seperti biasa. Pertumbuhan dalam 7 hari mencurigakan
cemaran. Konfirmasi dengan pewarnaan BTA, Gram dan penanaman pada agar
darah
Catatan :
Suhu yang sangat dingin dapat membakar kulit. Pakailah sarung tangan
Cryotube mengandung sangat banyak Mycobacterium tuberculosis. Berhatihatilah bekerja
Sisa suspensi kuman dapat dikembalikan ke dalam -70 oC. Makin sering keluarmasuk -70oC, viabilitas kuman makin menurun.
M. Pengiriman Isolat ke Laboratorium Rujukan
Pengiriman subkultur ke laboratorium dilakukan untuk tujuan mengidentifikasi isolat,
melakukan uji kepekaan dan uji silang dalam program pemantapan mutu (Quality
Assurance).
92


89
Jika menggunakan pesawat terbang, pegiriman subkultur harus mengikuti aturan IATA
(International Airline Transport Association). Secara umum sama dengan yang telah
dijelaskan pada bab Keamanan Kerja. Hal yang sama untuk metode pengiriman dengan
transportasi lain. Pada kondisi dengan fasilitas terbatas, pengiriman dahak dan subkultur
dapat dilakukan seperti di bawah ini:
Alat Yang Diperlukan
1. Wadah bahan infeksius (biohazard container) : box Styrofoam, pipa pralon
2. Bahan penyerap : kertas, tissue
3. Penahan guncangan : plastik, busa, gabus
CATATAN TAMBAHAN
1. Keberhasilan melakukan biakan sangat bergantung pada kualitas contoh uji yang
diterima. Memberikan informasi yang rinci dan mudah dimengerti merupakan salah
satu kunci keberhasilan pengumpulan dan pengiriman spesimen yang baik.
2. Idealnya contoh uji diharapkan sampai ke laboratorium dalam waktu 1 (satu) jam.
Jika tidak dapat sampai dalam waktu 1 jam, dinginkan, jangan bekukan spesimen.
Bila jarak tempuh ke laboratorium lebih dari 72 jam, maka contoh uji diawetkan
dengan CPC. Spesimen yang sudah ditambah dengan CPC atau darah tidak boleh
didinginkan. Untuk pembiakan pada MGIT dilarang menambahkan CPC, cukup
dikirim dalam keadaan dingin.
4. Kantong plastik bersegel

5. Formulir identitas isolat
6. Parafilm, lakban
7. Stiker : Biohazard, Fragile,
3. Spesimen yang diawetkan dengan CPC harus dikelola secara khusus sebelum
penanaman
4. Paparan kuman terhadap OAT dalam beberapa hari telah menyebabkan sebagian
kuman mati dan viabilitasnya rendah.
Cara kerja :
1. Tutup Botol Mc Cartney dengan rapat kemudian segel dengan parafilm. Masukkan
2 botol dari 1 pasien kedalam kantong plastik bersegel.
2. Bungkus tiap kantong plastik dengan kertas tissue agar jika terjadi bocoran, tidak
keluar dari wadah bahan infeksius
3. Catat identitas isolat yang akan dikirim pada Formulir
4. Masukkan kantong plastik yang berisi botol Mc Cartney ke dalam wadah bahan
infeksius.
5. Tutup wadah, rekatkan dengan lakban
6. Masukkan Formulir identitas isolat dalam amplop
6. Masukkan wadah bahan infeksius dan formulir ke dalam kotak karton sedemikian
rupa agar tidak terjadi guncangan, beri alamat yang dituju dan tempelkan stiker
yang diperlukan
5. Tidak ada satu metodepun yang ideal untuk semua spesimen. Pilihan cara
dekontaminasi tergantung pada jenis dan kondisi spesimen.
Prinsip umum dekontaminasi adalah menggunakan cara yang paling ringan dalam
membunuh mikroba. Toleransi kontaminasi 3% - 5% untuk media padat.
6. Untuk kebutuhan pemantapan mutu internal, sisa spesimen dapat disimpan pada
refrigerator sampai hasil pewarnaan BTA hasil pemekatan didapat atau dicurigai
timbulnya kontaminasi pada media. Spesimen tersebut masih dapat digunakan
dalam 7-10 hari
7. Dekontaminasi dengan Nacetyl cystein ( NALC ) dan NaOH sangat baik untuk dahak,
namun NALC sangat labil dan harus selalu dibuat segar. Hindari pengocokkan
NALC-NaOH yang berlebih karena NALC mudah teroksidasi oleh oksigen udara.
7. Kirim melalui expedisi atau kurir

N. Pengelolaan Limbah
Semua bahan/ alat yang telah atau dianggap tercemar harus disterilisasi sebelum
dibersihkan atau dibuang.
90


