Pertemuan VI

Neni Arshita, S.Si, M.Biomed

Tujuan : Mempermudah/memperjelas
pengamatan unsur-unsur dalam jaringan
(terutama pengamatan untuk membandingkan sel
abnormal dan normal)

Prinsip umum : Zat warna yang bersifat asam

akan mewarnai bagian sel yang bersifat basa &
sebaliknya

Standart zat warna ideal nya : murah, tahan lama,

mudah dibersihkan, tidak merusak lingkungan
 Umumnya , pewarna mengandung 2 unsur utama : kromofor dan auksokrom

 Afinitas bagian-bagian sel terhadap zat warna berbeda

 Secara umum struktur sel yang umum terwarnai adalah nukleus dan sitoplasma.

Nukleus dan mitokondria bersifat basofilik

Sitoplasma bersifat asidofilik

 Pewarna nukleus yang paling banyak dipakai adalah hematoxylin dan carmine

 Pewarna sitoplasma yang paling banyak dipakai adalah eosin

STRUKTUR SEL DAN AFINITASNYA TERHADAP ZAT WARNA

Hematoksilin, Carmin

Eosin
 Jenis Pewarnaan

 Sifat
 Jumlah zat yang digunakan
 Pengaruh zat warna terhadap sel
 Cara pemberian zat warna
 Tebal / Tipisnya zat warna yang diberikan pada
jaringan
Berdasarkan Sifat

1. Zat warna asam

 Mewarnai materi yang bersifat asidofil (sitoplasma)

 Cth : Eosin

2. Zat warna basa

 Mewarnai materi yang bersifat basofil (nukleus)

 Cth : Hematoksilin
 Berdasarkan Jumlah Zat
Yang Digunakan

1. Pewarnaan tunggal
Cth: Gentiana violet

2. Pewarnaan rangkap 2
Cth: Hematoxylin Erlich-Eosin

3. Pewarnaan rangkap 3
Cth: Mallory Triple Stain (acid fuchsin, aniline blue dan orange G)
 Berdasarkan Pengaruh Zat
Warna Terhadap Sel / Jaringan

1. Pewarnaan efektif

 Hanya mewarnai satu atau beberapa bagian jaringan atau sel.

 cth: Pewarna Toulidin blue hanya mewarnai granula sel pada jaringan
mesenterium.

2. Pewarnaan difus

 Mewarnai seluruh sel.

 Berdasarkan cara pemberian
zat warna

1. Pewarna simultan

 Dua macam zat warna atau lebih diberikan secara bersama-sama dalam satu waktu.

 Cth: Pewarnaan Malory (anilin blue dan orange G)

2. Pewarnaan seuksedan

 Zat warna diberikan secara bergantian atau bertahap.

 Cth: Hematoksilin dan Eosin

Berdasarkan Tebal Tipisnya zat warna
yang diberikan pada jaringan

1. Pewarnaan progresif

 Pewarnaan sangat tipis, sehingga warna yg tepat diperoleh setelah waktu yang lama.

2. Pewarnaan regresif

 Pewarnaan awal sangat tebal.

 Untuk memperoleh warna yang tepat dilakukan penipisan dengan larutan diferensiator.

 Larutan diferensiator asam (alkohol, fenol, dan kresol).

 Larutan diferensiator basa (anilin dan toulidin).

 PERSIAPAN MELAKUKAN PEWARNAAN

 Peralatan gelas harus dibersihkan dulu dan dibilas dengan akuades

 Menimbang zat warna, melarutkan zat warna
 Tuangkan larutan zat warna ke dalam wadah yang sesuai untuk proses pewarnaan dengan
menyaringnya menggunakan kertas saring
 Siapkan juga larutan-larutan lain yang diperlukan untuk proses pewarnaan dan tuangkan dalam
wadah yang sesuai
 Mengatur urutan larutan-larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses pewarnaan
 Zat warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan alkohol yang akan
menyebabkan presipitasi (pengendapan) zat warna
 Jenis Pewarnaan Sitohistoteknologi
Berdasarkan Penerapan Zat Warna Terhadap Jaringan

Pewarnaan Umum Pewarnaan Khusus

Haematoksilin dan Eosin (HE)  Alcian Blue (AB)

 Periodic Acid Schiff (PAS)
 Bekerja sebagai pewarna basa, artinya zat ini mewarnai unsur basofilik
jaringan

 Memulas inti dan strukutur asam lainnya dari sel (seperti bagian sitoplasma

yang kaya-RNA dan matriks tulang rawan) menjadi biru

 Jenis lar. Haematoxylin : Harris, Mayer, Dellafied, Erlich, Heidenhains,

Weigert, Carazzi, dan Cole.

