PENGECATAN HISTOKIMIA

DAN IMUNOHISTOKIMIA
 Hematoxylin dan Eosin
• Paling banyak digunakan → rutin
• HE dapat menunjukkan sebagian besar
struktur histologi
• Dapat menunjukkan inti sel
• Variasi dalam hasil
• Hematein (oxidized hematoxylin) adalah zat warna
• Nucleus mengandung RNA dan DNA (bersifat asam)
• Hematoxylin mewarnai nuclei
• Afinitas hematein thd nuclei terkadang dinilai kurang bila tanpa
mordant.
– Mordant adalah penghubung haematoxyllin dan DNA
– Logam: Al, Fe, tungsten, molybdenum, lead
– Tipe mordant mempengaruhi tipe jaringan yang terwarnai dan hasil
akhir pewarnaan
• Klasifikasi didasarkan jenis mordant yg digunakan
– Al; Iron; Tungsten haematoxyllin, etc & tanpa mordant
• Natural ripening vs artificial ripening
• Artificial ripening: penggunaan mordant (Al, Fe, atau
Pb)
• Warna pertama adalah merah gelap, menjadi biru
(blueing) bila diperlakukan dgn alkali lemah (air kran
atau lithium carbonate)
• Methods are
– regressive
– Progressive causing pale nuclei or colour cytoplasm
– Counterstain (IHC)
 Hematoxylin
• Penggunaan
– Pewarnaan Nuclei
– Struktur selain nuclei
• Jenis formula hematoxylin untuk pewarnaan nuclei
1. Dellafield (1885)
2. Ehrlich (1886)
3. Heidenhains (1896)
4. Harris (1900)
5. Mayer (1903)
6. Weigert (1904)
7. Carazzi (1911)
8. Cole (1943)
 Haematoxyllin Mixtures
• Connective tissue
– Mallory phosphotungstic acid haematoxyllin
• Elastic fibers
– Verhoeff’s method
• Myelin
– Kultschitzky
– Loyez
– Spielmeyer
– Weigert
• Copper and lead
– Mallory
– Parker
• Mucin
– Mayer’s mucihematein
 PEWARNAAN (STAINING)
• Formula Hematoxylin Mayer
– Haematoxylin kristal 1 gr
– Akuades 1000 ml
– Sodium Iodate 0,2 gr
– Ammonium/potassium alum 50 gr
– Citric acid 1 gr
– Chloral hydrate 50 gr
• Cara pembuatan Hematoxylin Mayer
– Larutkan ammonium/potassium alum di dalam akuades.
– Tambahkan hematoxylin dan campurkan secara baik (aduk).
– Tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate.
– Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik.
– Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya.
 Eosin
• Zat warna xanthene
• Ikatan Van der Waals
• Paling cocok dikombinasikan dgn alum haematoxyllin
• Memiliki nilai kemampuan differensiasi sendiri untuk
membedakan antara sitoplasma dari tipe sel dan serabut
jaringan ikat yang berbeda
• Differensiasi terjadi selama dehidrasi oleh alkohol
• Jenis eosin
– Eosin Y (yellowish), water soluble
– Eosin B (Bluish)
– Ethyl Eosin (eosin S, eosin alkohol absolut)
 Eosin Y
• water soluble
• Paling banyak digunakan
• Zat warna asam sehingga berikatan dgn protein (basa)
• Dapat berpenetrasi pada struktur padat dan bersifat
metakromatik
• Terdapat dalam 2 bentuk
– Monomer: merah
– Dimer : oranye-merah
• Hasil pewarnaan
– Sitoplasma: merah
– Eritrosit : oranye-merah
– Nukleus piknotik: ungu
– Nucleolus: merah
 Eosin
• Formula Eosin
– Eosin-alkohol Stok 1%
– Eosin y ws 1 gr
– Distilled water 20 ml
– Larutkan dan tambahkan alkohol 95% 80 ml
• Working Eosin Solution
– Eosin-alkohol stok 1 bagian
– Alkohol 80% 3 bagian
– Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat
glasial 0,5 ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik.
 Acid Alcohol Rinse
• Mengurangi warna biru hematoxyllin (to
differentiate nuclear staining)
• 0.25 % acid rinse
– Akuades 975 ml
– HCl 25 ml
• HCl 1% dalam alkohol 70% (v/v)
 Blueing
• Air kran (yang alkalis)