91
e. Pengambilan dan penanganan contoh uji dahak
Dahak yang diperiksa harus mukopurulen yaitu dahak yang mukoid

berwarna kuning kehijauan. Petugas harus dapat memotivasi pasien
agar dapat mengeluarkan dahak yang baik. Untuk lebih jelasnya, lihat
Uji kualitas dahak dilakukan dengan cara melihat warna dan kekentalan
adalah suatu sistem yang dirancang untuk meningkatkan dan menjamin mutu serta
dahak tanpa membuka tutup pot dahak, karena itu pot dahak harus
efisiensi pemeriksaan laboratorium secara berkesinambungan sehingga hasilnya dapat
terbuat dari bahan yang transparan dan bening.
dipercaya. Pemantapan mutu laboratorium tuberkulosis sangat diperlukan agar diagnosis
Periksalah kualitas spesimen dan beri catatan bila spesimen seperti
penyakit tuberkulosis melalui pemeriksaan biakan dan pemeriksaan uji kepekaan dapat
saliva. Laporan hasil harus mencantumkan bahwa spesimen diperkirakan
dipertanggung jawabkan mutunya.
harus melakukan pemeriksaan dengan memilih bagian yang paling kental

dan beri catatan bahwa spesimen tidak memenuhi syarat / air liur
Reagen dan Pewarnaan
Tujuan pemantapan mutu uji kepekaan laboratorium TB adalah :

a. Menjamin bahwa hasil pemeriksaan biakan dan uji kepekaan yang dilaporkan
oleh suatu laboratorium akurat dan terpercaya.
b. Mengidentifikasi berbagai tindakan yang berpotensi menimbulkan kesalahan.
c. Menjamin bahwa tindakan-tindakan perbaikan yang tepat telah dilakukan.
Catat tanggal kadaluarsa tiap bahan dan reagen, buat label di wadahnya.
Setiap komponen di dalam pemantapan mutu tidak berdiri sendiri tetapi merupakan
Semua wadah pewarnaan dan reagen sebaiknya menunjukkan tanggal
bagian yang tidak terpisahkan dan saling terkait satu sama lain. Laboratorium yang akan
penerimaan dan pembukaan pertama. Semua bahan yang tidak memenuhi
melakukan pemantapan mutu eksternal tanpa melakukan pemantapan mutu internal
syarat harus dicatat dan segera dibuang. Stok sebaiknya dibatasi untuk
dengan baik (mendeteksi terjadinya kesalahan secara dini) maka usaha tersebut akan sia-
waktu 6 bulan dan urutan penggunaan stok sebaiknya sesuai tanggal paling
sia. Demikian pula bila kedua komponen tersebut dilakukan tanpa disertai pelaksanaan
awal, untuk menghindari kadaluwarsa.
komponen peningkatan mutu sebagai upaya untuk penyelesaian masalah.
g. Uji Biokimia
Siapkan reagen untuk identifikasi dilengkapi dengan menggunakan kontrol
positif dan negatif. Gunakan wadah dengan volume kecil untuk menghindari
kontaminasi silang.
h. Air
Minimal air yang dipakai adalah aquabidestilata, pH 6.8-7.2 atau air yang
telah mengalami filtrasi partikel, de-ionisasi dan osmosis terbalik. Aqua pro
injeksi paling baik untuk dipakai
96
A. Tujuan Pemantapan Mutu
Buanglah wadah spesimen yang pecah atau bocor dengan diotoklaf dan
mintalah spesimen ulangan.
f.
berkesinambungan untuk meningkatkan reliabilitas, dan efisiensi pemeriksaan biakan

sebagai alat diagnostik dan pengelolaan pasien. Pemantapan mutu laboratorium
Bila dahak yang diperoleh tetap tidak memenuhi syarat, petugas lab tetap
Jaminan mutu untuk biakan TB merupakan suatu sistem yang disusun secara
pedoman pemeriksaan mikroskopis.
saliva, laporkan negatif dengan catatan.
VIII. PEMANTAPAN MUTU BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN

B. Komponen Pemantapan Mutu Laboratorium Tuberkulosis

Pemantapan
mutu
laboratorium tuberkulosis terdiri atas 3 komponen utama,
yaitu :
1. Pemantapan Mutu Internal (PMI) atau Internal Quality Control
Pemantapan mutu internal adalah suatu proses pemantauan yang terencana,
sistematik, dan efektif yang dilakukan oleh laboratorium itu sendiri untuk mendeteksi
adanya kesalahan dan menganalisis kesalahan yang terjadi.
93
Kunci keberhasilan pemantapan mutu internal adalah :
Pelatihan yang adekuat, motivasi dan komitmen petugas
Pelaksanaan prosedur/ SOP
Kemauan menerima dan memperbaiki kesalahan
Komunikasi efektif
buffer untuk pH 4.0 dan 7.0 sebelum digunakan.

