Pewarnaan pada Histologi

Robbie Cristian Hutasoit

233308010015

Dosen: dr.Fiska Maya Wardhani,M.Biomed.

Pewarnaan histologi adalah sebuah teknik yang digunakan untuk memberikan warna pada organel
sel sehingga lebih mudah diamati di bawah mikroskop

Tujuan pewarnaan:
supaya unsur-unsur jaringan tampak jelas & dapat dibedakan bagian-bagiannya di bawah mikroskop

Macam-macam Zat Warna

Berdasarkan asalnya

a.Zat warna alamiah

Berasal dari tumbuhann/hewan

Misalnya Hematoxylin dari H.campecenium L.Carmin dari Caceuscacti (insecta pada cactus)

b.Zat warna sintetis

Dibuat di pabrik

Misalnya:crystal violet,analin blue,malachite green,safranin.

Berdasarkan sifat

a.Zat warna basa

Garam garam dari asam pembawa warna dan radikal basa tak berwarna .

Misalnya: asam fuchsin,eosin

b.Zat warna basa

Garam garam dari basa pembawa warna dan radikal asam tak berwarna

Misalnya:basic fuchsin hematoxylin

Berdasarkan Kemampuan

a.Zat warna substantif

Mampu langsung mewarnai jaringan.

Misalnya: eosin,safranin,fast green,yanus green

b.Zaat warna ajektif

Berfungsi dengan baik bila dibantu zat lain (zat mordan)

Misalnya:hematoxylin
Berdasarkan Pengaruh Zat warna terhadap obyek

a.Pewarna efektif

Hanya mewarnai satu atau beberapa bagian jaringan saja

Misalnya:Toluidin blue untuk jaringan mesenterium yang jelas hanya granula

b.Pewarna difus

Mewarnai seluruh jaringan tetapi daya serapnya tidak sama

Misalnya:eosin

Cara Penggunaan Zat Warna

1.Pewarnaan simultan,2 atau lebih macam zat warna dipakai bersama-sama

Misalnya:Larutan malory(anilin blue & orange G)

2.Pewarnaan suksedan,2 atau lebih zat warna diberikan bergantian diselingi pencucian

Misalnya : Safrani-fast greeq hematoxylinreosin

Bahan-bahan yang digunakan dalam Pewarnaan

1.Pewarnaan Hematoxylin-eosiin (HE)

Pewarnaan hematoksilin dan eosin (atau pewarnaan H&E) adalah salah satu pewarnaan jaringan
utama yang digunakan dalam histologi. Ini adalah noda yang paling banyak digunakan dalam
diagnosis medis dan sering kali merupakan standar emas ; misalnya, ketika ahli patologi melihat
biopsi dari dugaan kanker , bagian histologis cenderung diwarnai dengan H&E.

H&E adalah kombinasi dari dua pewarnaan histologis: hematoxylin dan eosin . Hematoxylin menodai
nuklei sel biru, dan eosin menodai matriks ekstraseluler dan sitoplasma merah muda, dengan
struktur lain mengambil berbagai corak, rona, dan kombinasi warna-warna ini. Noda menunjukkan
tata letak umum dan distribusi sel dan memberikan gambaran umum struktur sampel jaringan. Oleh
karena itu, ahli patologi dapat dengan mudah membedakan antara bagian inti dan sitoplasma dari
suatu sel.

Kombinasi pewarnaan ini pertama kali diperkenalkan pada tahun 1876 oleh A. Wissowzsky

Prosedur

Prosedur pewarnaan H&E adalah pewarnaan utama dalam histologi sebagian karena dapat
dilakukan dengan cepat, tidak mahal, dan menodai jaringan sedemikian rupa sehingga sejumlah
besar anatomi mikroskopis terungkap, dan dapat digunakan untuk mendiagnosis berbagai kondisi
histopatologis. Hasil dari pewarnaan H&E tidak terlalu tergantung pada bahan kimia yang digunakan
untuk memperbaiki jaringan atau sedikit inkonsistensi dalam protokol laboratorium, dan faktor-
faktor ini berkontribusi terhadap penggunaan rutin dalam histologi.