– Jakarta: pH air kran adalah 7.8
• Lithium carbonate
– Lithium carbonate……………….... 0,5 gr
– Akuades……………………………… 1000 ml
– Campurkan dengan baik.
 HE
• Pewarnaan Hematoxylin-Eosin
• - Deparafinasi dengan xylene
• - Kelebihan xylene diisap dengan kertas filter melalui tepi gelas
benda.
• - Celup sebentar dalam alkohol 96%, kemudian 80%, 70%, 50%,
30%, aquadest.
• - Masukkan kedalam larutan Hematoxylin dengan waktu tertentu : 3-
7 detik.
• - Air mengalir : 10 menit. Cuci aquadest sebentar.
• - Masukkan sebentar saja berturut-turut mulai dari alkohol 30%, 50%,
70%.
• - Kemudian kedalam larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%) 1-3
menit.
• - Dari larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%)
selanjutnya berturut-turut masukkan ke alkohol
70%, 80%, 96%, alkohol absolut, masing-masing
sebentar saja.
• - Masukkan xylene ± 10 menit (xylene berfungsi
untukl mengantar ke canada balsam juga
berfungsi untuk menjernihkan jaringan yang
sudah terpulas).
• - Jaringan ditutup dengan gelas penutup setelah
ditetesi dengan Canada balsam terlebih dahulu
 MACAM PENGECATAN
HISTOKIMIA LAIN
• PAS ( Periodic acid schiff )
Fix : formalin
Tech : 5 mikron ( utk ginjal 2-3 mikron )
Diastase/Karbo Hidrat positip
Hasil : Pas +  merah
Inti  ungu
 Histochemistry
Examples of Histochemical Methods:
Saccharides
• Saccharides can be detect by PAS
reaction (periodic acid-Schiff)
• it is based on oxidative action of periodic
acid (HIO4) → aldehyde groups
• these aldehyde groups react with Schiff’s
reagent (as in Feulgen’s reaction)
• → a new compound with a purple colour
(PAS-positive substances)
 Histochemistry
Examples of Histochemical Methods:
Saccharides
• PAS-positive substances are:
– polysaccharides (glycogen)
– glycosaminoglycans /mucopolysaccharides/
(hyaluronic acid, chondroitin sulphate)
– proteoglycans
– glycoproteins (thyreoglobulin, collagen)
– glycolipids (lipofuscin)
• Clinical application:
– biopsies of tissues from patients with diseases that
store glycogen (glycogenosis), glycosaminoglycans
(mucopolysaccharidosis)...
• Prinsip :
Setelah pengecatan karbohidrat dipecah oleh periodic acid
menjadi aldehid dan aldehid bereaksi dengan reagen Schiff
membentuk warna merah.
• Reagen :
Asam Periodat 0,5% dan Schiff (100 ml)
• Reagen Schiff :
1 gr Basic Fuchsin dilarutkan dalam 200 cc aquades panas,
dinginkan 50OC. Tambah bubuk padat sodium metabisulfid 2 gr,
kocok sampai rata. Tambahkan HCl 10 cc, diamkan pada suhu
kamar yang gelap 24 jam. Setelah itu tambah norit 0,5 gr kocok
sampai rata (merah jadi hitam), pada pemakaian disaring hingga
jernih.
 SUDAN BLACK
• Zat warna Sudan Black memberi warna hitam kepada
granula dalam leukosit yang mengandung zat lemak. Antara
sudanofilia dan reaksi peroksidase positif terhadap korelasi
positif.
• Larutan yang diperlukan :
1. Larutan Sudan Black : 0,5 gram Sudan Black B dicampur
dengan 100 mL etanol absolut. Biarkan selama 2 hari dan
saring.
2. Larutan Buffer : Phenol 16 gram, etanol absolut 30 mL,
Na2HPO4.12H2O 0,3 gram dan aquadest 100 mL.
3. Larutan kerja : dicampur 60 mL larutan Sudan Black dan
40 mL Buffer. Saring
• Cara :
1. Sediaan direkatkan dengan uap formalin dalam wadah
tertutup selama 10 menit.
2. Genangi sediaan dengan larutan kerja selama 30 menit.
3. Bilas dengan etanol absolut dan bilas dengan air.
4. Bisa juga di warnai dengan safranin 0,1 %.