3. Water bath : periksalah temperatur sebelum dan sesudah penggunaan.
Bersihkan setiap bulan dengan larutan sabun.
4. Almari Pendingin 20-80C : periksa temperatur setiap hari, tempatkan
termometer pada rak tengah, catat dalam buku PMI, bersihkan setiap
bulan. Lakukan defrost atau periksa bagian almari pendingin dan
Pemantapan Mutu Internal merupakan tanggung jawab petugas laboratorium yang
freezer setiap 3 bulan.
meliputi :
5. Freezer : periksa setiap hari, bersihkan setiap 6 bulan.
1. Tahap Pra Analitik
6. Alat-alat gelas : pastikan bahwa alat-alat gelas bebas dari detergen.
a. Tata Ruang dan Administrasi Laboratorium
Pastikan bahwa pintu laboratorium selalu tertutup. Area kerja, peralatan

dan bahan-bahan sebaiknya disusun sedemikian rupa sehingga
mendukung efisiensi alur kerja. Area kerja sebaiknya bebas debu. Meja
kerja/ bench/ kabinet sebaiknya dibersihkan setidaknya sekali sehari
dengan desinfektan (misalnya fenol 5%)
Jangan menggunakan
Setiap prosedur yang digunakan di laboratorium harus tercatat dan
minggu.
Pemeliharaan dan kalibrasi alat yang digunakan dalam laboratorium biakan
dan uji kepekaan dapat dilihat pada lampiran
c. Permintaan pemeriksaan
atau orang yang berwenang dan permintaan dengan lisan sebaiknya
supervisor/penanggung jawab laboratorium
tidak dilayani.
Semua dokumen hasil pemeriksaan tersimpan untuk 5 tahun.
Peralatan digunakan sesuai manual dan spesifikasi yang ditentukan
Pedoman penggunaan dan pemeliharaan semua alat harus tersedia dan

Peralatan harus dimonitor secara teratur agar tercapai akurasi alat dan
presisi yang tetap
dengan otoklaf. Salin ulang permintaan terlebih dahulu.
yang identitasnya tidak jelas dan kualitas tidak memenuhi syarat.
inkubator.
2. pH meter : Sesuaikan temperatur setiap penggunaan. Buatlah larutan
buffer setiap hari, buanglah bila sudah tidak terpakai. Standarkan

Catatlah tanggal dan jam pengambilan serta kedatangan spesimen di

laboratorium dan catatlah semua keterlambatan pengiriman pada formulir
hasil, terutama pada hasil biakan negatif atau terkontaminasi
beberapa tempat dalam inkubator dengan
menempatkan termometer di dalam kotak kayu. Kontrol lampu dalam
Periksalah bahwa data-data pada formulir permintaan pemeriksaan

sesuai dengan data pada label spesimen. Buanglah atau tolak spesimen
1. Incubator 35-370C: ukur temperatur setiap hari, sebaiknya pagi hari.

Ujilah temperatur di
Formulir permintaan pemeriksaan dipisahkan dari spesimen. Bila formulir

terkontaminasi spesimen, harus dilakukan dekontaminasi atau disterilkan
tersimpan
94
Pemeriksaan hanya dilakukan bila ada permintaan tertulis dari dokter
disimpan. Setiap perubahan prosedur harus dikonsultasikan pada
b. Peralatan laboratorium
alat gelas yang telah disterilkan lebih dari 3
d. Persiapan pasien
Memberikan bimbingan kepada pasien tentang cara pengumpulan dahak,

waktu pengumpulan dahak dan lokasi pengumpulan dahak. Lakukan
demonstrasi di depan pasien.

95
Recovery Rate yang baik
Semua dahak BTA pos seharusnya memberikan hasil pemeriksaan
i.
Media Biakan
Dianjurkan telur bebek yang bukan dari peternak besar.
biakan pos (>97%)

o
Sebanyak 20 - 30% dahak BTA neg dapat memberikan hasil biakan
Gunakan telur segar (kurang dari 7 hari) untuk penyiapan media LJ.
Periksa waktu koagulasi dan temperatur untuk pembuatan media telur.
pos
Buang media yang mengalami dekolorisasi, mengandung gelembung
2-3% dahak BTA pos memberikan hasil biakan negatif
atau tanda-tanda pemanasan berlebih.
Angka indikator di atas dihitung untuk contoh uji dahak dari suspek
Ciri-ciri umum media yang baik