Pewarnaan H&E tidak selalu memberikan kontras yang cukup untuk membedakan semua jaringan,
struktur seluler, atau distribusi zat kimia, dan dalam kasus ini pewarnaan dan metode yang lebih
spesifik digunakan
2. Periodik Acid Schiff (PAS)

Periodic Acid-Schiff (PAS) merupakan metode pewarnaan histokimia khusus yang digunakan untuk
mendeteksi adanya karbohidrat polisakarida, musin netral dan glikoprotein lain di dalam jaringan1 .
Satusatunya polisakarida yang ditemukan pada manusia yang dapat dievaluasi dengan teknik
histokimia adalah glikogen. Polisakarida lainnya dapat ditemukan pada dinding jamur dan
mikroorganisme seperti amoeba. Glikoprotein merupakan molekul yang terdiri atas gabungan
karbohidrat dengan protein

Prinsip pewarnaan PAS

Gugus karbohidrat glikol dioksidasi oleh asam periodik menghasilkan dialdehida. Dialdehida ini pada
kombinasi selanjutnya dengan reagen Schiff menghasilkan pembentukan kompleks berwarna
magenta, terlokalisasi di lokasi pembentukan aldehida

Prosedur Pewarnaan PAS

1. Deparaffinisasi: nyalakan kaca objek di atas kompor dan masukkan ke dalam xilena. Ulangi
perawatan untuk menghilangkan lilin.

2. Hidrasi: Tiriskan xylene dan hidrasi bagian jaringan dengan melewati penurunan konsentrasi
rendaman alkohol (100%, 90%, 80%, 70%) dan air.

3. Oksidasi: Tempatkan bagian dalam larutan asam periodik (1%) selama 5-10 menit.

4. Bilas: Cuci setidaknya dua kali ganti air suling.

5. Perawatan dengan reagen Schiff: Tutupi dengan reagen Schiff selama 20-30 menit.

6. Bilas: Bilas dengan air keran yang mengalir selama 5-10 menit.

7. Counterstain: Tutupi dengan hematoxylin selama 3-5 menit. Bedakan dan warna biru untuk
bagian-bagiannya.

8. Dehidrasi: Dehidrasi dalam peningkatan konsentrasi alkohol.

9. Kliring: Masukkan slide ke dalam dua wadah xylene untuk dibersihkan.

10. Pemasangan: Pasang di DPX atau media pemasangan lainnya.

11. Amati di bawah mikroskop.

Zat positif PAS adalah:

1. Polisakarida: Glikogen, selulosa dan pati. Leukosit banyak mengandung

glikogen, kapsul jamur ( Candida albicans , Histoplasma
capsualtum , Cryptococcus dan Blastomycosis ), aktinomikosis dan bakteri.
2. Glikoprotein: Musin, sekresi mukoid saluran usus, kelenjar rahim, saluran,
saluran trakeobronkial, hormon (TSH), megakariosit dll.
3. Glikolipid: Gangliosida, terutama materi abu-abu yang terdiri dari asam lemak.
4. Zat yang mengandung non-karbohidrat: Lipid tak jenuh, fosfolipid dan
fosfoinositida.
5. Pigmen dan zat tertentu: Ceroid, lipofucsin, pigmen pada melanosis coli dan
pigmen Dubin-Johnson.
6. Plasmogen: Mereka adalah asetil fosfolipid, misalnya: badan Russell.
7. Lain-lain: Amiloid, matriks tulang rawan, koloid dan bahan lensa mata.

3. Malory Azan (MA)

Metode mallory trichome digunakan untuk menghasilkan warna dengan kontras yang lebih jernih
dan variasi struktur dengan lebih jelas. Metode ini ditujukan untuk melihat struktur seperti tisu,
serat, otot, glial sel, kolagen, glomerulus ginjal, eritrosit, dan kromatin.