 Komposisi Haematoxylin Mayer
• Kristal haematoxylin…………………... 1 gr
• Akuades………………………………… 1000 ml
• Sodium iodate………………………..… 0,2 gr
• Ammonium/potassium alum............... 50 gr
• Citric acid…………………………....…. 1 gr
• Chloralhydrate……………………….…. 50 gr

 Cara Pembuatan Hematoxylin Mayer

1. Larutkan Ammonium/Potassium alum di dalam aquades.
2. Tambahkan Haematoxylin dan campurkan secara baik.
3. Tambahkan Sodium Iodate, Citric Acid & Chloralhydrate.
4. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dgn baik.
5. Biarkan semalam & saring dgn kertas saring besoknya.
 Zat warna bersifat asam  paling cocok dikombinasikan dgn larutan
haematoxylin.
 Eosin memiliki nilai kemampuan differensiasi sendiri unt membedakan antara
sitoplasma dari tiap sel dan serabut jaringan ikat yang berbeda.
 Jenis eosin : Eosin Y (yellowish) water solution, Eosin B (Bluish), Ethyl Eosin
(eosin S, eosin alkohol solution)
 Hasil pewarnaannya , yaitu : sitoplasma akan berwarna merah, eritrosit akan
berwarna orange merah, nukleus piknotik akan berwarna ungu, dan nukleolus
akan berwarna merah.
 Komposisi Eosin (Eosin-alkohol Stock 1%)
• Eosin y ws…………………………………………… 1 gr
• aquades……………………………………………… 20 ml
• Larutkan dan tambahkan alkohol 95% ………… 80 ml

 Eosin working solution

• Eosin-alkohol stock 1 bagian
• Alkohol 80% 3 bagian

Dibuat sesaat sebelum digunakan & tambahkan As. Asetat glasial 0,5 ml untuk
setiap 100 ml larutan
Menggunakan 2 macam zat warna yaitu

 Hematoksilin : memulas inti sel dan memberikan warna biru (basofilik)

 Eosin : merupakan counterstaining hematoksilin, memulas sitoplasma sel dan

jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda yang bervariasi

Jaringan yang akan diwarnai HE  mengalami “Processing Jaringan” dan dipotong
dengan menggunakan mikrotom (4-6 μm)  dilekatkan pada kaca objek

 Deparafinasi (xylol)
 Rehidrasi (alkohol absolut, 90%, 80%, ……30%, akuades) Tahapan
 Pewarnaan I (Hematoksilin) Pewarnaan
 Differensiasi (HCl 0,6%)
Hematoksilin-
 Blueing (lithium carbonat 0,5%) Eosin
 Pewarnaan II (Eosin)
 Dehidrasi (Alkohol 30 % …..80%, 90%, 100%)
 Clearing (Xylol)
 Mounting (Entelan)
Yang Perlu Diperhatikan
atau mengalirkan air melalui punggung tangan • Gunakan media mounting secukupnya
JANGAN alirkan air tepat di atas jaringan / apusan • Usahakan tidak ada gelembung udara
  Benar X Salah

http://bigpictureeducation.com/ Anindita, R., (2007)

Tubulus Seminiferus
 Jenis Pewarnaan Sitohistoteknologi
Berdasarkan Penerapan Zat Warna Terhadap Cairan

Pewarnaan
Pewarnaan Pewarnaan May
Romanonowsky
Papanicolaou Grunwalds
(Giemsa)
 Pewarnaan Papanicolaou

 Ditemukan oleh Georgios Papanikolaou seorang

patologis yunani pada tahun 1923.

 Merupakan pewarnaan rutin sitologi.

 Sedian yang biasa digunakan bucal smear dan pap

smear.
 Fiksasi dengan alkohol 95%.
 Rehidrasi (alkohol 90% - 30%, akuades).
Tahapan
 Pewarnaan Hematoksilin
Pewarnaan
 Blueing (air mengalir)
 Pencelupan dengan alkohol 95%. Papanicolaou
 Pewarnaan Orange G-6.
 Pencelupan dengan alkohol 95%.
 Pewarnaan Eosin
 Dehidrasi (Alkohol80%, 90%, 100%)
 Clearing (alkohol-xylol, Xylol)
 Mounting
 Pewarnaan MAY GRUNWALDS

 Merupakan pewarnaan rutin sitologi.