o
saja, sehingga pencatatan untuk pasien suspek dan pasien follow up

sebaiknya dipisahkan
terjadi perbedaan warna berarti proses homogenisasi tidak baik
Buat analisa indikator di atas tiap tahun dan selama 3 tahunan.
atau adanya materi residu yang tertinggal dalam botol tsb. Warna
Untuk mempertahankan kemampuan petugas lab, minimal sebanyak
hijau yang lebih gelap disebabkan karena terlalu banyak malachite
5.000 pemeriksan biakan harus dilakukan per tahun.
green atau medium terlalu asam (pH rendah), sebaliknya warna

medium yang kekuningan disebabkan karena kualitas malachite
c. Pemantapan mutu/ indikator internal uji kepekaan

o
o
Gunakan isolat yang berumur tidak lebih dari 4 minggu (dianjurkan
green yang jelek atau medium yang terlalu basa/alkalis (pH tinggi)
2-3 minggu)
atau pemanasannya terlampau tinggi. Medium yang berbeda warna
Selalu sertakan kuman kontrol H37RV, Mycobacterium tuberculosis
tersebut sebaiknya segera dibuang.

o
yang resisten S dan H/R, Mycobacterium tuberculosis yang resisten
o
o
Bila temperatur inspisator terlalu rendah, medium dapat mudah luruh.
E dan R/H. Umur kuman kontrol harus sama dengan kuman yang
Cara memeriksa kualitas tekstur medium adalah dengan mengambil
akan diuji.
secara acak 1 atau 2 medium dan mengetukkannya pada telapak
Jika hasil uji kepekaan kuman kontrol tidak dapat dibaca, hasil uji
tangan 2-3 kali. Media yang telah cukup padat tidak akan luruh.
kepekaan isolat dari pasien tidak boleh dibaca.
Medium yang tidak cukup padat harus segera dibuang.

o
Selalu bekerja dengan mematuhi Petunjuk Teknis yang telah
Munculnya gelembung udara selama proses inspisasi disebabkan
diuraikan sebelumnya. Perhatian khusus saat homogenisasi
oleh temperatur inspisator terlalu tinggi. Tidak ratanya proses
inokulum dan pengenceran. Lakukan homogenisasi dengan baik
homogenisasi juga dapat menyebabkan terbentuknya gumpalan.
mulai saat penyiapan inokulum awal, selama proses pengenceran
Medium yang berwarna kuning dan mengandung gelembung udara
dan saat inokulasi.
tidak layak dipergunakan dan harus segera dibuang.

o
Simpan bubuk obat pada suhu yang sesuai dengan anjuran pabrik
Medium yang baik tidak kering. Adanya sedikit air dalam wadah media
bersangkutan. Bubuk obat harus selalu tertutup rapat, dianjurkan
merupakan hal baik. Jika jumlah air terlalu banyak, harus dibuang
untuk disimpan dalam desikator dengan gel silika di dalamnya.
secara aseptik. Adanya sedikit air akan mencegah pengeringan saat
Panaskan gel silika minimal 1 bulan sekali. Jangan menggunakan
media yang telah diinokulasi diinkubasi dalam keadaan tutup longgar.
obat yang telah lewat masa kadaluarsa atau telah bergumpalgumpal.
100
Pada batch yang sama harus mempunyai warna yang sama. Bila

Periksa sterilitas setiap batch dengan cara sebagai berikut:

97
Ambil sampel 5% -10 % dari jumlah tiap batch pembuatan. Inkubasi
terkontaminasi dan dievaluasi setiap bulan dengan standar kisaran
pada suhu 35 - 37 C selama 2 x 24 jam. Dapat juga dilakukan
3-5%. Kontaminasi < 3% mengindikasikan proses dekontaminasi
inkubasi semua media dalam 1 x 24 jam
terlalu kuat, berarti terlalu banyak tuberkel yang mati. Keterlambatan
Bila tidak tumbuh koloni, media dapat dipakai.
pengiriman spesimen dapat menyebabkan kontaminasi > 5%.
Bila tumbuh koloni, buang seluruh media dan buat yang baru.
Kontaminasi > 5% juga menunjukkan proses dekontaminasi terlalu
lemah. Dalam hal ini gunakan konsentrasi dekontaminasi lebih tinggi
Uji Kesuburan Media
tanpa memperpanjang waktu paparan. Pastikan bahwa seluruh
Untuk media tanpa obat, uji kesuburan media dapat dilakukan dengan
spesimen telah terdigesti sempurna untuk mengetahui penyebab
menggunakan M. fortuitum atau mycobacterium lain yang termasuk rapid
kontaminasi. Campurkan dengan benar isi tabung agar seluruh
grower dengan standar Mc Farland 0.5 - 1.0 pada pengenceran 10 -3.
spesimen terdekontaminasi.
Jika dalam waktu 5 (lima) hari tidak terdapat pertumbuhan M. fortuitum,

media dikategorikan tidak baik dan tidak layak dipakai. Pada media yang
e. Prosedur Biakan
baik akan tampak pertumbuhan yang cukup rapat.
ose/loop dan terapkanlah teknik aseptik
Penyimpanan media
Media dengan kualitas yang baik dilabel dan dicatat tanggal
Penempatan tabung tidak boleh menghalangi outlet udara dingin.

