Pewarnaan Hematoxylin-Eosin

Tujuan :

Untuk mewarnain preparat jaringan.

Prinsip :

1. Inti sel bersifat asam akan menarik zat/larutan yang bersifat basa, maka
inti akan berwarna biru/ungu dari zat Hematoxylin.
2. Sitoplasma bersifat basa dan akan menarik zat/larutan yang bersifat asam,
maka sitoplasma akan berwarna merah dari zat Eosin.

Landasan Teori :

Staining yaitu mewarnai preparat dengan pewarnaan tertentu. Dalam

pewarnaan ini sel dan komponen dalam jaringan akan menangkap molekul-molekul
zat warna, tidak menimbulkan partikel-partikel zat warna pada jaringan, sehingga
jaringan tampak transparan, biasaanya digunakan pewarnaan H-E.

Jika disekitar sel dan komponen jaringan diendapkan garam logam berat
sehingga logam tersebut tampak sebagai partikel-partikel disebut sebagai
impregnation staining. Misalnya pengecatan dengan AgNO3.

Klasifikasi pewarnaan berdasarkan asal zat warna :

a. Natural Dyes, yaitu pewarnaan yang berasal dari alam seperti ekstrak tumbuh-
tumbuhan atau hewan.
Misalnya :
Acid Carmine, pewarnaan yang berasal dari ekstrak serangga betina yang
hidup di pohon kaktus di daerah tropis.
Hematoxylin, pewarnaan yang berasal dari getah pohon Hematoxyline
campechianum.
b. Syntetic Dyes, yaitu pewarnaan sintesis buatan.
Misalnya : Benzene, Quinone, Anilline.
 Secara umum prinsip kerja pewarnaan adalah zat warna yang bersifat asam
akan mewarnai bagian sel yang bersifat basa dan sebaliknya zat warna yang bersifat
basa akan mewarnai bagian sel yang bersifat asam.

Berdasarkan waktu :

a. Direct Staining, yaitu pewarnaan yang apabila molekul zat warna langsung
ditangkap oleh jaringan, misalnya Eosin.
b. Indirect Staining,yaitu pewarnaan yang apabila molekul-molekul zat warna
baru bisa ditangkap oleh jaringan apabila menggunakan zat perantara yang
disebut Mordant, misalnya pewarnaan Hematoxyline yang menggunakan
Potasium Alum sebagai mordantnya.
Mordant ini bisa dimasukan ke dalam zat warna langsung atau dibuat terpisah,
dimana jaringan dimasukan terlebih dahulu ke dalam mordant baru kemudian
di masukan ke dalam zat warna.

Tahapan pewarnaan H-E :

1. Deparafinasi, suatu proses menghilangkan parafin dengan larutan xylol. Dapat

digunakan xylol I dan xylol II masing-masing selama 2 menit.
2. Menghilangkan xylol dengan alkohol melalui proses rehidrasi, yaitu dengan
menggunakan larutan alkohol bertingkat dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi
rendah (alkohol 96%, 90%, 80%, 70%,dan 50% masing-masing selama 2
menit).
3. Kemudian dilakukan pencucian dengan Aquadest selama 1 menit.
4. Dilakukan pewarnaan dengan Hematoxyline selama 3-5 menit
5. Pencucian dengan air selama 1 menit.
6. Kemudian dilakukan deferensiasi, yaitu pengurangan warna pada inti dan
penghilangan warna pada sitoplasma dengan menggunakan larutan HCl 0,5%
1-2celup.
 7. Selanjutnya dilakukan proses Blueing dengan menggunakan larutan Lithium
Carbonat 0,5% selama 1-2 menit yang berfungsi menguatkan warna biru pada
inti sel.
8. Pencucian dengan air selama 1 menit.
9. Pewarnaan dengan Eosin untuk mewarnai sitoplasma selama 1-3 menit.
10. Pencucian dengan Alkohol 90% 1-2 celup
11. Dilakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat dengan konsentrasi rendah ke
konsentrasi tinggi masing-masing 2 menit.
12. Tahap clearing dengan menggunakan larutan xylol selama 2 mint
13. Kemudian memasuki tahapan mounting dengan meneteskan larutan entelan 1-
2 tetes pada preparat jaringan yang berfungsi mengawetkan jaringan.
14. Kemudian tutup preparat dengan cover glass.
15. Jangan lupa untuk memberi label pada preparat.
16. Kemudian dapat dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan
pembesaran 400x.

Daftar Pustaka :

Durachim, Adang dan Dani Mahmud. 2015. HISTOTEKNOLOGI.

 Pewarnaan Mallory – Azan

Metode mallory trichome digunakan untuk menghasilkan warna dengan kontras yang
lebih jernih dan variasi struktur dengan lebih jelas. Metode ini ditujukan untuk
melihat struktur seperti tisu, serat, otot, glial sel, kolagen, glomerulus ginjal, eritrosit,
dan kromatin.