Metode Pewarnaan

1. Hilangkan lilin lalu bilas dengan air

2. Letakkan dalam larutan A selama 1-2 menit

3. Bilas dengan ethanol 95%

4. Bilas dengan aquades

5. Letakkan dalam larutan B (azocarmine) suhu 50oC selama 1 jam

6. Dinginkan lalu bilas dengan aquades

7. Pisahkan dengan larutan A (aniline) selama 10 menit

8. Letakkan potongan dalam larutan C (alkohol asetat) selama 1 menit

9. Letakkan potongan dalam larutan asam phosphomolybdic selama 1-3 jam

10. Bilas dengan aquades

11. Letakkan potongan dalam larutan D (mallory) selama 1-3 jam

12. Bilas dengan aquades

13. Pisahkan dengan ethanol 95%

14. Keringkan dengan ethanol penuh selama 2-4 menit

15. Absolute ethanol selama 2-4 menit

16. Xylene atau pengganti selama 5-10 menit

17. Xylene atau pengganti selama 10-15 menit

18. Tutup dengan menggunakan eukitt. Hasil Kromatin, eritrosit dan granula asidofil sitoplasma dari
sel gland pituitary adalah berwarna merah, neurofibril berwarna merah muda. Otot dan eritrosit
berwarna orange. Serat reticular granula, granula basofil dari sel gland pituitary, granula glomerulus
dan ginjal berwarna biru. Serat retikular berwarna biru muda dan nukleus berwarna merah.

4. Methylen Blue (MB)

Methylene blue (MB) merupakan zat pewarna yang umum digunakan pada industri tekstil dan
senyawa ini memiliki gugus benzene sehingga sulit untuk terurai secara alami. Penelitian ini
bertujuan untuk mengkaji tinggi unggun yang digunakan pada penyisihan methylene blue
menggunakan ampas teh. Parameter operasi yang efektif seperti konsentrasi adsorbat, tinggi
unggun dan waktu kontak pada adsorpsi telah diselidiki. Data model kinetik dianalisa menggunakan
model orde pertama semu, orde kedua semu. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kondisi yang
terbaik untuk waktu operasi adsorben yang digunakan dengan konsentrasi adsorbat 15 mg/L pada
tinggi unggun 8, 12 dan 16 cm berturut-turut yaitu 60 menit, 60 menit dan 75 menit dengan
efesiensi penyerapan sebesar 98.4793%, 99.3441% dan 99.4883%. Mekanisme kesetimbangan
adsorpsi dipelajari dengan menggunakan dua jenis isotehrm, yaitu isoterm Langmuir dan Freundlich.
Fenomena dari adsorpsi MB ke ampas teh didapatkan bahwa model Freunlich lebih sesuai dalam
menjelaskan kesesauaian antara data ekperimen dengan data yang diperoleh dari model. Hal ini juga
dapat dibuktikan bahwa nilai koefisien korelasinya (R2) yang diperoleh juga lebih tinggi untuk
Freunlich dari pada Langmuir, yaitu 0.9764.
5. Safranin
Safranin adalah pewarna kationik yang digunakan dalam histologi dan sitologi untuk membedakan
dan mengidentifikasi berbagai jaringan dan sel. Ini populer dalam penelitian medis untuk pewarnaan
proteoglikan asam yang ditemukan di jaringan tulang rawan, memungkinkan peneliti menganalisis
kondrogenesis sel. Safranin digunakan sebagai counter-stain dalam pewarnaan endospora dan
pewarnaan Gram. Ini sebagian besar digunakan untuk identifikasi tulang rawan, musin, dan butiran
sel mast.

Pewarnaan safranin bekerja dengan cara berikatan dengan proteoglikan yang bersifat asam pada
jaringan tulang rawan dengan afinitas tinggi sehingga membentuk kompleks berwarna jingga
kemerahan. Pengikatan tersebut membuat jaringan tulang rawan tampak merah jika diamati di
bawah mikroskop. Pewarnaan safranin membantu para peneliti mendeteksi tidak hanya jaringan
tulang rawan tetapi juga seluruh jaringan dan organ tubuh. Pewarnaan safranin adalah salah satu
pewarnaan laboratorium aman yang paling menjanjikan yang digunakan untuk penelitian
histopatologi dan sitologi.