Jangan menggunakan media yang berumur lebih dari 4 minggu atau
media yang kering
2. Tahap Analitik.
a. Memastikan prosedur tetap di laksanakan dengan baik pada setiap
tinggi.
f.
Pengukuran turbiditas dengan menggunakan standar kepekatan kuman

menurut Mc Farland untuk inokulum. Gunakan kepekatan antara 0.5-1.0
skala Mc Farland.
Catatan:
1) Kontaminasi silang umumnya terjadi melalui aerosol yang mengendap
karena gaya gravitasi ke wadah lain, gagang pipet yang menyentuh
pemeriksaan
b. Menggunakan alat sesuai standar. Kelengkapan alat dapat dibuat dalam
bentuk daftar tilik.
c. Proses pengerjaan, dekontaminasi, inokulasi dilaksanakan sesuai
prosedur tetap
d. Digesti dan dekontaminasi
Pemrosesan spesimen dahak diurutkan, sesuai kapasitas sentrifus.

Gunakan semua rotor saat pemusingan.
98
Buatlah catatan persentase hasil biakan spesimen klinik yang

Perlu curiga pada spesimen-spesimen yang positif secara berturutturut atau biakan dengan beberapa koloni yang diikuti biakan positif
pembuatannya dan disimpan dalam refrigerator (5-8oC)

Penyimpanan dapat sampai 4 minggu tetapi tutup tabung harus rapat
Hindarkan kontaminasi silang biakan dengan penggunaan pipet atau
wadah tercemar.
3. Tahap Post analitik
a. Menjamin bahwa pelaksanaan tahap pasca analisis sesuai protap yaitu
pelaksanaan dekontaminasi alat dan bahan infeksius; pengelolaan limbah
infeksius dan non infeksius; dan pemeliharaan alat.
b. Indikator keberhasilan :
o
Angka kontaminasi di setiap laboratorium harus selalu terpantau.

Toleransi kontaminasi yang masih bisa diterima adalah 3% - 5% untuk
media padat.
99
d. Pelaporan.
o
Periksa kembali pencatatan dan pelaporan sesuai dengan standar.
Lakukan
pelaporan
biakan
dan
identifikasi
segera
setelah
mendapatkan hasil positif dan setelah hasil uji kepekaan selesai.

o
Untuk dahak dengan hasil BTA pos, hasil biakan negatif dapat
dilaporkan sampai dengan 8 minggu, sedangkan untuk dahak BTA
neg, sebaikya menunggu sampai 12 minggu.
2. Pemantapan Mutu External (PME) atau External Quality Assurance (EQA)

Pemantapan Mutu External (PME) atau External Quality Assurance (EQA) adalah
suatu proses yang terencana dan berkesinambungan yang dilakukan oleh laboratorium
pembanding untuk menilai mutu hasil pemeriksaan biakan dan uji kepekaan.
Jejaring laboratorium uji kepekaan terdiri atas lab supranasional dan lab nasional dan
laboratorium di Fasilitas pelayanan kesehatan lain yang mampu melaksanakan uji
kepekaan. Pemantapan mutu eksternal laboratorium uji kepekaan dilakukan secara
berjenjang ke laboratorium di bawahnya
Metode yang dipakai untuk melaksanakan pengkajian mutu eksternal uji kepekaan
Mycobacterium tuberculosis:
a. Tes panel (panel testing/ proficiency testing) yaitu pengiriman isolat dari laboratorium
rujukan untuk diperiksa dan diinterpretasi. Gunakan isolat yang benar-benar telah
terstandarisasi untuk panel, dianjurkan isolat dari WHO. Jumlah isolat minimal 30
dan terdiri dari berbagai pola kepekaan. Minta laboratorium yang diuji melakukan
upaya rutin dan bukan dengan upaya khusus.
b. Supervisi/ on site evaluation/ pembinaan yaitu pemantauan mutu dan bimbingan
teknis kegiatan laboratorium TB pada waktu kunjungan supervisor.
c. Uji Silang (cross check). Cara ini lebih jarang dipakai dibandingkan dengan panel.
3. Peningkatan mutu (Quality Improvement)
Peningkatan mutu atau quality improvement merupakan proses yang terus menerus
dilakukan oleh laboratorium dengan cara menganalisis setiap aspek dalam
pemeriksaan laboratorium dan sebagai tindak lanjut hasil supervisi dan tes panel.
104


