145

5. Laboratorium Imunologi Khusus Lantai 7

a. Alat Nefelometer BN ProsSpeC

Gambar 3.30 Alat Nefelometer BN ProsSpeC

1) Pengertian

Merupakan alat Nefolometer yang digunakan untuk

pemeriksaan imunologi.

2) Metode

Nefelometri

3) Prosedur kerja dan quality control

a) Kalibrasi

(1) Dimasukkan kalibrator ke alat analyzer

(2) Dijalankan kalibrasi sesuai SOP menggunakan alat

neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP 001

(3) Dilakukan kalibrasi setiap penggantian lot reagen, jika

pemeriksaan kontrol tidak masuk dalam rentang yang

ditentukan, dan setelah alat rusak diperbaiki.

 146

b) Kontrol

(1) Dimasukkan bahan control kea lat analyzer

(2) Dijalankan pemeriksaan control sesuai dengan SOP

penggunaan alat neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP

001

(3) Hasil kontrol harus masuk dalam rentang mean ± 2 SD

Pemeriksaan control harus dilakukan setiap hari sebelum

pemeriksaan sampel pasien.

c) Sampel

(1) Dimasukkan sampel kea lat analyzer

(2) Dijalankan pemeriksaan sesuai SOP penggunaan alat

neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP 001

(3) Hasil pemeriksaan sampel akan secara otomatis keluar dari

alat.

Gambar 3.31 Quality control salah satu pemeriksaan alat neflometer BN ProSpeC
 147

4) Pemeriksaan yang dilakukan

C3, C4, Faktor Rhematoid (RF), Anti-Streptolysin titer O

(ASTO), IgG, IgM, dan IgA.

a) Pemeriksaan kadar C4

(1) Tujuan Pemeriksaan

(a) Memberikan petunjuk mengenai pemeriksaan C4

menguunakan alat Nefelometer BN ProSpeC.

(b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur.

(c) Untuk penentuan kuantitatif faktor komplemen C4

dalam serum atau heparin atau plasma EDTA manusia.

(2) Prinsip

C4 yang terdapat dalam sampel bila ditambahkan

reagen yang mengandung antibody anti-C4 akan

membentuk kompleks antigen antibody. Bila cahaya

dilewatkan ke kompleks tersebut maka akan terjadi

pendaran cahaya. Intensitas pendaran cahaya sebanding

dengan kadar C4 dalam sampel

(3) Alat dan bahan

(a) Neflometer BN ProSpeC

(b) N antiserum to human C4 ( reagen )

(c) N protein standar SL ( kalibrator )

(d) N/T Protein control SL/L, M, H ( kontrol )

 148

(4) Sampel

(a) Jenis : Serum,plasma (Li heparin, K2-

EDTA )

(b) Jumlah : 1ml

(c) Stabilitas : 8 hari pada suhu 2-8oC 3 bulan

pada suhu -20oC

(5) Kemungkinan masalah dan penanganan

(a) Sampel dengan kadar > 190 mg/dl dilakuakn

pengenceran secara otomatis sesuai SOP penggunaan

alat neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP 001.

Hasil yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar

secara otomatis oleh alat

(b) Sampel dengan kadar < 6 mg/dl dilakukan pemekatan

secara otomatis sesuai SOP penggunaan alat

neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP 001. Hasil

yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar secara

otomatis oleh alat.

(6) Hasil : Kadar C4

(7) Nilai rujukan : 0,1-0,4 g/L

 149

b) Pemeriksaan kadar Imunoglobulin A (IgA)

(1) Tujuan Pemeriksaan

(a) Memberikan petunjuk mengenai pemeriksaan IgA

mengunakan alat Nefelometer BN ProSpeC

(b) Mengetahui kadar imunoglobulin A

(c) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur.

(2) Prinsip

IgA yang terdapat dalam sampel bila ditambahkan reagen

yang mengandung antibody anti- IgA akan membentuk

kompleks antigen antibody. Bila cahaya dilewatkan ke

kompleks tersebut maka akan terjadi pendaran cahaya.

Intensitas pendaran cahaya sebanding dengan kadar IgA

dalam sampel.

(3) Sampel

(a) Jenis : Serum,plasma (Li heparin, K2-

EDTA )

(b) Jumlah : 1ml

(c) Stabilitas : 5 hari pada suhu 2-8oC 3 bulan pada

suhu -20oC

(4) Alat dan bahan

(a) Neflometer BN ProSpeC

(b) N antiserum to human IgA ( reagen )

 150

(c) N protein standar SL ( kalibrator )

(d) N/T Protein control SL/L, M, H ( kontrol )

(5) Kemungkinan masalah dan penanganan

(a) Sampel dengan kadar > 800 mg/dl dilakuakn

pengenceran secara otomatis sesuai SOP penggunaan

alat neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP 001.

Hasil yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar

secara otomatis oleh alat

(b) Hasil yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar

secara otomatis oleh alat.

(6) Hasil : Kadar IgA

(7) Nilai rujukan : 70-400 mg/dL

c) Pemeriksaan kadar Imunoglobulin M (IgM)

(1) Tujuan Pemeriksaan

(a) Memberikan petunjuk mengenai pemeriksaan IgM

menguunakan alat Nefelometer BN ProSpeC

(b) Mengetahui kadar imunoglobulin M

(c) Untuk mengetahui adanya infeksi akut yang

menyerang tubuh

(d) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur.
 151

(2) Prinsip

IgM yang terdapat dalam sampel bila ditambahkan reagen

yang mengandung antibody anti- IgM akan membentuk

kompleks antigen antibody. Bila cahaya dilewatkan ke

kompleks tersebut maka akan terjadi pendaran cahaya.

Intensitas pendaran cahaya sebanding dengan kadar IgM

dalam sampel.

(3) Sampel

(a) Jenis : Serum,plasma (Li heparin, K2-EDTA )

(b) Jumlah : 1ml

(c) Stabilitas : 8 hari pada suhu 2-8oC 3 bulan pada suhu

-20oC

(4) Alat dan bahan

(a) Neflometer BN ProSpeC

(b) N antiserum to human IgM ( reagen )

(c) N protein standar SL ( kalibrator )

(d) N/T Protein control SL/L, M, H ( kontrol )

(5) Kemungkinan masalah dan penanganan

(a) Sampel dengan kadar > 640 mg/dl dilakuakn

pengenceran secara otomatis sesuai SOP penggunaan

alat neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP 001.

Hasil yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar

secara otomatis oleh alat

 152

(b) Sampel dengan kadar <20 mg/dl dilakukan pemekatan

secara otomatis sesuai SOP penggunaan alat

neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP 001. Hasil

yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar secara

otomatis oleh alat.

(6) Hasil : Kadar IgM

(7) Nilai rujukan : 40-230 mg/dL

d) Pemeriksaan kadar C3

(1) Tujuan

(a) Memberikan petunjuk mengenai pemeriksaan C3

menguunakan alat Nefelometer BN ProSpeC

(b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur.

(c) Untuk penentuan kuantitatif faktor komplemen C4

dalam serum atau heparin atau plasma EDTA manusia

(2) Prinsip

C3 yang terdapat dalam sampel bila ditambahkan reagen

yang mengandung antibody anti- C3 akan membentuk

kompleks antigen antibody. Bila cahaya dilewatkan ke

kompleks tersebut maka akan terjadi pendaran cahaya.

Intensitas pendaran cahaya sebanding dengan kadar C3

dalam sampel.
 153

(3) Sampel

(a) Jenis : Serum,plasma (Li heparin, K2-

EDTA )

(b) Jumlah : 1ml

(c) Stabilitas : 8 hari pada suhu 2-8oC 3 bulan pada

suhu -20oC

(4) Alat dan bahan

(a) Neflometer BN ProSpeC

(b) N antiserum to human C3 ( reagen )

(c) N protein standar SL ( kalibrator )

(d) N/T Protein control SL/L, M, H ( kontrol )

(5) Kemungkinan masalah dan penanganan

(a) Sampel dengan kadar > 410 mg/dl dilakuakn

pengenceran secara otomatis sesuai SOP penggunaan

alat neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP 001.