Reagen Larutan A

1. Aniline Oil 0,1 ml

2. Ethanol 95% 100 ml

3. Aquades

Larutan B

1. Azocarmine G Cl n. 50085 0,1 gram

2. Asam Asetat Glacial 1 ml

3. Aquades 100 ml

Larutan C

1. Ethanol 95% 100 ml

2. Asam Asetat Glacial 1 ml

3. Asam Phosphomolybdic

Larutan D. Trikrom Mallory

1. Aniline Blue Cl n. 42755 0,5 gram

2. Orange G Cl n. 16230 2 gram

3. Aquades 100 ml
4. Asam Asetat Glacial 5-7 ml

Larutan Preparat

Larutan A

1. Menyiapkan larutan aniline oil 0,1% dalam ethanol 95%

Larutan B

1. Melarutkan Larutan Azocarmine G dengan aquades, dan didihkan

2. Tambahkan asam asetat glasial, dinginkan lalu saring

3. Masukkan ke dalam oven suhu 50oC selama 24 jam

4. Sebelum digunakan tambahkan 1 ml asam asetat glasial dan di oven selama 1 jam

Larutan C

1. Melarutkan aniline blue dan orange G dalam aquades, dan didihkan

2. Tambahkan asam asetat glasial

3. Didihkan sebentar, lalu dinginkan dan saring

4. Sebelum digunakan encerkan terlebih dahulu dengan aquades dengan

perbandingan 1:3

Metode Pewarnaan

1. Hilangkan lilin lalu bilas dengan air

2. Letakkan dalam larutan A selama 1-2 menit

3. Bilas dengan ethanol 95%

4. Bilas dengan aquades

5. Letakkan dalam larutan B (azocarmine) suhu 50oC selama 1 jam

6. Dinginkan lalu bilas dengan aquades

7. Pisahkan dengan larutan A (aniline) selama 10 menit

8. Letakkan potongan dalam larutan C (alkohol asetat) selama 1 menit

9. Letakkan potongan dalam larutan asam phosphomolybdic selama 1-3 jam

10. Bilas dengan aquades

11. Letakkan potongan dalam larutan D (mallory) selama 1-3 jam

12. Bilas dengan aquades

13. Pisahkan dengan ethanol 95%

14. Keringkan dengan ethanol penuh selama 2-4 menit

15. Absolute ethanol selama 2-4 menit

16. Xylene atau pengganti selama 5-10 menit

17. Xylene atau pengganti selama 10-15 menit

18. Tutup dengan menggunakan eukitt. Hasil Kromatin, eritrosit dan granula asidofil
sitoplasma dari sel gland pituitary adalah berwarna merah, neurofibril berwarna
merah muda. Otot dan eritrosit berwarna orange. Serat reticular granula, granula
basofil dari sel gland pituitary, granula glomerulus dan ginjal berwarna biru. Serat
retikular berwarna biru muda dan nukleus berwarna merah.

Modifikasi Mallory-Azan

1. Mencelupkan sampel ke dalam air, dan celupkan ke azocarmine B selama 1 jam.

Sampel dibilas ke dalam air suling.

2. Memisahkan aniline ETOH sampai tersisa nukleus, eritrosit dan otot (tergantung
fiksasi).
3. Membilas asam asetat ETOH dengan hati-hati untuk memisahkan dan
menghilangkan aniline.

4. Melakukan prosedur kerja Mordanting, yaitu melarutkan asam phosphotungistic 50

gram selama 1-3 jam (pada prosedur kerja metode pewarnaan).

5. Melakukan prosedur kerja Aniline blue-orange G, yaitu menambahkan aniline blue

5 gram, orange G 20 gram, asam asetat glasial 80 ml. Panaskan larutan dan biarkan
larutan menjadi dingin. Setelah selesai, lakukan proses pencelupan dan penyaringan.

6. Membilas sampel dengan air suling.

7. Terakhir mengeringkan counterstan ke dalam larutan ETOH/IPA.

Hasil Akhir Kolagen dan jaringan ikat berwarna biru; otot berwarna orange
kemerahan (tergantung fiksasi); eritrosit, nukleus, dan serat glia berwarna merah.

(Riswanto, Pemeriksaan Laboratorium Hematologi, Alfamedia & Kanal Medika,

Yogyakarta, 2013)
 Pewarnaan Wright

Pengecatan wright meruapakn sala satu pengecatan apusan darah selain

pengecatan giemsa. Pengecatan wright juga untuk memeriksa morfologi sel-sel darah
merah maupun sel darah putih dan untuk menghitung jenis-jenis sel darah putih
(diffcount). Pengecatan wright bisa didapat dalam bentuk serbuk atau dalam bentuk
cairan siap pakai.
Teknik pewarnaan wright dgn menggunakan 2 zat warna yaitu Metilen blue dan
eosin. Pencampuran 2 zat warna ini akan dibagi 3 buah sifat: asidofilik, netrofilik,
basofilik. Perbedaan wright dibandingkan giemsa:
1. Granula basofil tampak jelas
2. Granula eosinofil orange
3. Tidak tahan lama diiklim tropik, akan memucat dalam beberapa tahun
4. Tidak perlu fiksasi terpisah
5. Lebih cocok untuk pewarnaan individu.
6. Variasi waktu pewarnaan tidak fleksibel
7. Tidak perlu metanol untuk fiksasi
8. Harga relatif lebih murah
9. Eritrosit warna merah
10. Lebih cocok untuk sel darah, sumsum tulang (MDT)
11. Zat warna siap pakai, tidak perlu diencerkan.

