Sartika Nurwenda

BKPM Garut
Jenis sample:
 Biopsi
 Amputasi: mengurangi ukuran
tulang, membelah tulang, membuang
kelebihan kulit dan jaringan ikat
disekitar lesi/tumor→proses fiksasi
lebih cepat
 Reseksi/spesimen pengganti: femoral
head, knee replacement surgery
 Fiksasi :
 buffer formalin 24-48 jam
 Alkohol formalin/ 70% etanol→ tetracycline
labeled-bone
 Fiksasi berbahan dasar alkohol tidak
direkomendasikan utk decalsifikasi yang
menggunakan asam krn akan menghambat
proses dekalsifikasi
 Fiksatif mengandung cloroform (carnoy’s)
dan merkuri (B5, zenker’s, Susa)→radio
opaque dan interpretasi tidak tepat
Dekalsifikasi:
 Menghilangkan kalsium inorganik dari
matriks kolagen organik, kartilago dan
jaringan sekitarnya
 Pemilihan agen dekalsifikasi tgt:
 Urgency
 Derajat mineralisasi
 Luasnya investigasi
 Pewarnaan yg diperlukan
 Apapaun jenis asam yang digunakan
walaupun dengan buffered→ efek buruk
terhadap pewarnaan
 Efek ini bertambah sejalan dengan kadar
asam (pH rendah) dan periode
dekalsifikasi
 Dekalsifikasi cepat→kromatin inti gagal
menyerap warna hematoksilin
 Efek dapat dikurangi dengan tes
decalsification endpoint, proses
penghilangan asam setelah dekalsifikasi,
penyesuaian prosedur pewarnaan
Faktor yang mempengaruhi proses dekalsifikasi:
 Konsentrasi zat dekalsifikasi
 Suhu
 suhu ideal 25° atau suhu ruangan 18-30°
 Agitasi
 Agitasi yang gentle didapatkan dengan rotasi
kecepatan rendah, menggoyang, mengaduk,
 Suspensi/penyangga→
 menghindari kontak satu jaringan dengan jaringan
lainnya
 kaset, tas kain, plastik yg dilubangi
Zat dekalsifikasi:
 Acid
 Strong inorganic acid:
○ aqueous nitric acid 5-10%
○ Digunakan untuk diagnosis cepat kurang dari 48 jam
○ Dekalsifikasi terjadi secara cepat, menyebabkan pembengkakan
jaringan, dan dapat merusak jaringan jika digunakan lebih dari 24-48
jam
 Weak organic acid:
○ Aquous formic acid,
○ formalin 10% - formic acid → digunakan sebagai fiksatif dan
dekalsifikasi terutama utk jaringan biopsi yang kecil atau needle
biopsi
○ Buffered formic acid→ digunakan utk semua jaringan terutama jika
diperlukan pemeriksaan IHC
 Chelating agent:
 Formalin EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)
 EDTA (aqueous) pH 7.0-7,4
 Lama (6-8 mg) kecuali biopsi tulang yg kecil bisa 1 mg dan tidak
merusak jaringan
 Dekalsifikasi paling bagus utk pewarnaan enzim dan pemeriksaan
elektron mikroskopis
Decalcification endpoint test:
 Menggunakan zat kimia
 calcium oxalate tes
 Bubble test
 Asam bereaksi dgn ca carbonat →carbon
dioksida = lapisan gelembung di permukaan
tulang
 Bersifat subjektif
 Calcium tulang sedikit→ bubble yang
terbentuk berukuran kecil
 radiography
Penanganan setelah dekalsifikasi
dekalsifikasi akan bereaksi dengan larutan
dehidrasi, maka diperlukan:
 Lithium carbonate
 5-10% aquous sodium bicarbonat beberapa jam
 70% alkohol selama 12-18 jam
 Dicuci dengan air selama 30 menit utk biopsi
kecil atau 1-4 jam utk tulang yang lebih besar
 Cryomicrotom→ cuci dengan air atau disimpan di
PBS yg mengandung 3-10% sucrose pada suhu
4ºC
prosessing
 embedding :
 plastic spt methyl methacrylate (MMA),
glycolmethacrylate, atau epon like plastic
 Parafin
 Mikrotom dan pisau
 Pisau disposible: cukup tajam dan
mengurangi “chatter”
Perwarnaan
 Dekalsifikasi asam terutama jika proses
dekalsifikasi berlangsung lama dan
menggunakan metoda pemanasan
>37ºC (microwave)→ hidrolisis protein
yang berlebihan
 Giemsa berwarna terlalu pink
 Pewarnaan DNA dgn Feulgen menjadi
negatif
Perwarnaan
 Asam membuat pewarnaan inti lebih pucat
 Pewarnaan inti lebih bagus dengan tehnik:
○ Mencelupkan ke larutan aqueous sodium
bicarbonat 4-5 % selama 10 menit-2 jam, dicuci
dengan air kemudian diwarnai dengan HE
○ Ehrlich’s haematoxylin eosin
 Pewarnaan kolagen→
○ Mikroskop cahaya: pewarnaan trichome
(Masson’s)
○ Mikroskop polarisasi :
 sirius red:amiloid
 Colloidin blue: serabut collagen
Prinsip
 Tujuan: mengeluarkan air dari jaringan dan
menggantikannya dengan medium tertentu
sehingga memiliki rigiditas tertentu yang dapat
dilakukan pemotongan tanpa kerusakan/distorsi
parenkim
 Faktor yang mempengaruhi:
 Agitasi: rotasi alat
 Suhu : tidak boleh melebihi 45ºC
 Viscositas:
○ Semakin rendah viskosityas → semakin cepat
○ Setiap larutan utk dehidrasi dan clearing memiliki
viskositas yg sama kecuali cedar wood oil.
○ Parafin memiliki viskositas paling rendah
 Vacum : tidak bleh melebihi 50,79kPa
Tahapan
 Fiksasi→ menstabilisasi dan mengeraskan
jaringan dengan perubahan sel yg minimal
 Dehidrasi→ menghilangkan air dan larutan
fiksatif dari jaringan
 Clearing → menghilangkan larutan dehidrasi,
membuat jaringan dapat menerima media
infiltrasi
 Infiltrating→ menyusupi jaringan dengan
media penyangga
 Embedding→ menanam jaringan dalam media
penyangga dan membuatnya menjadi padat
Tahapan prosesing satu hari satu malam