101
Komponen kunci dalam proses ini meliputi pengumpulan data, analisis data dan
penyelesaian masalah secara kreatif dengan cara pemantauan yang terus menerus,
identifikasi masalah yang terjadi yang ditindaklanjuti dengan upaya perbaikan untuk
mencegah dan menghindari terulangnya kembali masalah yang sama.
Secara umum masalah dapat terjadi akibat faktor tunggal, namun umumnya
gabungan dari beberapa faktor diantaranya:
a. Kualitas bahan dasar dan bahan kerja (working dilution/ media) yang tidak baik.
b. Kualitas dan pemakaian alat yang tidak memenuhi syarat.
c. Kualitas dan kuantitas dahak dan pot dahak yang tidak memenuhi syarat.
d. Kurangnya keterampilan petugas.
e. Kepatuhan terhadap petunjuk teknis yang tidak konsisten.
f.
Kesalahan administrasi (transcription error) misalnya kesalahan penulisan dan

penyalinan.
IX. PENCATATAN DAN PELAPORAN

Laboratorium TB harus melakukan pencatatan dan pelaporan hasil biakan dan uji
kepekaan. Hal-hal yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :
1. Apabila hasil biakan terkontaminasi, harus segera dilaporkan dan perlu dilakukan
pemeriksaan spesimen ulang.
2. Apabila hasil biakan positif dan diidentifikasi sebagai Mycobacterium tuberculosis
segera dicatat dan dikirim hasilnya.
3. Tanggal tumbuhnya dan karakteristik koloni dari biakan positif dicatat pada
register laboratorium. Biakan negatif dan biakan yang terkontaminasi juga dicatat
berdasarkan tanggal pelaporan.
4. Hasil yang dilaporkan menurut kriteria kualitatif dan kuantitatif.
5. Harus ada kesesuaian antara nomor register laboratorium dengan nomor yang
ditulis pada tabung.
6. Laporan hasil menggunakan format standar sesuai program TB
7. Salinan laporan hasil akhir disimpan di laboratorium selama 2 tahun.
Catatan :
Supervisor laboratorium harus memahami semua aspek teknis laboratorium TB dan
setiap bulan memonitor pembuatan reagen, media, penanganan sampel, pencatatan
dan pelaporan. Misalnya catatan pembacaan pH larutan garam pada pembuatan media,
sterilisasi, dan monitoring temperatur alat.
Format laporan hasil seperti pada lampiran.
102


103
Lampiran 2. Tabel Penghitungan Hasil Uji Kepekaan
No Spesimen
OAT
Jml koloni
tertinggi dlm
media dengan
OAT
Estimasi/Jml
Proporsi
koloni tertinggi
(%)
dlm media
(c/d) x 100
tanpa OAT
HASIL
I
R
E
Ofl
Am
Kn
.
S
I
R
E
Ofl
Am
Kn
108


105
Lampiran 3. Form TB 05 MDR (Formulir permohonan lab TB MDR)

TB.05 MDR
PENANGGULANGAN TB NASIONAL
FORMULIR PERMOHONAN LABORATORIUM TB MDR UNTUK PEMERIKSAAN DAHAK

Nama RS Rujukan TB MD : ___________________________
No. Telp. : _______________________
Nama suspek/ pasien
: ___________________________
Umur
Jenis Kelamin
: Laki-laki
Alamat lengkap
:________________________________________________________________
________________________________________________________________
:____________________________
:____________________________
Kabupaten/ Kota
Propinsi
No. Identitas Sediaan (sesuai no.Reg Suspek di TB.06 MDR)
tahun
Alasan Pemeriksaan :
Diagnosis
///
Tgl. Pengambilan dahak terakhir
: ______________
Tanggal pengiriman sediaan
: ______________
Tanda tangan pengambil sediaan
: ______________
Jenis & Jumlah Pemeriksaan

BTA
x .
Perempuan
Follow up pengobatan :
Bulan ke :
Follow up pasca pengobatan :
Bulan ke :
Klasifikasi Penyakit
Paru
Biakan x ................
Extra Paru
Uji Kepekaan Lini 1
Lokasi :
No.Reg.TB MDR UPK
: ________
No.Reg.TB MDR Kab
: ________
Uji Kepekaan Lini 2
Secara visual dahak tampak
Uji cepat
Nanah lendir : S
Bercak darah : S
Air liur : S
HASIL PEMERIKSAAN LABORATORIUM

