Pewarnaan HE

Untuk diagnosis rutin, penggunaan Hematoxylin dan Eosin (H&E) jauh lebih disukai untuk
melihat detail struktur seluler dan jaringan oleh ahli patologi. Variasi intensitas pewarnaan
sering didorong oleh pengalaman belajar ahli patologi dan preferensi pribadi. Karena
pewarnaan ini menunjukkan sejumlah besar fitur matriks sitoplasma, nuklir, dan ekstraseluler,
hampir semua teks pengajaran menggunakan gambar H&E. Kami terus menggunakan
pewarnaan sederhana dan esensial ini hari ini, yang tetap tidak berubah selama lebih dari satu
abad.

Gambar 1: Kulit H&E. Perhatikan warna seimbang di bagian kulit ini. Inti berwarna ungu,
sedangkan komponen sitoplasmik berwarna merah muda.

Prosedur pewarnaan untuk H&E mengikuti protokol dasar:

Dewaxing

Dehidrasi

Hematoxylin

Diferensiasi

Kebiruan

Eosin

Dehidrasi

Membersihkan

Tergelincir dari penutup

Formatnya mudah direproduksi dan reagen cukup tangguh untuk memungkinkan sejumlah
besar slide diwarnai secara konsisten sebelum reagen perlu diubah.
Gambar 2: Colon H&E. Perhatikan warna seimbang di bagian usus besar ini. Silia pada epitel
kolumnar sangat renyah. Kredit foto: Stanley Hansen

Di masa lalu, noda dan komponennya secara rutin dibuat oleh laboratorium. Tersedia secara
komersial, reagen premade tidak umum dan mahal. Jadi, sebagai cara ekonomis untuk
melakukan H & Es, para teknisi belajar membuat pewarna sesuai kebutuhan. Tantangannya
adalah memastikan kualitas noda konsisten. Teknisi yang berbeda mengikuti resep
menggunakan pendekatan masing-masing, sehingga membuat pewarna biasanya diserahkan
kepada satu orang. Yang mengatakan, ada juga lebih banyak teknologi di laboratorium,
sehingga waktu yang dibutuhkan untuk
mempersiapkan reagen tidak mengambil dari
keseluruhan beban kerja tim.

Gambar 3: H&E Placenta. Sel darah merah pada bagian plasenta ini mewakili warna cerah yang
mungkin dialami dengan pewarnaan sederhana ini.

Banyak laboratorium menemukan memesan noda mereka menjadi cara termudah untuk
memastikan kualitas yang konsisten dan berulang. Berbagai kombinasi kombinasi hematoxylin
dan eosin memberikan kemampuan untuk menyesuaikan hasil yang diinginkan dengan sedikit
kerumitan. Karena semakin banyak teknologi yang pensiun dan perusahaan menjadi lebih
ramping, pengurangan staf membuat penggunaan reagen yang tersedia secara komersial ideal
karena para teknisi lebih mampu fokus pada
penanaman dan pemotongan, yang merupakan
area laboratorium yang menawarkan
otomatisasi paling sedikit.

Gambar 4: Glomerulus (panah merah) dan tubulus (panah biru) H&E. Inti berwarna ungu,
sedangkan komponen sitoplasmik berwarna merah muda.

Bagi para profesional baru yang memasuki bidang histologi, hari-hari membuat reagen dengan
cepat menjadi sesuatu dari masa lalu. Saya menemukan pergeseran ini mungkin bermasalah,
terutama karena beberapa seni yang secara histologis hilang. Salah satu tantangan pribadi saya
ketika bekerja dengan siswa adalah membantu mereka memecahkan masalah kelainan
pewarnaan. Ketika noda dibuat oleh laboratorium, tim belajar dari pengalaman langsung apa
yang terjadi ketika komponen hilang atau ditambahkan secara tidak tepat ke dalam campuran.
Perubahan-perubahan ini dapat membuat perubahan halus pada slide bernoda, yang akhirnya
diharapkan diperbaiki oleh tim histologi. Pada akhirnya, tim histologi yang lebih baru dapat
berjuang ketika memecahkan masalah perubahan halus yang dapat dengan mudah diperbaiki,
tanpa memiliki pengalaman membuat reagen dan pelajaran yang dipetik dalam proses itu.

Apa yang ada di H&E Stain?

