PEMBUATAN

PREPARAT
IRISAN
FIKSASI, DEHIDRASI,
PENJERNIHAN
 Preparat/Sediaan
●
Adalah objek yang diamati dengan mikroskop.
●
Dapat berupa preparat kering atau basah yang berupa
sayatan atau tanpa sayatan.
●
Preparat awetan/kering merupakan objek yang sudah
diawetkan.
●
Preparat awetan dapat digunakan berkali-kali.
●
Preparat yg baik adalah preparat yg mampu
menggambarkan sel/jaringan layaknya ketika masih dlm
tubuh
●
Sel/jaringan akan mengalami kematian & kerusakan
ketika terlepas dr tubuh
Macam/Jenis Preparat
 Metode Irisan
• Metode pembuatan preparat dengan cara
membuat irisan dengan ketebalan tertentu
sehingga dpt teramati di bwh mikroskop
– Dengan tangan
– Dengan mikrotom
•
 Rangkaian Proses
1. Pengawetan (Fixation);
2. Dehidrasi (Dehydration);
3. Pembeningan/penjernihan (Clearing);
4. Pembenaman (Infiltration/Impregnation/Embedding);
5. Pengecoran (Blocking/Casting);
6. Pengirisan Jaringan (Sectioning);
7. Pewarnaan (Staining);
8. Perekatan (Mounting);
9. Pelabelan (Labelling)
 A. FIKSASI
• Tindakan yg dilakukan untuk membuat
sel/jaringan yg terlepas dr tubuh tidak
berubah
• Mrp suatu faktor utama keberhasilan dlm
pembuatan preparat
• Mekanisme kerja dari fiksasi pada
dasarnya adalah mengawetkan bentuk
sel dan organel sehingga mendekati
bentuk ketika masih di tubuh.
 Tujuan fiksasi
• Mempertahankan bentuk sel atau jaringan seperti
jaringan aslinya,
• Mencegah otolisis dengan menginaktifkan enzim-
enzim
• Menghambat pertumbuhan bakteri dan jamur
• Mengeraskan Sel dan Jaringan
• Pemadatan komponen di dalam sel atau jaringan
• Optical diferensiasi --> mengubah indeks bias
• Efek pewarnaan --> meningkatkan intensitas
warna/membuat kontras
• Menempelkan sel/jaringan
•
 Sifat-sifat fiksasi yang ideal
• Dapat menghentikan proses-proses
metabolisme dengan cepat untuk mencegah
terjadinya perubahan-perubahan postmortem
• Dapat masuk dengan cepat ke-dalam jaringan
• Mengawetkan dan mengeraskan protoplasma
• Tidak mengubah bentuk semula
• Menambah afinitas protoplasma terhadap zat
warna
 JENIS FIKSATIF
Fiksatif sederhana:

Fiksatif majemuk:
– L Bouin
– L. Zenker
– L Helly
– L. Carnoy
– L. Orth
 Jenis-jenis fiksatif
1.FORMALIN: larutan yang mengandung 40% b/v (=
40% b/b) formaldehida (yang merupakan gas) di dalam
air
– larutan 4% formaldehid = formalin 10%
– Ditambah garam = NBF
– dapat mempertahankan pH netral &
memiliki tekanan osmotik yang sama
dengan cairan ekstraseluler
– penetrasi cepat, cocok untuk spesimen
dengan ukuran yang besar atau kecil
• Untuk ukuran jaringan yang kecil (10 × 10
× 3 mm) fiksasi 12-24 jam
• Untuk spesimen yang lunak, misal otak
fiksasinya 2-6 minggu
• rasio volume adalah 1:20 dan dimensi
jaringan sebesar 3-4 mm
Netral Bufer Formalin 10%
1. Aquades: 900 ml
2. Formalin (37% formaldehide): 100 ml
3. Natrium diHidrogen Phospat (NaH2PO4): 4 gr
4. DiNatrium Hidrogen Phospat (Na2HPO4): 6.5 gram