 Mewarnai preparat oles (smear) darah.

 Komposisi larutan May Grunwalds A

Larutan methylene blue eosinate 0,25% dalam metil alkohol.

 Komposisi larutan May Grunwalds B

Larutan methylene blue eosinate 0,0125% dalam metil alkohol.

  Letakkan apusan pada kaca objek Tahapan
Pewarnaan
 Teteskan larutan May Grunwalds A selama 5 menit
May Grunwalds
 Tambahkan larutan May Grunwalds B selama 10 menit

 Bilas dengan akuades

 Keringkan di udara

* Pewarnaan May-Grunwald bisa dikombinasikan

dengan giemsa
 Pewarnaan GIEMSA

 Merupakan pewarnaan rutin sitologi.

 Mewarnai preparat oles (smear) darah.

 Komposisi larutan Romanowsky (giemsa)

 Azur methylene blue eosinate

 Glyserol

 Methanol
 Letakkan preparat pada kaca objek Tahapan
Pewarnaan
 Tetesi larutan dengan giemsa selama 30 menit.

 Tetesi dengan akuades selama 30 menit. Giemsa

 Buanglah larutan warna dan bilas dengan akuades.

 Keringkan di udara
 Biopsi lambung  Giemsa

 Biopsi sumsum tulang  Giemsa

 Biopsi hati  trichrom, retikulin, victoria Blue

 Biopsi ginjal  PAS, trichrom, PASM

 Jamur  GMS, PAS

 Kulit susp MH  fito farako

Mempertajam diagnosis morfologik penyakit terhadap sediaan-sediaan yg telah
diwarnai dengan pewarna rutin
 Imunohistokimia
 Imunositokimia
 FISH (Fluorescence in situ hybridization)
 CISH (Chromogenic in situ hybridization)
 PCR (Polymerase chain reaction)
 Suatu proses mengidentifikasi protein spesifik pada jaringan/sel dgn
menggunakan antibodi.
 Tempat pengikatan antara antibodi dgn protein spesifik diidentifikasi dgn
marker (biasanya dilekatkan pada antibodi)  divisualisasi secara
langsung atau dgn reaksi unt mengidentifikasi marker
 Marker  senyawa berwarna, zat berfluoresensi, logam berat, label
radioaktif / enzim.
 Teknik ini penting untuk
1. Membedakan antara gangguan dgn morfologi yg mirip
2. Mencirikan sifat-sifat molekuler kanker tertentu.
3. Penanda molekuler spesifik karakteristik dari peristiwa seluler
tertentu spt proliferasi atau kematian sel (apoptosis)
4. Penelitian dasar unt memahami distribusi & lokalisasi
biomarker dan protein diferensial

Imunositokimia Imunohistokimia
 Mendeteksi target asam nukleat (DNA/RNA) spesifik yg berada di dalam

sel/jaringan menggunakan pita komplementer DNA/RNA yg di label (probe)

 Prinsip : Penggabungan antara probe dgn sekuens nukleotida komplemennya di

dalam sel/jaringan yg telah difiksasi diikuti dgn visualisasi probe pada lokasi tsb.

 Aplikasi: Mendeteksi gen-gen abnormal, Identifikasi infeksi virus & henotyping

tumor
 Bila probe dilabeli dgn
celupan berpendar teknik ini
disebut FISH.
 Digunakan unt mendeteksi &
melokalisasi ada atau tidak
adanya urutan DNA spesifik pd
kromosom.
 Proses di mana DNA komplementer berlabel atau untai RNA
digunakan unt melokalisasi DNA tertentu atau urutan RNA dlm
spesimen jaringan

 Metodologi CISH dapat digunakan untuk mengevaluasi amplifikasi

gen, gene deletion, translokasi kromosom, dan jumlah kromosom.

 CISH memanfaatkan peroksidase konvensional atau reaksi fosfatase

alkali divisualisasikan di bawah mikroskop standa
Teknologi biologi molekuler  memperbanyak satu/beberapa copy DNA menjadi
beberapa kali lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan copy urutan DNA tertentu.