Pewarnaan hematoxylin dan Eosin digunakan di banyak area laboratorium histologi, termasuk
bagian beku , aspirasi jarum halus, dan jaringan tertanam parafin. Untuk lebih memahami apa
yang membuat slide bernoda dengan baik, penting untuk memahami komponen noda.

Hematoxylin digunakan untuk menggambarkan detail nuklir dalam sel. Tingkatan warna tidak
hanya terkait dengan jumlah DNA dalam nuklei, tetapi juga dengan lamanya waktu sampel
dihabiskan dalam hematoxylin.
Hematoxylin adalah pewarna yang cukup sederhana untuk dibuat. Pewarna itu sendiri
diekstraksi dari pohon Hematoxylon
campechianum. Oksidasi hematoksilin
menghasilkan hematein, yang
merupakan pewarna aktual yang
digunakan dalam pewarnaan H&E.
Penambahan mordan meningkatkan
kemampuan hematein untuk
menempel pada komponen anionik (bermuatan negatif) dari jaringan.

Gambar 5: Pada gambar medublastoma anaplastik sel besar ini, hematoksilin memainkan peran
kunci dalam diagnosis. Perhatikan angka mitosis, yang menunjukkan tumor yang tumbuh cepat.
Ketidakteraturan nuklear dan penggumpalan kromatin juga dicatat dalam sel. Kredit
foto:Frontalcortex.com

Hematoksilin biasanya diklasifikasikan oleh mordan yang digunakan sebelum pewarnaan.

Mordan memperkuat muatan ion positif dari hematin. Ini membantu pengikatan hematin ke
komponen jaringan anionik, yang paling umum adalah kromatin. Jenis mordan juga
mempengaruhi warna akhir dari komponen yang diwarnai. Mordan yang paling umum
digunakan dalam histologi rutin adalah aluminium amonium sulfat (tawas). Mordan ini
menyebabkan nuklei berwarna merah, yang kemudian diubah menjadi warna biru yang lebih
akrab ketika sampel kemudian dibilas dengan larutan basa lemah.

Hematoksilin Mayer adalah hematoklin tawas, pewarnaan yang umum digunakan yang dapat
digunakan untuk pewarnaan progresif dan regresif. Ini sering digunakan sebagai counterstain
nuklir untuk pewarnaan khusus dan imunohistokimia . Untuk aplikasi ini, Mayer digunakan
untuk menodai nuklei dan kemudian dikeluarkan tanpa menggunakan pembeda. Mayer adalah
noda berbasis air.

Hematoksilin Harris adalah hematoklin tawas yang biasa digunakan lainnya yang dapat
digunakan untuk pewarnaan progresif spesimen sitologi, tetapi juga dapat digunakan untuk
pewarnaan progresif atau regresif dalam histologi. Pewarnaan cenderung memberikan detail
nuklir yang jelas. Salah satu tantangan ketika menggunakan Harris adalah yang terbaik
dibedakan dengan asam ringan, berbeda dengan pembeda berbasis asam klorida yang lebih
umum digunakan. Harris adalah noda berbasis alkohol. Hematoksilin Gill adalah alum
hematoksilin. Ini dapat digunakan sebagai pewarnaan progresif atau regresif dan tersedia
dalam konsentrasi yang berbeda. Karena dibuat dengan air dan etilen glikol, oksidasi otomatis
pada noda biasanya dicegah selama berbulan-bulan, menjadikannya lebih stabil daripada
hematoxylin Harris. Namun, sifat Insang sedemikian
sehingga pewarnaan ekstra-nuklir dapat
terjadi.Mucin dan bahkan perekat yang digunakan
pada slide dapat menjadi sangat terkontaminasi
dengan Insang.

Hematoksilin yang menggunakan garam besi

sebagai mordan biasanya digunakan dalam
pewarnaan khusus. Ini karena mereka dapat menunjukkan lebih banyak struktur jaringan
daripada tawas hematoksin, seperti serat mielin dan elastin. Salah satu yang paling dikenal
adalah Weigert's, yang digunakan dalam pewarnaan Verhoff-Van Gieson, yang ditunjukkan
pada gambar.