Hasil yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar

secara otomatis oleh alat

(b) Sampel dengan kadar <12 mg/dl dilakukan pemekatan

secara otomatis sesuai SOP penggunaan alat

neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP 001. Hasil

yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar secara

otomatis oleh alat.

(6) Interpretasi hasil: kadar C3

 154

(7) Nilai Normal : 0,9-1,8 g /L

e) Pemeriksaan kadar Imunoglobulin G (IgG)

(1) Tujuan

(a) Memberikan petunjuk mengenai pemeriksaan IgG

menggunakan alat Nefelometer BN ProSpeC

(b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur.

(c) Untuk mengetahui adanya infeksi kronis yang

menyerang tubuh

(d) Untuk mengetahui kadar IgG dalam tubuh

(2) Prinsip

IgG yang terdapat dalam sampel akan berpresipitasi bila

ditambahkan degan reagen yang mengandung anti-IgG

antiodi. Presipitasi ini menyebabkan kekeruhan yang dapat

diukur secara fotometrik pada panjang gelombang 340nm.

Tingkat kekeruhan sebanding dengan kadar IgG.

(3) Metode

Imunoturbidimetrik

(4) Sampel

(a) Jenis : Serum,plasma (Li heparin, K2-EDTA )

(b) Jumlah : 1ml

(c) Stabilitas : 4 bulan pada suhu 15-25oC,

 155

8 bulan pada suhu 2-8oC, -15 oC

dan -25 oC

(5) Alat dan bahan

(a) Neflometer BN ProSpeC

(b) R1TRIS buffer 20 mmol/L, Ph 8.0; NaCl 200mmol/L;

polietilen glikol: 3.6%

(c) R2 Anti-human IgG antibody: TRIS buffer 20 mmol/L,

Ph 8.0; NaCl 150mmol/L ( reagen )

(d) S1 H2O S2 c.f.a.s protein ( kalibrator )

(e) Precikontrol multi level 1 dan level 2 ( kontrol )

(6) Kemungkinan masalah dan penanganan

(a) Sampel dengan kadar > 4800 mg/dl dilakuakn

pengenceran secara otomatis sesuai SOP penggunaan

alat neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP 001.

Hasil yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar

secara otomatis oleh alat

(b) Hasil yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar

secara otomatis oleh alat.

(7) Interpretasi hasil: kadar IgG

(8) Nilai Normal : 700-1600 mg/dL

 156

f) Pemeriksaan kadar Anti Streptolysin titer O (ASTO)

(1) Tujuan

(a) Memberikan petunjuk mengenai pemeriksaan ASTO

menguunakan alat Nefelometer BN ProSpeC

(b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur.

(c) Untuk mengukur kadar antibodi terhadap streptolisin O

secara kualitatif atau semi kuantitatif.

(2) Prinsip

Sampel yang mengandung antibody anti streptolysin O

akan beraglutinasi dengan partikel lateksyang dilapisi

dengan antigen streptolysin O.

(3) Metode: Imunoturbidimetrik

(4) Sampel

(a) Jenis : Serum,plasma (Li heparin, K2-EDTA )

(b) Jumlah : 1ml

(c) Stabilitas : 11 hari pada suhu 15-25oC

2 hari pada suhu 2-8oC

6 bulan pada -15 oC dan -25 oC

(5) Alat dan bahan

(a) Neflometer BN ProSpeC

(b) R1TRIS buffer 170 mmol/L, pH 8.2

 157

(c) R2 buffer borat 10 mmol/L, pH 8.2; partikel lateks

yang dilapisi streptolysin 0.2 ml/L ( reagen )

(d) S1 H2O

(e) S2 c.f.a.s protein ( kalibrator )

(f) Precikontrol multi level 1 dan level 2 ( kontrol )

(6) Kemungkinan masalah dan penanganan

(a) Sampel dengan kadar > mg/dl dilakuakn pengenceran

secara otomatis sesuai SOP penggunaan alat

neflometer BN ProSpeC No. PK IM SOP 001. Hasil

yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar secara

otomatis oleh alat

(b) Hasil yang sudah dikalikan faktor pengenceran keluar

secara otomatis oleh alat.

(7) Interpretasi hasil: kadar ASTO

(8) Nilai Normal : < 200 IU/mL

g) Pemeriksaan RF (Faktor Rematoid)

(1) Tujuan

Untuk mengetahui kadar RF pada sampel

(2) Prinsip

Sampel yang mengandung RF akan membentuk

agregat dengan partikel polistiren yang dilapisi human

immunoglobulin dan anti-human IgG dari domba. Bila

cahaya dilewatkan ke agregat tersebut maka akan pendaran

 158

cahaya. Intensitas cahaya sebanding dengan kadar RF

yang ada di sampel.

(3) Bahan

Sampel (serum), Reagen RF, kalibrator

b. Alat Automatic Analyzer Elisa Chem Well 2910

Gambar 3. 32 Alat Automatic Analyzer Elisa Chem Well 2910

1) Pengertian

Merupakan alat otomatis untuk pemeriksaan imunoloserologi

2) Metode

Enzyme Immunosorbent Assay

3) Prosedur kerja dan quality control

a) Kalibrasi

(1) Dimasukkan kalibrator ke alat analyzer

(2) Dijalankan kalibrasi sesuai SOP menggunakan alat

Automatic Analyzer Elisa Chem Well 2910

 159

(3) Dilakukan kalibrasi setiap penggantian lot reagen, jika

pemeriksaan kontrol tidak masuk dalam rentang yang

ditentukan, dan setelah alat rusak diperbaiki.

b) Kontrol

(1) Dimasukkan bahan control kea lat analyzer

(2)Dijalankan pemeriksaan control sesuai dengan SOP

penggunaan alat Automatic Analyzer Elisa Chem Well

2910

(3)Hasil kontrol harus masuk dalam rentang mean ± 2 SD

Pemeriksaan control harus dilakukan setiap hari sebelum

pemeriksaan sampel pasien.

c) Sampel

(1) Dimasukkan sampel kea lat analyzer

(2) Dijalankan pemeriksaan sesuai SOP penggunaan alat

Automatic Analyzer Elisa Chem Well 2910

(3) Hasil pemeriksaan sampel akan secara otomatis keluar

dari alat.

4) Pemeriksaan yang dilakukan

Anti HSV IgG IgM I dan II, ACA (Anticardiolipin

antibaodies), da Beta 2 Glikoprotein IgG & IgM.

a) Pemeriksaan ACA (Anticardiolipin antibaodies) IgM dan IgG

(1) Tujuan
 160

(a) Untuk mengetahui kadar antibodi IgM dan IgG

terhadap kardiolipin dalam serum atau plasma

(b) Untuk mengetahui adanya sle komplikasi

(2) Metode

Enyme Linked Immunomsorbent assay (ELISA)

(3) Prinsip

Antibodi terhadap kardiolipin yang terdapat pada sampel

akan berikatan dengan antigen beta yang diletakkan pada

sumur polistiren. Kemudian ditambahkan konjugat yang

berisi anti-human IgM dan/atau IgG yang berlabel enzim

sehingga anti human IgM akan berikatan dengan

kompleks antigen antibody . kemudian ditambah substrat

kromogenik yang akan di pecah oleh enzim dan

menimbulkan perubahan warna yang serapanya di ukur

secara fotometrik. Intensitas warna yang terbentuk

sebanding dengan kadar ACA IgM dan/atau IgG.