 Formalin 10% ……….1 jam…….38ºC

 Formalin 10% ……….1 jam…….38ºC
 Alkohol 50%/formalin 10% ……….1 jam…….38ºC
 Alkohol 70% ……….1 jam..… ….38ºC
 Alkohol 95% ……….1 jam..… ….38ºC
 Alkohol 95% ……….45 mnt… ….38ºC
 Alkohol 100% ……….1 jam…… .38ºC
 Alkohol 100% ……….45 mnt…...38ºC
 xylene ……….……….1 jam… ….38ºC
 xylene ………….…….30 mnt..… .38ºC
 parafin ……………….30 mnt…….60ºC
 parafin ……………….30 mnt…….60ºC
 parafin ……………….30 mnt…….60ºC
 parafin ……………….30 mnt…….60ºC
PENGOLAHAN JARINGAN
Dehidrasi
 Alkohol untuk menghilangkan air yang terdiri dari :
 Alkohol 70%, 80%, 90%, 100%
Penjernihan/clearing
 Membuang Alkohol untuk memudahkan menyusupnya parafin dengan
menggunakan : Aceton dan Benzol atau Xylol
Impregnasi (penyusupan parafin)
Cara Manual :
 Alkohol 95%, 100% .............................................................................. 30’
 Aceton 2x ...........................……………………………………………….. 30’
 Benzol 2x …............................………………………………………..…… 30’
 Parafin sampai tahap Embedding (penanaman)

 Cara Manual yang lain:

 Alkohol 70% .............................................................................................30’
 Alkohol 95% .............................................................................................30’
 Ethanol ….......................................................................................30’
 Ethanol Xilol ...........................................................................................30’
 Xilol ...........................................................................................30’
 Parafin sampai tahap Embedding (penanaman)
 QC: temperatur semua pemanas
parafin, water bath, dan prosesor
otomatis → dijaga, dipelihara dan
didokumentasi
 Lab histologi harus memiliki kebijakan
dan prosedur yang terstandar sehingga
menghasilkan sample yang berkualitas