Gambar 6: Perhatikan serat elastin di aorta yang diwarnai dengan Verhoff-Van Gieson, alias
pewarnaan elastis. Perubahan serat ini menunjukkan proses penyakit yang mungkin tidak
terdeteksi. Foto kredit: Stanley Hansen

Setelah meninjau noda nuklir, mari kita bicara tentang pewarna komponen sitoplasma. Eosin
adalah counterstain yang paling umum digunakan yang membedakan antara sitoplasma dan inti
 sel. Biasanya berwarna merah muda,
dengan nuansa merah muda yang
berbeda untuk berbagai jenis serat
jaringan ikat.

Eosin Y adalah bentuk eosin yang

paling umum digunakan dan dapat
digunakan dalam air dan alkohol.
Penambahan sedikit asam asetat juga
akan mempertajam pewarnaan
eosin. Eosin dengan phloxine
ditambahkan akan meningkatkan
warna merah yang terlihat dengan pewarnaan H&E. Jadi, bagi mereka yang ingin melihat warna
merah yang lebih kaya, phloxine dapat ditambahkan.

Gambar 7: Inti pada gambar ini memiliki kontras yang bagus dengan sitoplasma dan sel darah
merah (RBC) di dalam pembuluh darah. Perhatikan intensitas sel darah merah dibandingkan
dengan warna merah muda dari sitoplasma sel di sekitarnya.
Banyak laboratorium menemukan memesan noda mereka menjadi cara termudah untuk
memastikan kualitas yang konsisten dan berulang. Berbagai kombinasi kombinasi hematoxylin
dan eosin memberikan kemampuan untuk menyesuaikan hasil yang diinginkan dengan sedikit
kerumitan. Karena semakin banyak teknologi yang pensiun dan perusahaan menjadi lebih
ramping, pengurangan staf membuat penggunaan reagen yang tersedia secara komersial ideal
karena para teknisi lebih mampu fokus pada penanaman dan pemotongan, yang merupakan
area laboratorium yang menawarkan otomatisasi paling sedikit.

Campuran eosin lain kadang-kadang digunakan, seperti EA50 dan EA65. Noda ini terutama
digunakan untuk sitologi, dan selain eosin Y, termasuk hijau muda, kekuningan, dan coklat
Bismarck. Penambahan kedua pewarna ini memberikan variasi warna dari biru pucat ke
sitoplasma merah muda, paling baik dicatat dalam sel skuamosa pap smear. Konsentrasi
campuran menentukan penetapan 50 atau 65.

Gambar 8: Pada gambar ini dari pap smear dengan pasien yang menunjukkan karsinoma sel
skuamosa, keindahan warna sitoplasma yang bervariasi dapat dihargai. Panah merah
menunjukkan inti ganas dengan sitoplasma yang sangat sedikit. Panah hitam menggambarkan
sel inflamasi akut yang normal, ukurannya sama dengan sel darah merah pada gambar
sebelumnya. Perhatikan seberapa besar sel ganas dibandingkan dengan nuklei normal pada
gambar sebelumnya.

Diferensiasi noda
memungkinkan kemampuan
untuk secara selektif
menghilangkan noda dari
jaringan sesuai selera
pemirsa. Dalam kasus
hematoxylin, asam
hidroklorat (untuk diferensiasi
cepat) dan asam asetat (untuk
diferensiasi yang lebih lambat dan lebih terkontrol) paling umum digunakan. Sementara asam
klorida (HCl) secara historis telah menjadi standar, asam yang lebih ringan digunakan untuk
memberikan penghilangan zat warna yang lebih lembut. Bagian dari tren ini adalah karena
penggunaan pewarnaan otomatis, yang harus mengakomodasi pergerakan lengan robot selain
waktu yang dihabiskan dalam reagen

Pereaksi kebiruan, seperti Scott's Tap Water, digunakan untuk mengubah hematoxylin dari
merah menjadi warna biru tradisional yang kita harapkan. Solusi yang sedikit mendasar ini
mengubah secara kimia pewarna untuk menghasilkan perubahan warna ini. Di beberapa lokasi,
air ledeng mengandung cukup mineral yang menyebabkan pH air menjadi cukup mendasar
untuk memungkinkan kebiruan nuklei tanpa perlu reagen khusus kebiruan. Namun dalam
kebanyakan kasus, lab biasanya menambahkan langkah ini untuk memastikan kebiruan yang
sesuai.

Secara kombinasi, komponen-komponen ini membentuk noda standar yang paling banyak
digunakan di laboratorium histologi.