(4) Alat

Mikropipet 5, 100, 200-300 dan 500 ml, Tip disposable,

Chem well 2910, Mikro elisa reader dan washer STAT

FAX 303+ nomor dokumen unit

(5) Bahan :

(a) Sampel (serum)

 161

(b) Plate mikrowell elisa polistiren dilapisi kardiolipin

yang telah dimurnikan

(c) ACA sampel diluent

(d) Konsentrasi PBS ACA yan di encerkan 20x

(e) Konjugat HRP IgM berisi antihuman IgM

(f) Kromogen TMB

(g) Diluen sampel ACA

(h) Kontrol

Kontrol ACA IgG positif, Kontrol ACA IgG Negatif,

Kontrol ACA IgM positif,Kontrol ACA IgM Negatif

(6) Langkah Kerja :

(a) Siapkan alat dan bahan

(b) Dipipet 1000µ𝑙 diluent sampel ke dalam tabung

(c) Tambahkan 10 µ𝑙 sampel ke dalam tabung tersebut,

lalu homogenkan menggunakan vortex

(d) Operasikan computer pada alat ChemWell

(e) Buka menu RUN, lalu klik New Job setelah itu isi

nomor lab pasien lalu pilih OK

(f) Pilih assay untuk melihat jumlah well yang

dibutuhkan

(g) Klik Types untuk melihat rincian well

(h) Klik Reagen Rack untuk melihat posisi reagen

 162

(i) Klik Sampel Rack untuk meletakkan sampel dan

control, catat posisi tabung pad arak sampel dan posisi

well yang akan digunakan

(j) Letakkan tabung yang sudah di vortex tadi di rak yang

tersedia dalam alat

Klik RUN

Klik START

Tunggu ±2 jam hingga hasil keluar.

Setelah 2 jam hasil akan keluar pada computer dan

dapat langsung di cetak.

(7) Interpretasi Hasil :

Pemeriksaan ACA IgM

<12,5 MPL Negative

12,5-20 MPL Indeterminate

20-60 MPL Low positive

>80 MPL High positive

Pemeriksaan ACA IgG

<15 GPL Negative

15-20 GPL Indeterminate

20-80 GPL Low positive

>80 GPL High positive

 163

b) Pemeriksaan Beta 2 Glikoprotein IgG & IgM

Pemeriksaan kadar antibodi IgG terhadap Beta 2

Glikoprotein I dalam serum.

(1) Tujuan:

(a) Memberi petunjuk pemeriksaan antibodi Beta 2 GP 1

IgG menggunakan alat chem well atau mikroelisa

reader STAT FAX 303+

(b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan

sesuai prosedur

(2) Metode

Enzyme Immunosorbent Assay

(3) Prinsip:

Antibodi terhadap Beta 2 GP 1 yang terdapat pada sampel

akan berikatan dengan antigen Beta 2 GP 1 yang

dilekatkan pada sumur polistiren. Sampel yang tidak

berikatan akan terbuang pada tahap pencucian. Kemudian

ditambahkan konjugat yang berisi anti-human IgG

berlabel enzim ke dalam tiap sumur. Setelah inkubasi

akan terbentuk kompleks antigen Beta 2 GP 1-antihuman

IgG berlabel enzim. Sesudah pencucian, ditambahkan

substrat kromogenik yang akan dipecah oleh enzim dan

menimbulkan perubahan warna yang diukur secara

 164

fotometrik. Intensitas warna yang terbentuk sebanding

dengan kadar Beta 2 GP 1.

(4) Sampel: Serum

(5) Reagen & Alat:

Reagen:

(a) Plate mikrowell ELISA polistiren dilapisi antigen

Beta 2 GP 1 yang telah dimurnikan

(b) Diluent sampel HRP

(c) Konsentrat wash HRP

(d) Konjugat HRP Ig M/Ig G berisi anti human IgG

(e) Kromogen TMB (tetramethyl benzidin)

(f) Stop solution HRP

(g) Kontrol:

Kontrol negatif Beta 2 GP 1 IgG

Kontrol positif Beta 2 GP 1 IgG

(h) Kalibrator:

Kalibrator A Beta 2 GP 1 IgG

Kalibrator B Beta 2 GP 1 IgG

Kalibrator C Beta 2 GP 1 IgG

Kalibrator D Beta 2 GP 1 IgG

Kalibrator E Beta 2 GP 1 IgG

(6) Langkah kerja dan quality control:

Kalibrasi
 165

(a) Masukkan Kalibrator A, B, C, D, E, masing-masing

sebanyak 200 µl ke dalam tabung eppendorf

(b) Letakkan tabung eppendorf A, B, C, D, E ke dalam

alat Chem Well sesuai dengan urutannya

(c) Catat posisi tabung pada rak sampel

(d) Jalankan pemeriksaan bersamaan dengan sampel.

Kontrol

(a) Siapkan tabung eppendorf dan label seuai dengan

bahan kontrol.

(b) Siapkan kontrol positif dan negatif, masukkan

masing-masing 200 µl ke dalam tabung eppendorf

yang sudah disiapkan.

(c) Letakkan tabung tersebut ke dalam alat Chem well.

Catat posisi tabung pada rak sampel. Jalankan

pemeriksaan bersamaan dengan sampel.

Sampel

(a) Buat pengenceran sampel dengan perbandingan 1:101

dengan cara menambahkan 5 µl sampel serum ke

dalam 500 µl diluent ke dalam tabung eppendorf.

(b) Campur rata menggunakan vortex

(c) Letakkan tabung tersebut ke dalam alat Chem well.

Catat posisi tabung pada rak sampel. Jalankan

 166

pemeriksaan sesuai dengan SPO penggunaan alat

chemwell 2910

(7) Interpretasi:

Hasil : Kadar antibodi GP I IgM

≤ 20 SGU Negatif

≥20 sgu Positif

Tabel 3.9 Interpretasi Hasil Pemeriksaan Beta 2 Glikoprotein IgG & IgM

Hasil Interpretasi

IgM (+), IgG (+) Antiphospholipid syndrome

IgM (+), IgG (-) Antiphospholipid syndrome

IgM (-), IgG (+) Antiphospholipid syndrome

IgM (-), IgG (-) Bukan Antiphospholipid syndrome

 167

c. Alat Sebia Hydrasys

Gambar 3.33 Alat Sebia Hydrasys

1) Pengertian

Merupakan alat yang digunakan untuk pemeriksaan imunofiksasi.

2) Metode

Imunopresipitasi / Imunofiksasi

3) Prinsip

Fraksi protein dipisahkan secara elektroforesis pada gel

kemudian antibodi nonspesifik diaplikasikan pada permukaan gel.

Protein yang sesuai dengan antibodi tersebut akan berikatan

membentuk kompleks antigen-antibodi yang tidak soluable dan

terfiksasi pada gel. Pada proses pencucian protein lain yang tidak
 168

bereaksi dengan antibodi dan sisa antibodi akan dihilangkan.

Untuk visualisasi pita presipitat ini diwarnai dengan pewarna

protein

4) Pemeriksaan yang dilakukan :

a) Pemeriksaan Imunofiksasi

Pemeriksaan untuk deteksi adanya imunoklonalitas dari

IgG, IgA, IgM, rantai dengan kappa dan rantai ringan lambda

pada serum atau urin.

(1) Tujuan:

(a) Memberikan petunjuk mengenai pemeriksaan

imunofiksasi menggunakan alat Sebia Hydrasys

(b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur.

(c) Untuk menentukan jenis imunoglobulin (antibodi) M-

protein yang tidak normal.

(2) Metode

Imunopresipitasi / Imunofiksasi

(3) Sampel:

Serum atau urin. Dengan jumlah 1 mL. Memiliki

stabilitas sampel 1 minggu pada suhu 2-8◦C, 6 bulan pada

suhu -20◦C

(4) Reagen:
 169

(a) Diluent Hydragel IF SEBIA

(b) Wash solution SEBIA

(c) Destaining solution SEBIA

(d) Antisera. Anti-ỿ heavy chain, Anti-α heavy chain, Anti-

µ heavy chain, Anti K light chain, Anti-À light chain

(e) Aquades

(f) Tanpa menggunakan kontrol

(5) Langkah Kerja dan quality control:

Proses kalibrasi dan kontrol tidak perlu dilakukan

Buat persiapan sampel:

(a) Untuk pemeriksaa IgG, 20 µl serum diencerkan dengan

100 µl diluent

(b) Untuk pemeriksaan elektroforesis dan immunoglobulin

lain, 30 µl serum diencerkan dengan 60 µl diluent.

(c) Masukkan 10 µl sampel yang telah diencerkan k dalam

sumur applicator.