• Hasil :
• Granula yang mengandung lipid/lemak akan berwarna
hitam
• Sudan black
• Fixasi : formalin 10 %
• Tech : 5 mikron
• Hasil : lipid  hitam
nuclei merah
Van Gieson :
mengenal kolagen pada jar.ikat
Prinsip : berdasarkan 3 pewarnaan
(trichrom)
Serabut kolagen akan berwarna merah
Hasil : inti sel coklat hitam
Kolagen : merah menyala
Sitoplasma , otot, eritrosit  kuning
• Metode pewarnaan ini berdasar pada 3 warna (Trichrom)
yaitu asam pikrat dan asamfuchsin dengan hematoksilin.
• Jaringan pada kaca obyek dilakukan deparafinisasisampai
alkohol 70%, kemudian diberi larutan Hematoksilin
WEIGERT ( A dan B sama banyak) diamkan selama 5
menit, kemudian larutkan dalam air hangat 60C agar
berwarna biru kurang lebih selama 3- 10 menit.
• Bilas dengan aquades dan bilas cepat dalam larutan C
dengan cepat (1x celup).
• Kemudian dilakukan dehidrasialkohol 96% 2x, absolut 2x,
xylol 2x. Berikan Canada balsam dan tutup dengan kaca
penutup
 PEWARNAAN
IMUNOHISTOKIMIA
• Temuan Coon et al (1941) berupa teknik
imunofluoresensi untuk mendeteksi antigen dalam
spesimen jaringan
• Basis : imunologi, histologi dan kimia
• Konsep dasar : pembuktian antigen dalam spesimen
jaringan menggunakan antibodi spesifik
• Ikatan Ag-Ab ini dilihat dengan mikroskop cahaya atau
fluorokrom dengan sinar ultraviolet setelah melalui tahap
reaksi histokimia dengan pewarnaan.
• (1990-an) ditemukan teknik untuk membuktikan antigen
yang telah diubah dengan fiksasi melalui pemanasan
GARIS BESAR TAHAP DAN FAKTOR YANG BERPENGARUH
PADA PEMERIKSAAN IMUNOHISTOKIMIA
ANTIBODI POLIKLONAL DAN MONOKLONAL
 TAHAP FIKSASI
• Fiksasi sangat penting dalam menentukan outcome
reaksi antigen-antibodi
• Manfaat fiksasi :
– Menjaga keutuhan komponen sel (protein struktural dan soluble)
– Mencegah autolisis dan perubahan penyusun sel (antigen dan
enzim)
– Stabilisasi material sel dari akibat prosedur tindakan
– Fasilitasi pengecatan konvensional dan imunostaining
• Ada dua macam cara fiksasi
– Fiksasi cross linking (non koagulasi)
– Coagulating fixatives
 FIKSASI CROSS-LINKING
• Gold standard : formaldehid
• Mekanisme dasar fiksasi : pembentukan addition product
antara formalin dan grup amino reaktif yang tak
bermuatan (-NH atau NH2) membentuk cross-link
• Jika terdapat hidrogen reaktif kedua maka akan
terbentuk methylene bridge
 Non cross-link fixative
• Sebagian besar menyebabkan koagulasi protein dengan
cara memecah ikatan hidrogen tanpa adanya cross-link
protein
• Bahan fiksasi non cross-link standard : etanol
• Kelemahan :
– Preservasi struktur sel kurang
– Perubahan imunoreaktivitas intraseluler
 ANTIGEN RETRIEVAL

• AR bertujuan untuk optimalisasi imunoreaksi

• Tahap fiksasi akan mengubah struktur tersier protein (antigen)
sehingga sulit bereaksi dengan antibodi
• Metode untuk memulihkan perubahan akibat fiksasi
• AR terutama diperlukan pada jaringan yang difiksasi dengan cross-
link fixative
• Tanpa AR, Ab poliklonal lebih mudah deteksi Ag dibanding Ab
monoklonal
• Prosedur AR yang paling banyak dipakai
– Metode enzimatik
– Metode heat-based retrieval
– Cara lain : inkubasi slide dalam larutan alkali kuat, urea, larutan asam,
borohidrid, larutan sukrosa
 AR Enzimatik
• Huang et al mengenalkan metode protease-induced
epitope retrieval (PIER)
• Enzim yang dipakai : tripsin, proteinase K, pronase, ficin,
pepsin
• Efek dipengaruhi : konsentrasi dan tipe enzim,
parameter inkubasi (waktu, suhu, pH), dan durasi fiksasi
• Waktu digesti enzimatik berbanding terbalik dengan
lama fiksasi
• Kelemahan metode PIER
– Rendahnya jumlah antigen
– Perubahan morfologi jaringan
– Destruksi epitop
Heat-based AR