Pewarnaan safranin adalah teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan untuk diferensiasi sel,
pengujian berbasis sel, dan kultur sel induk. Pewarnaan safranin umumnya digunakan untuk
mengukur dan mengidentifikasi asam proteoglikan dan glikosaminoglikan dalam jaringan tulang
rawan. Pewarnaan safranin membantu para peneliti mendeteksi tidak hanya jaringan tulang rawan
tetapi juga seluruh jaringan dan organ tubuh.

Berikut sifat kimia dan fisik safranin.

Nama kimia: 3,7-Diaamino-2,8-dimetil-5-fenilfenazinium klorida

Berat molekul: 350,84

Rumus molekul: C20H19CIN4

Kelarutan: Larut dalam etanol

Warna: Merah kecoklatan

Bau: Tidak ada bau tertentu

Struktur fisik: Bubuk

Kekuatan dan keterbatasan

Pewarnaan safranin banyak digunakan dalam diagnostik in-vitro. Berikut kelebihan dan keterbatasan
penggunaan pewarnaan safranin dalam penelitian biomedis.

Pewarnaan safranin adalah pewarna yang paling populer digunakan di laboratorium medis.

Pewarnaan safranin adalah pewarna laboratorium yang lebih murah dan aman.

Ini adalah noda bersertifikat untuk kromosom.

Ini dapat digunakan untuk mewarnai sel hewan dan tumbuhan untuk analisis sitologi dan histologis
yang lebih baik.

Hal ini memungkinkan deteksi jaringan pembuluh tanaman dengan mudah dan cepat.
Ini menawarkan peningkatan akurasi dalam diagnosis bagian sel tumor yang beku.

Ini membantu ahli mikrobiologi mewarnai bakteri gram negatif yang terdekolorisasi selama
pewarnaan Gram.

Hal ini memungkinkan para peneliti untuk melakukan analisis kualitatif dan kuantitatif proteoglikan
dalam matriks tulang rawan dalam diagnosis penyakit artikular.

Pada penyakit dimana kehilangan glikosaminoglikan sangat parah, safranin bukanlah indikator yang
sensitif.

6. Perak Impregnasi (AG)

Pewarnaan perak adalah metode yang sangat sensitif dan spesifik untuk mendeteksi protein,
menghasilkan gambar yang jelas dengan kebisingan latar belakang minimal dan mengurangi
interferensi spektrometri massa. Proses umum pewarnaan perak melibatkan fiksasi perak,
pekaannya, impregnasinya dengan perak, dan pengembangan gambar. Ada beberapa variasi dari
teknik ini, ada yang hanya membutuhkan waktu satu jam untuk menyelesaikannya dan ada pula
yang memerlukan waktu lebih dari 24 jam. Setelah selesai, noda dapat tetap stabil selama beberapa
minggu, sehingga memungkinkan pengamatan lebih lama.

Sejarah pewarnaan perak dimulai pada akhir abad ke-19, ketika ahli kimia Prancis Louis-Emile Javal
pertama kali mengembangkan teknik ini sebagai metode untuk memvisualisasikan serabut saraf.
Namun, baru pada awal abad ke-20 teknik ini diadaptasi untuk digunakan dalam deteksi protein
dalam gel. Sejak saat itu, pewarnaan perak telah menjadi pokok kimia protein, dan telah digunakan
secara luas dalam berbagai penelitian dan penerapan klinis, termasuk analisis protein dalam darah
dan jaringan.