(d) Letakkan applicator di dalam wet chamber

(e) Beri aquadest 100 µl pada tempat migrasi

(f) Siapkan gel, sebelumnya diserap dengan thin filter

paper

(g) Letakkan gel pada tempat migrasi

(h) Pasang buffered strip pada pins electrode carrier

 170

(i) Letakkan aplicator pada applicator carrier, kemudian

jalankan mesin.

(j) Angkat applicator beserta carriernya keudian buang

buffered strip

(k) Pasang application guide template

(l) Masukkan antisera ke dalam application guide

template sesuai warnanya

(m) Tutup chamber alat hydrasys dan jalankan

(n) Ambil combs filter paper, masukkan pada slot yang

ada pada reagen application template.

Jalankan alat:

(a) Lepaskan combs filter paper dari reagent application

template.

(b) Angkat reagent application template.

(c) Ambil thick filter paper, taruh di atas gel, tekan dan

gosok perlahan hingga rata.

(d) Jalankan alat

(e) Lepaskan thick filter paper.

(f) jalankan alat.

(g) Buka migrasi module, kemudian ambil gel

(h) Taruh gel di gel holder lalu masukkan ke dalam

staining module.
 171

(i) Pilih “IF acid violet” progam staining, kemudian

jalankan mesin.

(j) Setelah selesai, angkat gel dari gel holder.

(k) Hasil IF kemudian discan

(6) Interpretasi Hasil

Tabel 3.10 Interpretasi Hasil Pemeriksaan Imunofiksasi

Pola Interpretasi
Tidak ada komponen monoklonal
- Zona difus pada semua lajur - Tidak ada
- Zona gamma terwarna difus gelap tanpa monoklonalitas
ada pita khusus - hipergammaglobuline
mia
1 komponen monoklonal
- 1 pita monoclonal pada rantai berat (ỿ, α - Monoklonalitas
atau µ) dan 1 pita pada rantai ringan (K
atau )
- Bila hanya timbul raksi dengan anti-light - IgD atau IgE
chain antisera gammopathy
- Light-chain
gammopathy
2 atau lebih antisera lebih komponen
monoklonal
- 2 pita homogency ratai berat dan pita - Biclonal gammopathy
homogency pada rantai ringan - Oligoclonal
- Pita multiple pada 1 atau lebih rantai gammopathy
berat dan 1 atau 2 rantai ringan.
 172

d. Pemeriksaan HIV test II

Gambar 3.34 Incubator Shaker, Mikroplate Washer, dan Mikroplate Reader

Pemeriksaan HIV (Vironostika)

Pemeriksaan antibodi terhadap Human Immunodeficiency virus-

1 (HIV-1), HIV-2, dan HIV-1 group O, serta antigen p24 HIV-1

semikuantitatif dalam serum atau plasma.

1) Tujuan:

a) Memberikan petunjuk mengenai pemeriksaan HIV

menggunakan alat fotometer sunrise

b) Untuk mendeteksi reaktif dan non reaktifya virus HIV

c) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan secara baik

dan benar

2) Prinsip:

Anti-gp160 HIV-1, anti-ANT70 HIV-1, anti-env HIV-2, dan p24

HIV-1 yang ada sampel akan berikatan dengan antigen/antibodi

 173

spesifik pada sumur yakni gp160 HIV-1, ANT70 HIV-1, peptida

env HIV-2, dan anti p-24 HIV-1. Kemudian ditambahkan

konjugat berlabel horseradish peroxidase (HRP). Konjugat bebas

akan hilang selama pencucian. Kemudain ditambahkan substrat

kromogenik (TMB) sehingga menyebabkan perubahan warna.

Setelah ditambahkan asam sulfat untuk menghentikan reaksi,

terbentuk warna akhir kuning. Intensitas warna diukur secara

fotometrik pada panjang gelombang 450 nm.

3) Sampel:

Serum, plasma EDTA, plasma sitrat atau plasma heparin. Dengan

jumlah 3 ml. Stabilitas 1 minggu pada suhu 2-8◦c.

4) Alat & reagen:

Alat:

a) Mikropipet & tips

b) Vortex mixer

c) Clamp and rod

d) Incubator shaker

e) Mikroplate washer

f) Mikroplate reader / Mikroelisa Reader Sunrise

Reagen:

a) Mikroelisa strip plates

b) Diluent sampel

c) Konsentrat buffer fosfat

 174

d) Larutan TMB

e) Larutan peroksida urea

f) 1 mol/l asam sulfat

g) Kontrol:

(1) Kontrol negatif

(2) Kontrol positif Anti-HIV-1

(3) Kontrol positif Anti-HIV-2

(4) Kontrol positif p24 HIV-1

5) Langkah kerja dan quality control:

a) Siapkan alat, reagen, dan sampel

b) Tidak perlu dilakukan kalibrasi. Kontrol akan dilakukan

bersama dengan pemeriksaan sampel.

c) Masukkan 100 ul diluent sampel ke masing-masing well

d) Tambahkan 50 ul sampel / kontrol, sebagai berikut:

(1) Well 1,2,3 : kontrol negative

(2) Well 4 : Kontrol positif Anti-HIV-1

(3) Well 5 : Kontrol positif Anti-HIV-2

(4) Well 6 : Kontrol positif p24 HIV-1

(5) Well 7 dan seterusnya : sampel

e) Tutup well, inkubasi selama 1 jam pada suhu 37◦c di alat

incubator shaker.
 175

f) Lakukan pencucian sebanyak 5x dengan buffer fosfa. Buang

sisa cairan yang ada di atas/bawah microelisa strip dengan

kertas absorbans.

g) Tambahkan 100 ul substart TMB

h) Tutup well, inkubasi selama 30 menit pada suhu 15-30◦c

i) Tambahkan 100 ul asam sulfat 1 mol/L

j) Dalam 15 menit running di alat mikroplate reader sunrise

teca, baca absorbans pada panjang gelombag 450 nm.

k) Alat akan langsung menghitung cut off pemeriksaan saat itu.

e. Pemeriksaan HIV test III

Gambar 3.35 Alat Vidas PC dan stripnya

 176

Pemeriksaan HIV (Vidas HIV DUO ULTRA)

Pemeriksaan antibodi terhadap Human Immunodeficiency virus-

1 (HIV-1), HIV-2, dan antigen p24 HIV-1 semi kuantitatif dalam

serum atau plasma sebagai pemeriksaan HIV III pada sampel pasien

yang akan dilakukan pemeriksaan western blot..

1) Tujuan

a) Memberikan petunjuk mengenai pemeriksaan HIV VIDAS

DUO ULTRA menggunakan alat VIDAS.

b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan secara baik

dan benar.

2) Metode: Enzyme Link Fluorescent Assay (ELFA)

3) Prinsip:

Mengkombinasikan dua reaksi Enzyme immunoassay

dengan dua deteksi akhir fluoresen (ELFA). Solid Phase

Receptacle (SPR) berfungsi sebagai fase solid dan alat memipet

untuk pemeriksaan SPR dilapisi antibodi moniklonal anti p24,

gp160 HIV-1, HIV-1 grup O, dan peptida sintesis spesifik HIV-2

untuk deteksi antibodi anti-HIV-1 dan anti HIV-2

Sampel yang mengandung virus yang akan lisis dan

melepaskan protein akan berikatan dengan antibodi monoklonal

anti p24 atau anti HIV1 atau HIV-2 pada SPR dan akan dikenali

oleh antibodi anti p24 berlabel biotin. Kelebihan reagen akan

 177

dihilangkan dengan pencucian. Kompleks antigen antibody

tersebut akan ditambahkan dengan streptavidin berlabel alkali

fosfatase yang akan dilanjutkan dengan pemberian substrat 4-

metil-umbelliferyl phosphate. Substrat akan dipecah oleh enzim

dan fluoresensinya akan dibaca pada 450 nm. Intensitas

fluoresensi proporsional dengan kadar antibodi anti-HIV pada

sampel. Alat akan mengukur intensitas fluoresensi pada bagian

atas SFR, yang proporsional dengan konsentrasi antigen p24

HIV-1 pada sampel.