• Heat-induced epitope retrieval

(HIER) dikenalkan oleh Shi et al
• Konsep : reaksi kimia antara protein
dan formalin dapat dipulihkan/dibalik
dengan pemanasan atau hidrolisis
dengan alkali kuat
• Pemanasan dapat membuka epitop
melalui hidrolisis cross-link metilen
• Pemanasan suhu tinggi (100°C)
dengan durasi singkat (10 menit)
akan mendapat hasil yang lebih baik
dibanding pemanasan suhu rendah
dengan waktu yang lama
 SISTEM DETEKSI
• Reaksi Ag-Ab baru dapat diamati dengan mikroskop setelah diberi
label (molekul reporter)
• Label menempel pada Ab primer, sekunder atau tersier sehingga
reaksi imun dapat diamati secara visual
• Label yang paling banyak dipakai adalah enzim (misal peroksidase,
fosfatase alkali, glukosa oksidase)
• Enzim + substrat + kromogen presipitat berwarna pada
lokasi reaksi Ag-Ab
• sensitivitas reaksi imun sangat tergantung pada sistem deteksi
yang dipakai
• Sistem deteksi :
– Metode direct
– Metode indirect
 METODE DIRECT
• Metode imunohistokimia yang paling simpel
• Proses satu tahap
• Label (molekul reporter) yang dipakai
– Fluorokrom
– Enzim
– Colloidal gold
– Biotin
• Metode cepat tapi kurang sensitif
 METODE INDIRECT
• Metode dua tahap
• Ab lapis pertama tak dilabel, label diberi pada lapis
kedua
• Sensitivitas lebih tinggi karena
– Ab primer tak dilabel sehingga tetap aktif dan dihasilkan sinyal
yang kuat
– Jumlah label per molekul Ab primer lebih tinggi sehingga
intensitas reaksi lebih tinggi
• Jenis-jenis metode indirect :
– Metode avidin-biotin
– Metode peroksidase-antiperoksidase
– Polymeric labelling two-step method
– Metode amplifikasi tiramin
– Immuno-rolling circle amplification
METODE AVIDIN-BIOTIN
• Avidin adalah glikoprotein yang
diekstraksi dari putih telur dan
memiliki empat lokasi ikatan
dengan afinitas tinggi terhadap
biotin
• Biotin membentuk ikatan dengan
avidin dan antibodi (biotinylated
Ab) atau molekul lain (enzim,
fluorokrom, atau zat labeling lain
• Metode yang paling lazim dipakai
adalah metode ABC (avidin biotin
complex)
• Metode lainnya :
• LAB (labeled avidin-biotin)
• LSAB (labeled streptavidin-biotin)
Metode Peroksidase-antiperoksidase (PAP)

• Sensitivitasnya 100-1000 kali

dibanding metode indirect dua
tahap
• Terdiri dari tiga lapis
• Menambahkan Ab sekunder
dalam jumlah berlebihan sehingga
akan berikatan dengan Ab primer
maupun PAP kompleks
Polymeric labeling two step method

• Tersusun oleh polimer padat

yang berikatan dengan enzim
dan Ab sekunder
• Kelebihan :
– Lebih simpel dibanding metode
tiga tahap
– Sensitivitasnya setara atau lebih
tinggi dibanding metode ABC
atau LSAB
Tyramin amplification method

• Dasarnya : kemampuan tiramin

untuk berikatan secara kimiawi
dengan substrat padat setelah
tahap oksidasi/radikalisasi
• Timbunan biotinylated tyramine di
lokasi reaksi Ag-Ab yang
dikatalisis oleh horseradish
peroksidase (HRP)
• Sensitivitas 5-10 kali dibanding
metode avidin biotin
• Untuk pemeriksaan Ag yang
kadarnya rendah di jaringan
 PROSEDUR
IMUNOHISTOKIMIA (P53)