Gandasoebrata, Penuntun Laboratorium Klinik, Dian Rakyat, Jakarta,1968

 Pewarnaan Periodic Acid Schiff

PAS (Periodic Acid Schiff) digunakan untuk mendeteksi adanya kandungan

mukopolisakarida netral pada suatu jaringan dan akan memberikan warna magenta.

Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) Reaksi terhadap pewarnaan PAS menunjukkan
adanya glikogen dalam jaringan. Periodic acid akan mengoksidasi residu glukosa dan
menghasilkan aldehida yang selanjutnya bereaksi dengan reagen Schiff dan menimbulkan
warna magenta-purple. Pewarnaan PAS diberi perona (counterstain) berupa pewarnaan
basa (misalnya hematoxylin). Pewarnaan PAS akan menunjukkan keberadaan karbohidrat
pada jaringan ikat, mukus, dan membran basal jaringan epitel. Pewarnaan PAS yang
dilakukan pada penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan parasit dan
jamur. Parasit dan jamur akan terlihat dalam pewarnaan PAS karena unsur pembentuk
keduanya adalah karbohidrat.

Pewarnaan ini dimulai dengan melakukan deparafinisasi dan rehidrasi sediaan

dalam larutan xylol dan alkohol bertingkat masing-masing selama 3-5 menit, kemudian
dilanjutkan dengan pencucian dalam air mengalir selama 10 menit. Setelah itu, sediaan
dioksidasi dalam asam periodat 1% selama 5-10 menit dan dicuci dengan akuades 3 kali,
masing-masing selama 5 menit. Selanjutnya dilakukan pewarnaan larutan reagent Schiff
selama 15-30 menit dan dicuci dengan air sulfit yang selalu fresh (dibuat baru) selama 3 x 3
menit. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan akuades selama 5 menit sebanyak 3 kali.
Counterstain dengan hematoksilin, cek dengan mikroskop. Pencucian kembali dengan air
mengalir 10-60 menit dan akuades selama 5 menit sebanyak 2 kali. Dehidrasi dan
penjernihan dilakukan didalam larutan alkohol dan xylol, dianginanginkan, ditetesi cairan
permounting, dan ditutup dengan gelas penutup.

Geneser F. 1994. Textbook of histologi. Jilid 1 dan Jilid 2. Alih Bahasa: Dr. F. Arifin
Gunawijaya M.S. Jakarta: Binarupa Aksara.
 Pewarnaan Verhoef Van Gieson

Pewarna Verhoeff juga dikenal sebagai Verhoeff’s Elastic Stain

(VEG) atau Verhoeff-Van Gieson Stain (VVG) ialah suatu protokol
pewarnaan yang digunakan dalam hitologi, yang dikembangkan oleh Ahli
bedah optalmik dan patologis Amerika Frederick Herman Verhoeff (1874-
1968) pada tahun 1908. Formulasinya digunakan untuk menunjukkan serat
elastik normal atau patologis.

Pewarnaan Verhoeff membentuk berbagai ikatan kation, anion dan

non-ion dengan elastin, konstituen utama dari jaringan serat elastik. Elastin
memiliki afinitas yang kuat untuk kompleks besi-hematoksilin yang dibentuk
oleh reagen-reagen dalam pewarna itu dan karena itu akan menahan
pewarna lebih lama dibandingkan unsur jaringan lain. Ini memungkinkan
elastin untuk tetap terwarnai, sementara unsur jaringan yang tersisa
dihilangkan warnanya.
 Pewarnaan Impregnasi Perak

Teknik pewarnaan impregnasi perak yang digunakan adalah teknik

Grimelius (Grimelius, 1968), yang dapat mendeteksi sel-sel alfa (glukagon) pada
Pulau Langerhans pancreas dan sel-sel endokrin lain pada saluran pencernaan.
Dengan teknik ini, terlihat bahwa butir-butir sitoplasma pada sel-sel yang
bereaksi positif mengambil warna coklat tua sampai dengan hitam. Jaringan
sekitarnya mengambil warna kuning muda. Oleh karena itu, sel-sel ini menjadi
mudah dikenali dan dibedakan dengan sel-sel bagian eksokrin maupun sel-sel
Pulau Langerhans pankreas.