4) Sampel: Serum, plasma litium EDTA, plasma heparin

5) Reagen & Alat:

Reagen:

a) SPR

b) Strip

c) MLE (master lot data entry)

d) Kontrol:

C1 : Kontrol antibodi positif, berbentuk lyophillized

C2 : Kontrol negatif, berbentuk cairan

C3 : Kontrol antigen positif, berbentuk lyophillized

Alat :

a) Pipet dengan tip sekali pakai ukuran 2 ml dan 200

b) Mikroplate reader

c) Inkubator
 178

d) Autoplate microplate stripwasher

e) Mikroelisa Reader Sunrise

6) Langkah Kerja dan quality control:

Kontrol:

Dikerjakan bersama dengan pemeriksaan sampel

Melakukan pemeriksaan sampel:

a) Biarkan reagen / kontrol positif/kontrol/negatif hingga

mencapai suhu ruang

b) Bila diperlukan lakukan sentrifugasi sampel untuk

menjernihkan serum/plasma sampel

c) Vorteks standar, kontrol, sampel, untuk meningkatkan

reprodusibilitas hasil

d) Masukkan masing-masing 200 µl standar, kontrol, dan

sampel secara tepat ke dalam sumur sampel, yang berfungsi

sebagai cuvette reaksi.

e) Masukkan SPR dan strip ke dalam alat. Pastikan warna label

cocok dengan kode pemeriksaan pada SPR dan strip reagen.

f) Mulai pemeriksaan sesuai dengan petunjuk, seluruh langkah

pemeriksaan dilakukan secara otomatis oleh alat.

g) Pemeriksaan akan selesai dalam waktu sekitar 2 jam. Setelah

pemeriksaan selesai, keluarkan SPR dan strip dari alat

h) Kemungkinan masalah dan penanganan:

 179

RFV tinggi pada deteksi antibodi dapat menutupi hasil

antigen dan sebaliknya.

7) Interpretasi hasil:

Cut-off 0,25

Non reaktif : nilai < cut-off

Reaktif : nilai ≥ cut off

f. Pemeriksaan anti nuclear antibody (ANA)

Gambar 3.36 Mikroskop Fluoresens, Titer Plane dan Hasil Pola pada Pemeriksaan
ANA

Pemeriksaan anti nuclear antibody (ANA) semi-kuantitatif

dalam serum atau plasma.

1) Tujuan:
 180

a) Memberikan petunjuk mengenai pemeriksaan ANA

b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur.

c) Untuk mengetahui adanya sle

2) Metode:

Indirect Immunofluorescence

3) Prinsip:

Anti nuclear antibody yang terdapat dalam sampel akan

membentuk kompleks antigen-antibodi bila ditambahkan ke

dalam substrat yang dari sel Hep-20-10 dan jaringan hati primata.

Kompleks antigen-antibodi akan membentuk ikatan dengan anti

human antibodi berlabel fluoresens yang terdapat dalam

konjugat. Pola dan intensitas fluoresensi dianalisa dengan

menggunakan mikroskop fluoresens. Kemudian dilakukan

pengenceran sampel secara serial. Pengenceran tertinggi yang

masih menghasilkan pola fluoresensi dilaporkan sebagai titer

ANA pada sampel.

4) Sampel:

Serum, plasma (K3-EDTA, heparin dan Na-sitrat). Dengan

jumlah 1 mL. Stabilitas ampel yaitu 14 hari pada suhu 2-8◦C.

Sampel yang telah diencerkan harus sefera diperiksa.

5) Alat & Reagen:

Alat:
 181

a) Mikroskop fluoresense

b) Tabung reaksi kaca 3 mL

c) Pipet semiotomatis : 5 µl, 10 µl, 100 µl, 1000 µl.

d) Sample tray

e) Washing chamber

f) Kontrol:

Kontrol positif: Autoantibodi terhadap ANA, dengan

informasi titernya

Kontrol negatif: Autoantibodi negatif

6) Langkah kerja dan quality control:

a) Kalibrasi tidak dilakukan sedangkan kontrol dikerjakan

bersamaan dengan sampel

b) Persiapan

Sampel dan seluruh reagen harus dibiarkan mencapai suhu

ruangan sebelum digunakan.

Slide : jangan menyentuh BIOCHIPs.

PBS-Tween: 1 pak gram PBS dilarutka dalam 1 liter distilled

water dan dicampur dengan 2 mL tween 20. Campuran ini

dapat disimpan pada suhu 2-8◦C, bertahan 1 minggu. Bila

terjadi perubahan warna atau kekeruhan sebelum 1 minggu

harus diganti dengan larutan yang baru.

c) Pemeriksaan sampel:

(1) Buat pengenceran sampel

 182

1:100 = 1 mL buffer + 10 µl sampel

1:320 = 1600 µl buffer + 5 µl sampel

1:1000 = 1 mL buffer + 100 µl dari pengenceran 1/100

1:3200 = 1 mL buffer + 100 µl dari pengenceran 1/320

1:10000 = 1 mL buffer + 100 µl dari pengenceran 1/1000

(2) 30 µl sampel yang telah diencerkan, dimasukkan ke

dalam tray, hindari terjadinya gelembung. Tutup dengan

slide BIOCHIP

(3) Inkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan (18-25◦C)

(4) Slide diguyur secara merata dengan buffer, kemudian

rendam ke dalam washing chamber berisi buffer selama 5

menit

(5) Angkat slide, keringkan dengan kertas pengisap

(6) Ambil 25 µl konjugat, masukkan ke dalam tray, tutup

dengan slide yang telah dicuci

(7) Inkubasi selama 30 menit, hindarkan dari cahaya.

(8) Slide diguyur merata dengan buffer. Kemudian rendam

ke dalam washing chamber berisi buffer selama 5 menit.

(9) Angkat slide, keringkan dengan kertas penghisap

(10) Letakkan kaca penutup di atas sample tray tetesi dengan

gliserol.

(11) Tempelkan slide dengan permukaan menghadap ke kaca

penutup, analisa engan mikroskopfluoresens

 183

7) Interpretasi Hasil:

Tidak ada fluoresenses : negatif

Ada fluoresense : positif

Laporkan pola sesuai lampiran

Interpretasi titer:

Bandingkan intensitas sampel terhadap kontrol positif.

Intensitas fluorosensi kontrol positif adalah weak. Pelaporan titer

dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel 3.11 Interpretasi Titer pada Pemeriksaan ANA

FLOURESENSI TITER ANA

1/100 1/1000
WEAK NEGATIVE 1/100
STRONG NEGATIVE 1/320
STRONG WEAK 1/1000
STRONG MODERATE/STRONG ≥1/1000
 184

g. Pemeriksaan Limfosit Subset

Gambar 3.37 Alat CD4 Flowcytometri BD Facscalibur

1) Tujuan:

a) Memberikan petunjuk mengenai pemeriksaan limfosit subset

menggunakan alat BD FACSCalibur

b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur

c) Untuk mengetahui nilai Penghitungan relatif (persentase) dan

absolut limfosit subset yang terdiri dari limfosit T (CD3),

limfosit T helper (CD4), limfosit T sitotoksik (CD8), limfosit

B (CD19) dan sel NK (CD16+56) dalam darah.

2) Metode: Flow Cytometry

3) Prinsip:

Subset limfosit dipilah dan dihitung berdasarkan ekspresi

protein permukaan (CD) tertentu. Antibodi spesifik berlabel

fluorokrom dipakai untuk mendeteksi eskpresi protein tersebut

 185

dan akan melekat dipermukaan limfosit yang

mengekspresikannya. Zat fluokrom yang melabel antibodi akan

memancarkan fluoresensi pada saat melalui berkas sinar laser

pada alat flow cytometry dengan panjang gelombang tertentu.

Banyaknya fluoresensi yang terdeteksi oleh detektor dihitung

sebagai banyaknya sel yang mengekspresikan CD tersebut.

Jumlah subset limfosit sel absolut diperoleh dengan menghitung

jumlah relatif terhadap jumlah limfosit total.