No. Register Lab. (sesuai dengan Formulir di TB.04 MDR) :
Spesimen dahak*)
Hasil BTA**)
Tanggal Hasil
+++
++
Tanggal Hasil
1-9***)
Neg
Hasil Biakan
M.TB
Neg
Sewaktu
Pagi
Spesimen dahak*)
Tanggal Hasil
Hasil Uji Kepekaan****

Lfx
Km Ofx
Cs
PAS
Cm
Eto
Sewaktu
Pagi
Tanda tangan pemeriksa
Mengetahui
Dokter PJ pemeriksaan
(.)
(.)
*)
Diisi sesuai dengan kode huruf sesuai identitas sediaan/

w aktu pengambilan dahak.
**) Beri tanda rumput pada hasil pemeriksaan/ tingkat positif yang sesuai.
***) Isi dengan jumlah BTA yang ditemukan
****) Diisi sesuai kode : R : resisten S : sensitif TD : Tidak dilakukan
Ke te rangan :
Nomor identitas sediaan terdiri dari 4 kelompok angka dan 1 huruf , sebagai berikut :
o Kelompok angka pertama terdiri dari 2 angka, misalnya 02 yang merupakan kode RS rujukan MDR
o Kelompok angka kedua terdiri dari 3 angka, misalnya 015 yang merupakan nomor urut suspek.
o Kelompok angka ketiga terdiri dari 2 angka, misalnya 10 yang merupakan kode bulan oktober.
o Kelompok angka keempat terdiri dari 2 angka, misalnya 08 yang merupakan kode untuk tahun 2008.
o Kode huruf :
- Penegakan diagnosis A = dahak sew aktu pertama, B = dahak pagi
- Follow up bulan ke 1, C
- Follow up bulan ke 2, D
- dan seterusnya sampai akhir pengobatan
o Contoh nomor identitas sediaan : 02/015/10/08 A, 02/015/10/08 B dan 02/015/10/08 C
106


107
No. Alat
Pemeliharaan
Suhu : setiap hari
Deep freezer200Cdan
-700C
Dilakukan oleh
Teknisi lab
Dihubungkan dengan alarm untuk mengetahui suhu

dan sirkulasi udara.
REKAPITULASI HASIL BIAKAN Mycobacterium tuberculosis
Bersihkan setiap 6 bulan

8
Inkubator
Lampiran 6. Rekapitulasi hasil biakan
Suhu: setiap hari
Teknisi lab
Nama Laboratorium
: ........
Provinsi
: .
Tahun
: .
Penanggungjawab
: .
Sterilitas/indikator biologi
9
Vortex
Frekuensi getaran : 1x/th
Lab. kalibrasi
10
Air Condition
Suhu, kelembaban,aliran udara: 1x/3 bulan
Teknisi AC
11
Refrigerator
Suhu: diukur dengan thermometer setiap hari ,

defrost setiap 3 bulan
Teknisi lab
12
Nefelometer
Tera Skala McFarland:1x/tahun
Teknisi Alat
13
pHmeter
Uji dengan larutan buffer stndar pH 4.0 dan 7.0

Dilakukan setiap akan digunakan
Triwulan Hasil BTA

Inokulasi
Hasil Biakan
Suspek, tidak dalam pengobatan
Kontaminasi Neg
TW 1
Pos
Total
Follow Up
Kontaminasi Neg
Pos
Total
Positif
Scanty
Negatif
Tidak Diketahui
Total
TW 2
Positif
Scanty
Negatif
Tidak Diketahui
Total
TW 3
Positif
Scanty
Negatif
Tidak Diketahui
Total
TW 4
Positif
Scanty
Negatif
Tidak Diketahui
Total
Total
112


109
Lampiran 7. Rekapitulasi Hasil Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis

KASUS
BARU
JML
%
PUTUS
OBAT
JML
%
GAGAL
JML
Lampiran 8. Tabel Pemeliharaan dan Kalibrasi Alat
KAMBUH
JML
No. Alat
Pemeliharaan
- Cek harian BSC meliputi :
BSC
Pastikan bahwa laju aliran udara yang melewati

bagian depan yang terbuka adalah 75 linier feet/
menit (22.86 meter/detik) untuk klas I dan 75
sampai 100 linier feet//menit (22.86 sampai 30.48
meter/detik) untuk kabinet klas II
Jumlah pemeriksaan
Sensitif dengan 4
macam obat
Resisten terhadap
Isoniazid (H)
- HEPA filter, tekanan udara : 1x/6 bulan
Rifampicin ( R )
- kecepatan aliran udara memakai anemometer
Ethambutol (E)
Teknisi
bersertifikat
- arah aliran udara dengan asap
Streptomycin (S)
- lampu UV : 1x/6 bulan, periksa dengan UV light

