PEWARNAAN

Annita, S.ST, M. Biomed

 Dasar Hematoxylin dan Eosin
• Pewarnaan yang paling sering digunakan pada pemeriksaan histopatologi
adalah pewarnaan Hematoxylin dan Eosin.
• Hematoxylin berasal dari bahasa Yunani, yaitu haimatodec (darah) dan
xylon (kayu).
• Hematoxylin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan
senyawaan lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga.
• Senyawa hematoxylin yang dipakai adalah bentuk oksidasinya yaitu
hematin.
• Hematin akan mengikat molekul yang bermuatan negatif.
• Material kromatis dalam inti sel bermuatan negatif, sehingga hematin
akan berikatan dengan material kromatis di dalam inti sel.
• Secara sederhana, dapat dijelaskan bahwa kromatin pada inti sel
mempunyai sifat asam dan akan menarik zat warna yang bersifat basa.
 Macam-macam Hematoxylin
a) Hematoxylin Erhlich : Hematoxylin ini dibuat dengan cara pematangan
yang alami yaitu pematangan selama2 bulan. Waktu pematangan bisa
lebih singkat dengan menempatkannya di tempat yang hangat seperti di
jendela-jendela. Setelah pematangan berjalan dengan sempurna, maka
Hematoxylin Erlich dapat digunakan dan dapat mempertahankan
kemampuannya selama beberapa bulan. Hematoxylin Erlich dapat
mewarnai mukupolisakarida pada tulang rawan, sehingga pewarnaan ini
baik digunakan untuk tulang rawan.
b) Hematoxylin Mayer : Hematoxylin ini matang dengan senyawa kimia
yaitu sodium iodat. Hematoxylin mayer paling banyak digunakan dan
memberikan hasil pewarnaan yang jelas. Masa simpannya lama.
Counterstain dari hematoxylin mayer adalah Eosin 0,5-1%.
c) Hematoxylin Harris : Hematoxylin ini matang secara kimiawi dengan
oksidas merkuri. Namun oksida merkuri ini sangat beracun, tidak ramah
lingkungan dan memiliki efek panjang yang merugikan, dan bersifat
korosif. Hematoxylin Harris mewarnai inti dengan baik. Counterstainnya
adalah Eosin 0,5-1%.
d) Hematoxylin Cole : Hematoxylin Cole adalah salah satu pewarnaan alum
(tawas), pewarnaan ini matang dengan larutan iodium beralkohol.
e) Hematoxylin Carazzi : Carazzi adalah Hematoxylin alum (tawas) yang
matang secara kimiawi dengan kalium iodat.
f) Hematoxylin Gill
g) Hematoxylin Delafield : Hematoxylin alum yang matang secara alami,
memiliki masa simpan panjang seperti Hematoxylin Ehrlich.
 Diferensiasi
• Proses lainnya dalam pewarnaan H&E adalah diferensiasi.
• Diferensiasi adalah proses penggunaan larutan asam untuk
menghilangkan pewarnaan yang berlebih/dekolorisasi.
• Larutan yang biasa digunakan adalah asam alkohol 1%.
• Larutan ini akan meningkatkan konsentrasi dari H+.
• Pada proses diferensiasi akan dilepas ikatan antara Al3+
dengan jaringan dan ikatan antara Al3+ dengan hematin.
 Bluing
• Bluing diperlukan untuk mengubah pewarnaan inti dari ungu
kemerahan menjadi biru/ungu jernih.
• Agen bluing bersifat basa dengan kisaran pH optimal 7,5-9,0.
• Agen bluing diantaranya adalah Scott’s Tap Water, Ammonia
Water, dan Lithium Carbonate.
• Cara kerja bluing adalah dengan meningkatkan pH,
mengurangi H+ pada larutan yang berefek pada struktur
hematoxylin, dan menghilangkan H+ dari struktur ring.
 Eosin
• Eosin adalah pewarna sintetis yang termasuk golongan xanthene.
• Eosin bersifat asam dan akan mengikat molekul protein yang bermuatan
positif di sitoplasma dan jaringan ikat.
• Eosin adalah counterstain yang dapat mewarnai sitoplasma dan jaringan
ikat menjadi bernuansa merah dan oranye.
• Eosin juga mewarnai inti sel yang telah terwarnai hematoxylin
dari biru menjadi berwarna ungu.
• Eosin yang tersedia dalam bentuk komersial diantaranya
adalah Eosin Y (Eosin berwarna kekuningan dan larut di dalam air) C.I. No.
45380, Etil Eosin (Eosin S, larut dalam alkohol) C.I. No. 45386 dan Eosin B
(Eosin kebiruan, eritrosin B) C.I. No. 45400.
• Namun yang paling banyak digunakan dan digabungkan dengan
Hematoxylin adalah Eosin Y.
Prosedur Pewarnaan HE
 Hasil Pewarnaan
• Nukleus berwarna biru/hitam, sitoplasma berwarna nuansa pink, serat
otot berwarna pink lebih gelap, sel darah merah berwarna oranye/merah,
fibrin berwarna pink gelap.
• Struktur dan substansi selain nukleus mungkin akan terwarnai oleh
Hematoxyilin, seperti hifa jamur, dan endapan kalsium yang sering kali
berwarna hitam/biru.
 Kontrol Kualitas Pewarnaan
Beberapa pedoman umum yang dapat dipakai untuk menilai kualitas H&E
adalah sebagai berikut:
1. Nukleus: zat warna dapat mewarnai nukleus menjadi biru dan dapat
menunjukkan membran nukleus, nukleoli, kromatin, dan nukleus yang
vakuolar dan hiperkromatis.
2. Sitoplasma dan subtansi dasar lainnya: dapat mewarnai dan
membedakan sitoplasma, kolagen, otot, eritrosit, sel darah merah dan
mucin dengan nuansa warna kemerahan.
3. Pada potongan usus, usus buntu dan paru-paru: dapat mewarnai mucin
pada sel epitel, apakah berwarna biru atau terang tergantung pada pH
dari Hematoxylin. Menurunkan pH biasanya dapat dilakukan dengan
menambahkan asam asetat, hal ini secara signifikan dapat mengurangi
warna mucin.
4. Pewarnaan Hematoxylin yang terlalu teroksidasi akan menimbulkan
warna coklat pada elemen-elemen tertentu pada jaringan.
Teknisi Laboratorium Patologi Anatomi harus bisa membedakan antara serat
otot dan kolagen, otot akan berwarna merah lebih tua dari kolagen. Sel darah
merah harus berwarna merah terang. Penilaian nukleus akan tergantung pada
jenis sel pada jaringan yang diwarnai. Adapun beberapa pedoman kontrol
kualitas harian pewarnaan H&E dapat dilakukan pada organ usus besar
(kolon), kulit dan ginjal.
1. Kolon: dapat membedakan serat otot dan kolagen. Pewarnaan mucin
yang tidak tepat, jika mucin terwarnai biru maka langkah yang dapat
dilakukan adalah menurunkan pH Hematoxylin. Pewarnaan yang jelas
terhadap nukleus sel epitel vesikuler.
2. Kulit: dapat menunjukan butiran keratohialin yang berwarna biru, dapat
membedakan keratin dari kolagen dan saraf, memperlihatkan batas
papiler pada dermis.
3. Ginjal: mengidentifikasi membranbasal dan tubulus kontortus. Ginjal
mempunyai keragaman sel yang luas dari mulai sel yang mempunyai
kromatin padat (glomerulus) hingga sel yang mempunyai kromatin
seperti debu (sel kuboidal di tubulus pengumpul)
Masalah Pewarnaan Hematoxylin
TERIMA KASIH