4) Sampel:

Darah dengan antikoagulan EDTA

5) Reagen & Alat:

Reagen:

a) BD Tritest CD3 FITC/CD4 PE/CD45 PerCp

b) TriTest CD3 FITC/ CD8 PE/CD45 PerCp

c) TriTest CD3 FITC/ CD19 PE/CD45 PerCp

d) TriTest CD3 FITC/ CD16+45 PE/CD45 PerCp

e) FACS Lysing solution (10x), 100 ml

f) Reagent grade water

g) TruCount test tubes

h) Sheath fluid

i) Kalibrator

CaliBrite beads
 186

j) Kontrol

k) BD multicheck

Alat:

a) Vortex Mixer

b) Pipet semiotomatis

c) Flowsitometri FACSCalibur

6) Langkah kerja dan quality control :

Kalibrasi: Lihat prosedur alat FACSCalibur

Kontrol:

a) Jalankan sampel kontrol seperti prosedur pengerjaan sampel

b) Kurva CD45 vs SSC dinilai.

c) Populasi limfosit tampak terang, cluster dengan SSC rendah.

Monosit dan granulosit tampak sebagai kluster yang terpisah

Sampel:

a) Pewarnaan sampel:

(1) Siapkan 4 tabung TruCount beri nomor 1-4 dan dilabel

sesuai dengan identitas pasien. Masukkan 20 µl reagensia

ke dalam tabung sebagai berikut:

Tabung 1 : Tritest CD3/CD4/CD45

Tabung 2 : Tritest CD3/CD8/CD45

Tabung 3 : Tritest CD3/CD19/CD45

Tabung 4 : Tritest CD3/CD16+56/CD45

 187

(2) Tambahkan 50 µl darah EDTA yang sudah

dihomogenisasi ke dalam setiap tabung. Gunakan teknik

reverse pipetting.

(3) Tutup tabung dan campur dengan vortex. Inkubasi selama

15 menit pada raung gelap dengan suhu kamar (20-25◦C).

(4) Tambahkan 450 µl FACS Lysing solution 1x ke dalam

tiap tabung

(5) Tutup tabung dan vortex. Inkubasi selama 15 menit pada

ruang gelap dan suhu kamar (20-25◦C).

(6) Sampel siap dibaca.

(7) Jika pembacaan ditunda, bungkus tabung dengan

aluminium foil dan simpan pada lemari es 2-8◦C.

b) Flowcytometry

(1) Buka progam Multiset pada komputer

(2) Set alat dengan menjalankan Instrument Setting

(3) Pilih setting pembacaan : Lyse No Wash (LNW)

(4) Masukkan identitas pasien

(5) Tampilkan setting detector pada layar komputer untuk

mengatur tampilan sel

(6) Vorteks sampel pada kecepatan rendah

(7) Letakkan tabung sampel pada sample probe, dan letakkan

tuas di bawah tabung

(8) Tekan HIGH dan RUN

 188

(9) Klik ACQUIRE yang tampak di layar komputer jika pada

tampilan layar sel pada layar sudah sesuai

(10) Tunggu sampai alat selesai menghitung jumlah sel yang

diinginkan.

(11) Lakukan manual gatting untuk analisis

(12) Cetak hasil pemeriksaan

7) Interpretasi:

Dilaporkan dalam persentase sel positf per populasi limfosit

dan jumlah sel positif per mikroliter darah (hitung absolut).

Software multiset meghitung jumlah relatif dan absolut dari

populasi sel yang ditentukan secara otomatis.

 189

h. Pemeriksaan western blot HIV

Gambar 3.38 Auto Blot System MP diagnostic / Autoscan pro

Pemeriksaan terhadap HIV-1 dan HIV-2 kualitatif dalam serum

atau plasma

1) Tujuan:

a) Memberikan petunjuk langkah pemeriksaan Western Blot HIV

b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur

c) Sebagai uji konfirmasi penyakit HIV

2) Metode: Western Blot

3) Prinsip:

Strip nitroselulosa mengandung blotting berbagai protein

antigenik HIV-1 (dimurnikan parsial) yang telah dipisahkan

dengan elektroforesis, dan peptida sintetik HIV-2 spesifik pada

strip yang sama. Strip diinkubasi dengan serum / plasma / kontrol.

Bila terhadap antibodi pada HIV-1 dan peptida HIV-2 pada strip.
 190

Setelah pencucian untuk menghilangkan materi yang tidak terikat,

ditambahkan konjugat antihuman IgG berlabel alkaline fosfatase

dan substrat BCIP / NBT. Metode ini memiliki sensitivitas untuk

mendeteksi kadar antibodi spesifik terhadap HIV yang kecil.

4) Sampel:

Serum / Plasma EDTA / Plasma sitrat.

5) Reagen & Alat:

Reagen:

a) Strip nitroselulosa : mengandung lisat HIV-1, peptida HIV-2

spesifik dan pita kontrol serum

b) Stock buffer concentrate : Tris buffer dengan serum kambing

normal yang tidak aktif

c) Wash buffer concentrate : Tris dengan Tween 20

d) Konjugat : anti human IgG dari kambing yang dikonjugasi

dengan alkaline fosfatase

e) Substrat : larutan 2 bromo-2-chloro-3-indolyl-phosphate

(BCIP) dan nitroblue tetrazolium (NBT).

f) Blotting powder

g) Reagen grade water

h) KONTROL:

Kontrol non reaktif

Kontrol reaktif kuat

Kontrol reaktif lama

 191

Alat:

a) Incubation tray (masing-masing terdapat 9 parit).

b) Forcep

6) Penanganan

Persiapan reagen:

a) Dilueted wash buffer

Disiapkan dalam keadaan segar sebelum pemeriksaan.

Campur wash buffer concentrate : reagent grade water = 1 : 19

b) Blotting buffer

Disiapkan dalam keadaan segar sebelum pemeriksaan.

Campur stock buffer concentrate dengan reagent grade water =

1:9 →tambah 1 g blotting powder setiap 20 mL diluated stock

buffer → campur

c) Working conjugate solution

Disiapkan dalam keadaan segar sebelum pemeriksaan.

(1) Untuk rapid assay → campur konjugat dengan blotting

buffer 1:500

(2) Untuk overnight assay → campur konjugat dengan blotting

buffer 1:1000

d) Substrat solution

Dapat langsung dipakai

7) Langkah kerja

Kontrol : Dilakukan bersamaan dengan pemeriksaan sampel

 192

Sampel:

a) Masukkan 2 mL diluated wash buffer ke masing-masing parit.

b) Dengan menggunakan forcep, pindahkan strip dari tabung ke

dalam parit dengan nomor menghadap ke atas (termasuk strip

untuk kontrol)

c) Inkubasi strip selama 1-2 menit pada suhu ruang di atas

piringan digoyang (kecepatan 12-16 putaran/menit). Buang

buffer dengan aspirasi.

d) Tambahkan 2 Ml blotting buffer. Tambahkan 20 µl

serum/kontrol ke masing-masing parit.

e) Tutup tray dan inkubasi selama 30 menit pada suhu ruang di

piringan goyang.

f) Buang konjugat dengan aspirasi. Tambahkan substrat solution

pada tiap parit

g) Tutup tray dan inkubasi selama 15 menit pada suhu ruang di

piringan goyang

h) Buang substrat dengan aspirasi aspirasi dan cuci strip minimal

3 kali dengan reagen grade water untuk menghentikan reaksi.

i) Dengan forcep pindahkan strip ke atas tissue, tutup dengan

tissue lalu biarkan mengering.

8) Kemungkinan masalah dan penanganan

Hasil indeterminate diulang pemeriksaannya selama 1 bulan

kemudian.
 193

9) Interpretasi Hasil : pembacaan pita

Validitas : pita kontrol pada strip harus positif bila

tidak terbentuk pita. Hasil dinyatkan invalid.