H&E Seleksi Protokol Noda

Langkah selanjutnya untuk memiliki noda yang bagus adalah menentukan jenis noda H&E apa
yang diinginkan. Biasanya ada 3 jenis noda H&E: progresif, modifikasi progresif, dan regresif.

Pewarnaan progresif terjadi ketika hematoxylin ditambahkan ke jaringan tanpa diikuti oleh
pembeda untuk menghilangkan pewarna berlebih. Karena tidak ada langkah diferensiasi,
pewarnaan latar dapat terjadi-terutama dengan slide yang diisi atau dirawat. Patolog kadang-
kadang lebih suka pewarnaan jenis ini, karena bahan non-seluler, seperti musin, menjadi
ternoda oleh hematoxylin. Pewarnaan ekstraseluler ini bisa menjadi indikator tumor yang
terdiferensiasi dengan baik.

Gambar 9: Pada bagian usus besar ini, musin masih terlihat dengan sel piala.

Tabel: Protokol ini adalah

pewarnaan regresif sederhana
yang memberikan
keseimbangan yang bagus antara noda nuklir dan sitoplasma. Protokol ini dirancang dengan
pembeda asam ringan.

Setelah komponen pewarnaan telah dipilih, ada baiknya memulai dengan protokol dasar. Dari
sana, edit hematoxylin dalam peningkatan 30 detik ATAU eosin dalam peningkatan 15 detik.
Ingat, eosin akan cenderung menembus jauh lebih cepat. Kecuali jika ada kebutuhan untuk
secara signifikan mencerahkan atau menggelapkan intensitas pewarnaan eosin, kenaikan yang
lebih pendek adalah yang terbaik. Penting juga bahwa hanya satu noda yang diubah pada satu
waktu. Tampaknya hematoksilin terlalu berlebihan, ketika eosin hanya perlu lebih kaya.

Ketika laboratorium terus tumbuh, kebutuhan akan hasil yang konsisten dan hasil yang
berkelanjutan sangat penting. Reproduksibilitas adalah bagian penting dari kualitas noda
laboratorium. Saat pewarnaan tangan, variabel manusia dapat membuat setiap rak slide
bernoda terlihat berbeda dari yang terakhir. Penambahan otomatisasi tidak hanya
menghilangkan potensi ketidakkonsistenan, tetapi juga membebaskan teknologi untuk
melakukan tugas-tugas lain di laboratorium.

Penting agar keseimbangan zat warna tercapai. Berlebih-lebihan dengan hematoxylin dapat
memberikan ilusi eosin yang kurang diwarnai, seperti halnya overstaining dengan eosin dapat
menyebabkan hematoxylin tampak lebih ringan daripada yang sebenarnya. Jadi, ketika
mengoptimalkan noda, pastikan untuk hanya mengedit waktu salah satu komponen. Teknik ini
akan membantu menghilangkan kebutuhan untuk menghabiskan waktu tambahan
menyesuaikan noda.

Gbr.10: Pada gambar ini, nuklei dalam sampel kolon ini tampaknya membanjiri komponen
seluler lainnya. Bahkan sel darah merah tampak diredam. Lebih sedikit waktu dalam
hematoxylin ATAU waktu tambahan dalam eosin dapat memberikan keseimbangan yang lebih
baik.
Gambar 11: Nuklei pada bagian ginjal ini hilang dalam warna merah muda eosin. Waktu
tambahan dalam hematoxylin akan membuat inti ini lebih mudah dilihat.

Dengan pewarnaan progresif regresif dan modifikasi, pembeda digunakan. Jika pembeda dibuat
in-house, ada potensi untuk menjadi terlalu lemah atau terlalu kuat. Kedua skenario akan
berdampak pewarnaan. Jika pembeda lebih kuat dari yang dimaksudkan, itu akan
menghilangkan lebih banyak hematoxylin dan akan membuat inti pucat. Waktu juga penting.
Terlalu banyak waktu dalam pembeda yang disiapkan dengan baik juga akan menghilangkan
lebih banyak hematoxylin dan akhirnya akan menodai inti.

Keasaman ringan sangat penting untuk kehidupan hematoxylin. Tanpanya, alkalinitas bilasan air
ledeng akan meningkatkan pH sehingga danau pewarna dapat mengendap, dan warnanya akan
berubah dari merah ceri menjadi merah ungu. Menambahkan sedikit asam asetat ke
hematoklin secara berkala akan membantu mempertahankan pH yang sesuai dan dapat
memperpanjang masa pakai noda.