Selama bertahun-tahun, teknik pewarnaan perak telah disempurnakan dan diperbaiki, dengan
berbagai modifikasi diperkenalkan untuk meningkatkan sensitivitas dan spesifisitasnya. Saat ini,
pewarnaan perak tetap menjadi alat penting dalam bidang kimia protein, dan terus memainkan
peran penting dalam mempelajari proses biologis dan mekanisme penyakit. Meskipun munculnya
teknik yang lebih baru dan lebih maju, pewarnaan perak terus digunakan secara luas karena
keandalan dan keserbagunaannya, menjadikannya bagian penting dari perangkat ahli kimia protein.
Prinsip pewarnaan perak

Pewarnaan perak adalah teknik sederhana namun kuat yang digunakan untuk memvisualisasikan
protein dalam gel. Prosesnya melibatkan reduksi selektif ion perak di sekitar molekul protein, yang
mengarah ke pembentukan logam perak yang tidak larut. Ada dua protokol utama pewarnaan perak
yang ditentukan oleh fase impregnasi perak, protokol basa dan protokol asam.

Aplikasi pewarnaan Perak

Deteksi Infeksi Bakteri dan Jamur: Pewarnaan perak merupakan metode yang efektif untuk
mendeteksi berbagai infeksi bakteri dan jamur. Beberapa organisme paling umum yang dapat
dideteksi menggunakan pewarnaan perak antara lain Pseudomonas aeruginosa, treponema
pallidum, Helicobacter pylori, Legionella, Leptospira, Bartonella, Pneumocystis, Candida,
Histoplasma, dan Cryptococcus.

Visualisasi Protein: Pewarnaan perak adalah alat yang sangat baik untuk memvisualisasikan protein.
Teknik ini dapat membantu mengidentifikasi perbedaan struktural antara protein, dan juga dapat
digunakan untuk mengukur jumlah protein dalam sampel.

Analisis Genom: Pewarnaan perak dapat digunakan untuk analisis genom, karena dapat mendeteksi
molekul DNA dan RNA dari sampel. Ini menjadikannya alat yang berharga untuk mempelajari biologi
molekuler berbagai organisme.

Deteksi Lipopolisakarida Bakteri: Pewarnaan perak dapat digunakan untuk mendeteksi

lipopolisakarida bakteri pada SDS-PAGE. Ini adalah aplikasi penting untuk mendiagnosis infeksi
bakteri, karena lipopolisakarida memainkan peran kunci dalam patogenesis banyak infeksi bakteri.

Deteksi Lipopolisakarida Jamur: Pewarnaan perak juga merupakan alat yang efektif untuk
mendeteksi lipopolisakarida jamur, seperti yang ditemukan pada biopsi hati Histoplasma. Ini
menjadikannya alat yang berharga untuk mendiagnosis infeksi jamur dan untuk memahami
patogenesis infeksi ini.

Kesimpulannya, pewarnaan perak adalah teknik serbaguna dan ampuh untuk diagnosis dan analisis
medis. Kemampuannya untuk mendeteksi dan memvisualisasikan berbagai komponen bakteri,
jamur, dan molekul menjadikannya alat penting dalam ilmu kedokteran.

Kerugian dari pewarnaan Perak

Spesifisitas rendah: Pewarnaan perak terkadang dapat menghasilkan pewarnaan non-spesifik karena
gangguan dari molekul lain dalam sampel.

Akurasi kuantitatif terbatas: Intensitas noda perak sebanding, tetapi tidak selalu berbanding lurus,
dengan jumlah protein atau asam nukleat yang ada dalam sampel.

Gangguan dari kontaminan: Kontaminan dalam sampel, seperti garam atau detergen, dapat
mengganggu reaksi pewarnaan perak dan memberikan hasil yang salah.

Perlu untuk destaining: Noda perak harus dihilangkan untuk menghilangkan ion perak yang tidak
terikat sebelum pencitraan, yang dapat menyebabkan hilangnya informasi.

Memakan waktu: Proses pewarnaan perak memakan waktu dan dapat memakan waktu beberapa
jam untuk menyelesaikannya, yang dapat menjadi kelemahan ketika waktu menjadi faktor penting.