Interpretasi hasil berdasarkan Association of state and

Territorial Public Health Laboratory Directors / Center. Disease

Control (ASTPHLD/CDC) 1989 yakni terdapat pita positif pada ≥

2 protein spesifik:

a) p24

b) gp41

c) gp120 atau 160

Tabel 3.12 Interpretasi Hasil Western Blot

Hasil Interpretasi

Tidak terdapat pita positif pada salah Negatif

satu protein spesifik
Terdapat pita positif pada salah satu Indeterminate
protein spesifik namun tidak
memenuhi kriteria positif
Terdapat pita positif hanya pada satu Indeterminate dan indikasi terdapat
protein spesifik namun tidak HIV-2
memenuhi kriteria positif dan pita
HIV-2 positif
Sesuai dengan kriteria positif Positif

Sesuai dengan kriteria positif pita Positif dan indikasi terdapat HIV-2
HIV-2 positif
 194

i. Alat Fotometer Tecan

Gambar 3.39 Fotometer Tecan

1) Pengertian

Merupakan alat otomatis untuk pemeriksaan yang

berdasarkan ELISA dengan panjang gelombang 450 nm

2) Metode

Enzyme linked immunosorbent assay

3) Pemeriksaan yang dilakukan

a) Pemeriksaan Anti ds-DNA

Pemeriksaan kadar autoantibodi terhadap double

stranded-DNA (ds-DNA) dalam serum atau plasma.

 195

(1) Tujuan:

(a) Memberikan petunjuk pemeriksaan ds-DNA

mengguakan mikroelisa reader Sunrise atau

mikroelisa reader STAT FAX 303+

(b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur.

(c) Membantu mediagnosis dan memantau penyakit lupus

(systemic lupus erythematosus/SLE)

(2) Metode

Enzyme linked immunosorbent assay

(3) Prinsip:

Imunoglobulin G terhadap ds-DNA yang terdapat

dalam sampel akan membentuk kompleks antigen-antibodi

bila dimasukkan ke dalam sumur yang telah dilekatkan ds-

DNA. Kompleks tersebut akan membentuk kompleks

sandwich bila ditambahkan anti IgG berlabel peroksidase.

Enzim akan memecahkan substrat yang ditambahkan

Tetramethylbenzidine/TMB sehingga terjadi perubahan

warna. Intensitas warna yang terjadi dapat diukur dengan

fotometer pada panjang gelombang 450 nm dan 630 nm.

Intensitas warna sebanding dengan kadar anti ds-DNA.

(4) Sampel:
 196

Serum, plasma EDTA dan plasma sitrat. Dengan

jumlah 1 ml. Stabilitas serum dan plasma 7 hari 2-8◦C, 3

bulan pada -20◦C.

(5) Alat & Reagen:

Alat:

(a) Tabung reaksi 3 ml

(b) Pipet semiotomatis 5 ul, 100ul, 1000 ul

(c) Mikroelisa reader sunrise

(d) Mikroelisa reader STAT FAX 303+

Reagen:

(a) Microplate yang dilapisi Ag

(b) Konjugat: anti IgG kelinci berlapisi peroksidase

(c) Sample buffer

(d) Wash buffer

(e) Larutan substrat kromogenik TMB/H2O2

(f) Stop solution (O,5 M asam sulfur)

(g) Kontrol:

Positif (IgG human)

Negatif (IgG human)

Kadar bahan kontrol tertera di leaflet yang

menyertai kit.

(h) Kalibrator:

Kalibrator 1 (800 IU/mL IgG human)

 197

Kalibrator 2 (100 IU/mL IgG human)

Kalibrator 3 (10 IU/mL IgG human)

(6) Langkah kerja:

(a) Siapkan alat, reagen, dan sampel

(b) Lakukan proses kalibrasi menggunakan kalibrator

1,2,3 dikerjakan bersamaan dengan pengerjaan sampel.

Kalibrasi dikerjakan setiap pergantian reagen.

(c) Kontrol positif dan negatif dikerjakan bersamaan

dengan pengerjaan sampel

(d) Masukkan 100 ul kalibrasi, kontrol positf dan sampel

pasien yang sudah diencerkan (sampel : diluent = 5 ul :

1 mL) ke dalam sumur. Inkubasi 30 menit pada suhu

kamar (18-25◦C).

(e) Kosongkan sumur dan cuci sebanyak 3x dengan 300

µL wash buffer pada tiap pencucian. Tiap kalinya

didiamkan 30-60 detik. Lalu buang semua sisa cairan

di well dengan cara membalik well menghadap ke

bawah dan meniriskannya di kertas penghisap.

(f) Pipetkan 100 µL konjugat pada sumur, inkubasi

selama 30 menit pada suhu kamar (18-25◦C).

Kosongkan well dan cuci sesuai prosedur b.

 198

(g) Pipetkan 100 µL substrat kromogenik pada well,

inkubasi 15 menit pada suhu kamar (18-25◦C), hindari

kontak langsung dengan sinar matahari.

(h) Pipetkan 100 µL stop solution pada well. Homogenkan

dengan cara menggoncang well, baca intensitas warna

dengan alat fotometer. Pada panjang gelombang 450

nm dalam waktu 30 menit sesudah penambahan stop

solution.

(i) Apabila hasil melebihi nilai kalibrator tertinggi, maka

dilakukan pengenceran

(7) Interpretasi Hasil

Kadar <100 IU/mL : negatif

Kadar ≥100 IU/mL : positif

j. Pemeriksaan TPHA (Treponema Pallidum Hamagglutination Assay)

Merupakan Pemeriksaan spesifik terhadap Treponema pallidum

semikuantitatif dalam serum.

1) Tujuan

a) Memberikan petunjuk mengenai TPHA

b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur.
 199

2) Prinsip

Eritrosit yang dilapisi oleh antigen Treponema pallidum strain

Nichol akan bereaksi dengan antibody spesifik yang ada

padaserum sehingga membentuk aglutinasi. Aglutinasi yang

terbentuk dideteksi secara visual.

3) Metode: Hemaglutinasi

4) Sampel

a) Jenis : Serum

b) Jumlah : 1ml

c) Stabilitas : 24 jam pada suhu 2-8oC

4 minggu pada -20 oC

5) Alat dan bahan

a) Microwell

b) Test cell : eritrosit avian yang dilapisi antigen Treponema

pallidum strain

c) kontrol cell : eritrosit avian yang tidak dilapisi antigen

Treponema pallidum strain

d) Dilluent buffer : Phosphate buffer saline pH 7.2

6) Cara kerja

Kontrol

Pemeriksaan kontrol positif dan negatif bersamaan dengan

pemeriksaan sampel

Sampel
 200

a) Pemeriksaan kualitatif (3 microwell sampel)

(1) Dikeluarkan kontrol/reagen dari lemari es dan tunggu

hingga mencapai suu ruang

(2) Sampel/kontrol negative dan positif diencerkan dengan

diluents buffer dengan pengenceran 1:20 yaitu;

masukkan 190ul diluents buffer pada sumur satu lalu

ditambahkan 10ul sampel/control postitif dan negative

(3) Dengan mikropipet aduk campuran pada sumur 1 lalu

pindahkan 25ul ke sumur 2 dan 3

(4) Di vortex botol test cells dan control cells, ditambahkan

75ul control cell pada sumur 2 dan 75ul test cell pada

sumur 3

(5) Digoyangkan plate untuk homogenisasi

(6) Di inkubasi selama 45-60 menit pada suhu kamar

(7) Dibaca hasil yang terlihat

b) Pemeriksaan metode kuantitatif

(1) Dipipet 25ul diluents buffer ke dalam sumur B sampai H

(2) Dpindahkan 25ul serum yang tela dincerkan 1:20 dari

test screening sumur A dan B

(3) Diambil 25ul serum yang telah diencerkan dari sumur B

dan secara serial diencerkan dari sumur B sampai H

(4) Dipastikan test cell dan control cell larut dengan

sempurna. Ditambahkan 75ul test cell ke sumur A

 201

sampai sumur H. Pengenceran serial ini akan

menghasilkan pengenceran 1/80 pada sumur A dan

pengenceran 1:10240 pada sumur H

(5) Digoyang plate perlahan untuk pemcampuran yang

sempurna

(6) Diinkubasi selama 45-60 menit

(7) Di baca hasil yang terlihat

7) Interpretasi hasil:

Gambar 3.40 Interpretasi Hasil Pemeriksaan TPHA

a) Hasil positif : dot / hemaglutinasi

b) Hasil negatif : non hem-aglutinasi

k. Pemeriksaan VDRL (Vederal Desease Research Laboratory)

1) Tujuan

Pemeriksaan yang digunakan untuk penetapan secara

kualitatif atau semi kuantitatif dalam mendeteksi adanya reagin,

 202

yaitu salah satu jenis antibodi yang terdapat dalam serum atau

plasma penderita syphilis.