Air digunakan sebagai pembeda untuk eosin. Adalah umum untuk mengikuti langkah eosin
dengan etanol 95%. Alat bantu etanol dengan membilas slide, sementara air menarik kelebihan
eosin dari jaringan. Langkah ini dapat membantu dengan kontrol warna tetapi memperpanjang
waktu memberikan pewarnaan yang lebih ringan, sementara memperpendek waktu
mempertahankan pewarnaan yang lebih cerah. Namun, kelebihan air dalam xylene dapat
melanjutkan proses diferensiasi dan dapat dilihat setelah tutupan sebagai kabut merah muda
pada slide.

Tidak semua jaringan diciptakan sama. Sampel kista dan lemak, bahkan ketika diproses dengan
benar, mungkin sangat sulit untuk dilihat secara kasar begitu slide telah ternoda. Sampel-
sampel ini sering memiliki ruang terbuka di mana cairan atau lemak berada di dalam sel, dan
ketipisan dinding sel dapat memberikan tampilan menjadi cahaya ketika pewarnaan hanyalah
sebuah artefak dari jenis jaringan.
Sampel yang sangat seluler (misalnya, amandel, kelenjar getah bening) bisa sangat
memprihatinkan. Ingatlah bahwa limfosit memiliki sedikit sitoplasma dan hampir tidak ada
bahan seluler antara sel dengan jaringan lainnya. Untuk alasan ini, hematoxylin tidak harus
bersaing dengan eosin. Sifat sel yang
kompak juga mengkonsentrasikan DNA,
membuat jaringan yang sangat seluler ini
tampak terlalu berlebihan, padahal pada
kenyataannya, mereka mungkin hanya
perlu dipotong lebih tipis.

Gbr. 12: Kelenjar getah bening

Gambar. 13: Ginjal - Catat perbedaan antara bagian kelenjar getah bening dan ginjal ini,
keduanya terbagi pada 4 um. Sampel-sampel ini, diwarnai dengan protokol yang sama, sangat
berbeda dalam penampilan karena seluler.

Penggunaan reagen dewaxing bersih dan segar sangat penting untuk menghilangkan parafin
dari slide sebelum penambahan pewarna. Sementara xylene adalah pelarut yang paling umum
digunakan, pengganti xylene semakin populer karena mereka dianggap kurang berbahaya dan
lebih ramah lingkungan. Air dalam pelarut, baik dari kontaminasi reagen atau lingkungan
dengan kelembaban tinggi, mengurangi kemampuan pelarut untuk menghilangkan parafin.
Parafin yang tersisa mencegah pewarna menembus jaringan, sehingga memberikan tampilan
yang tidak rata.

Cara paling sederhana untuk mencegah hal ini terjadi adalah dengan mengganti reagen lebih
sering. Menambahkan sejumlah kecil pelet pengering (sekitar satu sendok makan per bejana
reagen) juga akan mengurangi kontaminasi air dalam pelarut. Langkah-langkah ini sangat
penting ketika menggunakan pengganti xylene, karena reagen ini cenderung jauh lebih toleran
terhadap kontaminasi air daripada xylene.

Panduan Langkah demi Langkah untuk Melakukan Noda H&E

Pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E) adalah pewarnaan yang paling banyak digunakan di
laboratorium histologi dan histopatologi. Ketika dilakukan dengan benar, ia memiliki
kemampuan untuk menunjukkan berbagai komponen sel dan jaringan yang normal dan
abnormal, namun pewarnaannya relatif sederhana untuk dilakukan pada bagian parafin atau
beku. Dalam histopatologi, sebagian besar kasus dapat didiagnosis oleh ahli patologi yang
berpengalaman menggunakan pewarnaan H&E saja.

Sejumlah kecil slide dapat secara efektif diwarnai secara manual saat berada di laboratorium
yang memiliki throughput tinggi. Ini dapat dilakukan dengan sukses dan konsisten oleh
penghapus slide otomatis.

Ada sejumlah formulasi hematoxylin dan eosin yang berbeda dalam penggunaan populer,
masing-masing dengan berbagai kelebihan dan kekurangan. Beberapa laboratorium lebih suka
menyiapkan solusi sendiri sementara yang lain memilih produk komersial yang siap pakai.