pH campuran sebesar 7.2 – 7,4 (jika tdk tercapai mk

perbandingan NaH2PO4: Na2HPO4 = 1:1,625)
Jika pH terlalu basa maka bisa ditambahkan dengan
asam asetat sedikit demi sedikit hingga pH turun
 2. Larutan Bouin
●
berisi 10% formaldehida (25% formalin), asam asetat
0.9 M dan 0.04 M asam pikrat yang dilarutkan di
dalam air
●
Asam pikrat:
➢
menembus jaringan agak lambat,
➢
mengentalkan protein
➢
dapat menyebabkan penyusutan.
➢
menyebabkan jaringan menjadi berwarna kuning.
●
Penetrasi menggunakan larutan Bouin lebih cepat dp
NBF
●
Jika terlalu lama disimpan di dalam larutan Bouin
menyebabkan hidrolisis dan hilangnya DNA dan
RNA
●
Warna kuning dr asam pikrat dpt dihilangkan
dengan alkohol 70%, lithium karbonat atau pewarna
asam
Larutan Bouin
1. Asam pikrat 2,1% dalam aquades: 1500 ml
2. Formalin (37% formaldehide): 500 ml
3. Asam Asetat Glasial: 100 ml
 3. Alkohol 95-96%
●
Menyebabkan dehidrasi --> dapat menyebabkan
penyusutan sel karena akan menggantikan air di
dalam sel
●
sel menjadi lebih kuat merekat dengan kaca
sediaan
 4. Methanol absolut
●
digunakan untuk sediaan berbasis cairan
●
menghasilkan sediaan yang tidak begitu
menyusut jika dibanding dengan alkohol
95-96%.
 Pencucian Jaringan segar
• Jaringan segar sebelum difiksasi dapat
dicuci dengan garam normal atau larutan
buffer
– larutan garam normal mencegah terjadinya
perubahan osmotik atau plasmolitik
– larutan buffer selain bersifat seperti larutan
garam normal juga menjaga kesetimbangan
asam-basa protoplasma
• Larutan Garam Normal (salin)
– Garam NaCl : 7.5-8.0 g Garam
– Aquadest : 1 liter fisiologis
(NaCl 0.9%)
• Larutan Ringer
– Untuk hewan poikilotherm:
• NaCl : 8.0 g KCl : 0.2 g
• CaCl2 : 0.2 g Na2CO3 : 0.2 g
• Aquadest : 1 liter
– Untuk hewan homoiotherm
• NaCl : 9.0 g KCl : 0.42 g
• CaCl2 : 0.24 g K2CO3 : 0.20 g
• Aquadest : 1 liter
 B. DEHIDRASI
• Tujuan: mengeluarkan air dari
dalam jaringan dengan
menggunakan medium tertentu
yang dapat mengganti atau
mengisi tempat air di dalam
jaringna
• Medium tsb harus dapat
bercampur dengan zat penjernih
pada proses penjernihan dan
tidak boleh berlawanan dengan
kerja fiksatif
 Dehidrator
• Alkohol bertingkat (konsentrasinya dari
rendah ke tinggi)
• Biasanya dimulai dari 35%-50%-70%-
80%-90% dan kemudian alkohol absolut
• Dehidrasi dari alkohol 50% sampai 80%
tidak boleh berhenti
• Selain alkohol ada beberapa zat
dehidrator yaitu : dioxan, n-butyl alkohol dll
 PENJERNIHAN (CLEARING)
• Bahan penjernih yang umum dipakai: xilol, toluol,
benzol & kloroform
• Xylol dapat menggantikan alkohol dalam waktu
singkat sehingga lama penjernihan lebih cepat
• Perendaman terlalu lama (lebih 24 jam)
menyebabkan jaringan keras dan rapuh
• Toluol, chloroform dan minyak cedarwood bekerja
lambat sebagai penjernih
• Benzen (benzol) sangat baik karena sedikit sekali
pengkerutan, mudah masuk dalam jaringan dan
mudah menguap dalam inkubator parafin