2) Prinsip:

Antigen yang digunakan dalam kit ini adalah modifikasi

dari antigen VDRL yang mengandung mikro-partikel antigen

karbon untuk memperjelas pengamatan. Reagen yang terdapat

dalam spesimen penderita syphilis menyebabkan teradinya

flokulasi dari partikel karbon dalam suspensi RPR reagin.

Terjadinya aglutinasi ini bisa terlihat oleh mata telanjang sebagai

gumpalan-gumpalan berwara hitam yang mengambang ke

permukaan cairan berwarna abu-abu muda pada reaksi ini.

3) Reagen & Alat:

Reagen:

a) Suspensi RPR Carbon Antigen : suspensi kardiolipin yang

mengandung mikro-partikel karbon.

b) RPR Positif kontrol serum

c) RPR Negatif kontrol serum

Alat:

a) Botol penetes suspensi antigen dan jarum penetesnya

b) Kartu tempat reaksi

c) Pipet pengaduk

d) Rotator / shaker (100 rpm)

e) Larutan Salin 0,9 %

 203

f) Pipet 0,5 mL

4) Prosedur kerja:

Seluruh material yang akan digunakan sebaiknya dibiarkan

mencapai suhu ruang terlebih dahulu. Seluruh alat-alat yang

digunakan harus dalam keadaan bersih dan bebas residu seperti

deterge dan lemak. Prosedur pengetesan diulang untuk spesimen

yang akan di tes.

a) Uji Kualitatif

(1) Teteskan 1 tetes spesimen yang akan diuji pada

lingkaran di kartu reaksi yang tersedia. Gunakan pipet

yang berbeda untuk meneteskan spesimen yang berbeda.

(2) Teteskan juga masing-masing 1 tetes serum positif

kontrol dan serum negatif kotrol pada lingkaran lain di

kartu reaksi yang aka digunakan.

(3) Sebarkan spesimen memenuhi masing-masing lingkaran

dengan menggunakan sisi datar dari pipet pengaduk

yang disediakan. Gunakan pengaduk yang berbeda untuk

setiap spesimen untuk menghidari teradinya

kontaminasi.

(4) Kocok cairan suspensi antigen RPR sebelum digunakan.

Pasang jarum yang tersedia pada botol penetes suspensi

antigen. Kemudian pindahkan cairan suspensi antigen

dari dari botolnya ke dalam botol penetes dengan cara

 204

menyedot cairan itu melalui jarum yang terpasang pada

botol penetes (±16µl).

(5) Teteskan 1 tetes suspensi antigen dari botol penetes itu

ke masing-masing lingkaran yang berisi spesimen.

(6) Letakkan kartu reaksi pada rotator atau shaker pada

kecepatan 100 rpm selama 8 menit.

(7) Baca hasil tes segera di bawah cahaya terang.

b) Uji semi-kuantitatif

(1) Untuk setiap spesimen yang akan dites, teteskan 0,05 ml

larutan Salin 0,9% ke dalam lingkaran 2 sampai 5 pada

kartu reaksi. Jangan menyebarkan larutan salin ke dalam

ligkaran tes.

(2) Teteskan 0,05 ml spesimen yang akan diuji pada

lingkaran 1 di kartu reaksi.

(3) Teteskan juga 0,05 ml spesimen pada lingkaran 2 yang

sudah ada 0,05 ml larutan salin. Kemudian lakukan seri

pengenceran sampai lingkaran 5. Caranya dengan

mencampur rata larutan salin dan spesimen pada

lingkaran 2 itu dengan pipet, kemudian pindahkan 0,05

ml cairan ke dalam lingkaran 3 campur rata lagi, dan

pindahkan 0,05 ml ke dalam lingkaran 4, dan seterusnya

sampai lingkaran 5. Buang 0,05 ml dari lingkaran 5

setelah pengenceran berakhir. Hindari terjadinya

 205

gelembung-gelembung udara pada saat pengenceran

berlangsung.

(4) Sebarkan cairan dalam masing-masing lingkaran itu

dengan menggunakan ujung pipet pengaduk yang datar.

Mulailah dengan pengenceran terbesar (lingkaran 1).

(5) Kocok cairan dalam botol penetes yang sudah diisi

suspensi antigen RPR, kemudian teteskan 1 tetes

suspensi antigen (±16µl) ke masing-masing lingkaran

yang berisi spesimen itu.

(6) Letakkan kartu reaksi pada rotator atau shaker selama 8

menit pada kecepatan 100 rpm. Baca hasil tes ini selama

makroskopik di bawah cahaya terang.

5) Interpretasi Hasil:

a) Uji Kualitatif

(1) Hasil Negatif (non-reaktif) ditunjukkan dengan tidak

terjadinya flokulasi partikel-partikel karbon dalam

suspensi antigen. Cairan dalam lingkaran tes terlihat

berwarna abu-abu muda.

(2) Hasil Positif (reaktif) ditunjukkan dengan terjadinya

flokulasi partikel-partikel karbon dalam suspensi antigen

itu, yang terlihat sebagai gumpalan-gumpalan berwarna

hitam besar maupun kecil pada bagian tengah atau tepi

pada lingkaran tes. Hasil reaksi (positif) harus

 206

dikonfirmasikan dengan menguji kembali spesimen

secara kuantitatif.

b) Uji Semi-Kuantitatif

Tabel 3.13 Interpretasi Hasil Uji Semi Kuantitatif VDRL

1 2 3 4 5

Lingkaran 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16

Reaktif 1:2 R R N N N

Reaktif 1:4 R R R N N

Reaktif 1:8 R R R R N

Reaktif 1:16 R R R R R

Pengenceran terakhir yang masih menunjukkan: adanya

flokulasi menunjukkan titer daripada spesimen yang diuji

Jika pengenceran terakhir (Lingkaran 5) masih reaktif,

seri pengenceran harus diperpanjang sebagai berikut:

(1) Siapkan pengenceran 1:16 pada serum yang akan diuji

dengan mencampur rata 0,1 ml serum yang akan diuji
dengan mencampur rata 0,1 ml serum itu dan 1,5 ml
larutan salin 0,9%
(2) Pindahkan 0,05 ml serum yang sudah diencerkan 1:16
itu ke lingkaran pada kartu tes baru
Lanjutkan seri pengenceran pada lingkaran 2 sampai

sesuai prosedur yang sudah dijelaskan di atas (langkah

3 sampai 6).
 207

l. Pemeriksaan Anti Helicobacter Pylori

Gambar 3.41 Strip Anti Helicobacter Pylori

Pemeriksaan antibodi terhadap Helicobacter pylori kualitatif

dalam serum atau plasma.

1) Tujuan:

a) Memberikan petunjuk langkah pemeriksaan Helicobacter

pylori

b) Menjamin pemeriksaan laboratorium dilakukan sesuai

prosedur

2) Metode

Rapid Chromatography Immunoassay

3) Prinsip:

Antibodi terhadap Helicobacter pylori yang terdapat pada

sampel akan membentuk kompleks dengan anti-imunoglobulin

berlabel colloidal gold pada test card. Kompleks kemudian akan

berdifusi ke arah tes area dan bereaksi dengan antigen

Helicobacter pylori sehingga memberi warna pada pita tes area

 208

dan sisa bereaksi dengan antibodi pada area tersebut sehinga

memeberikan warna pada pita kontrol area.

4) Sampel:

Serum, plasma

5) Reagen & alat:

Reagen: Helicobacter pylori antibodi test card

Alat: dropper

6) Langkah kerja:

a) Buka bungkus foil dan ambil test card. Letakkan mendatar di

atas tempat yang kering

b) Teteskan 3 tetes sampel (dengan dropper) pada sampel well

c) Baca hasil 30 menit setelah penetesan sampel

Kemungkinan masalah dan penanganan:

Bila tidak terebentuk pita pada kontrol area, tes dinyatakan invalid

harus diulang dengan test card baru.

7) Interpretasi:

Positif : terbentuk 2 pita (masing-masing pada tes area dan

kontrol)

Negatif : terbentuk pita pada kontrol area tetapi tidak pada

test