meter, diganti bila <70%
Monoresisten
Isoniazid (H)
Rifampicin ( R )
- kebocoran kabinet
Ethambutol (E)
- aliran listrik
Streptomycin (S)
- tes getaran
Multi Drug resistance
- tes kebisingan
H+R
H+R+E
Sentrifus
H+R+S
- Uji kecepatan dengan tachometer RPM : 1x/6

bulan
Teknisi lab.terlatih
- Tekanan udara : setiap hari
H+R+S+E
Kombinasi lain
- Suhu: setiap hari
H+E
Pipet
1x/tahun, volumetrik
H+S
Autoclave
tekanan, suhu : 1x/tahun
Lab,kalibrasi
Sterilitas: dengan spora strip : 1x/bulan
Teknisi lab.
H+E+S
R+E
R+S
Hot Air oven /

Inspisator
R+E+S
E+S
110
Dilakukan oleh

Analitycal balance
- Suhu: setiap hari
Lab.kalibrasi
Teknisi lab
- Bersihkan alat ini setelah selesai penyiapan

setiap batch media
Berat massa /tera: 1x/th
Metrologi

111
Lampiran 9.
FORMULIR PEMANTAPAN MUTU INTERNAL
Pembuatan Media TB (..)
No
Tangal
Pembuatan
Jenis
Media
Jumlah
(Volume)
Uji Sterilitas
(5%)
Hasil Uji
Keterangan

Paraf
113
114


Booklet JUKNIS Biakan OK PDF

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Booklet JUKNIS Biakan OK PDF

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Petunjuk Teknis

Pemeriksaan Biakan, Identifikasi, Dan

DIREKTORAT JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN

Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Idenfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium

DIREKTORAT JENDERAL PENGENDALIAN PENYAKIT DAN

terhadap Obat Anti TB merupakan

permasalahan yang harus segera ditanggulangi di Indonesia. Laporan global ke-3

Indonesia. Kementerian Kesehatan RI. Direktorat

menjamin mutu pemeriksaannya.

Jakarta, Desember 2011

dr. Supriyantoro, SpP, MARS

Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Idenfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium

Bina Upaya Kesehatan tentang petunjuk teknis pemeriksaan

Undang-Undang Nomor 29 Tahun 2004 tentang Praktik

Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 411/Menkes/Per/III/ 2010

Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 1144/Menkes/Per/ XI/2010

Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 1647/Menkes/SK/ XII/2005

Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 364/Menkes/SK/V/ 2009

Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 831/Menkes/SK/IX/ 2009

Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 835/Menkes/SK/IX/ 2009

Manajemen Terpadu Pengendalian TB Resisten Obat bertujuan untuk menemukan

Prof Dr. Tjandra Yoga Aditama

Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Idenfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium

Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Idenfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium

Prof. Dr. Agus Sjahrurachman, Sp.MK, PhD

- Dept. Mikrobiologi FKUI

Dra. Ning Rintiswati, MSc

- Bag. Mikrobiologi FK UGM

Dr. Tintin Gartinah, Sp.PK

- BLK Provinsi Jabar

Drs. Isak Solihin

- BLK Provinsi Jabar

Dr. Endang Woro, Sp.PK

Dr. Renaldi Panjaitan, Sp.MK

Dr. Endriyana Soerjat, Sp.PK

Dr. Koesprijanti, Sp.PK

KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN

Dr. I Wayan Diantika

- Subdit TB, Dit. P2ML

Dr. Irfan Ediyanto

- Subdit TB, Dit. P2ML

Dr. Retno Kusuma Dewi

- Subdit TB, Dit. P2ML

Dr. Sri Widyastuti

- Subdit MI, Dit. BPPM

Dr. A.W. Praptiwi

- Subdit MI, Dit. BPPM

Dr. Wiwi Ambarwati

- Subdit MI, Dit. BPPM

Agus Susanto, SKM

- Subdit MI, Dit. BPPM

Dr. Harini Janiar, Sp.PK

Roni Candra, S.Si, M.Biomed

bahwa penyakit Tuberkulosis merupakan penyakit menular

bahwa pelayanan laboratorium Tuberkulosis merupakan

bahwa peran laboratorium dalam menegakkan diagnosis dan

Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Idenfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium

bahwa berdasarkan pertimbangan sebagaimana dimaksud pada

Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Idenfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium

VI. ALUR KERJA BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN

: KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN

E. Subkultur Isolat Mycobacterium tuberculosis ..............................................63

J. Interpretasi Hasil Uji Kepekaan .......................................................................84