Resume sitohistoteknologi dosen tamu

Definisi dari histologi molekuler

Ilmu yang menyatukan metode bio;ogi molekuler untuk mengidentifikasi atau
mengetahui keberadaan dan fungsi molekul dalam jaringan. Beberapa teknik pemeriksaannya
yaitu dengan imunohistokimia atau hibridisasi in situ.
Lalu, apa bedanya histologi konvensional dan molekuler, perbedaannya yaitu pada
konvensional menitikberatkan pada morfologi sel yang ada di dalam jaringan, nah untuk
histologi molekuler ada di dalam jaringan yang mana pemeriksaan ini digunakan untuk
melihat progres perkembangan dan juga peristiwa biologi pada tingkat molekuler yang terjadi
di dalam jaringan. Misalnya, proses-proses tersebut pada kejadian fisiologi atau juga pada
etiologi suatu penyakit, misalnya kanker. Nah biasanya baik ini terkait dengan fisiologi
maupun penyakit biasanya digunakan untuk meningkatkan deteksi lalu kemudian
kemampuan diagnosis dan juga nantinya mungkin molekul-molekul tersebut bisa digunakan
untuk mencegah progres penyakit misalnya, dan menjadi target untuk terapi contohnya.
Kalau kita bicara biologi molekuler biasanya tidak lepas yang akan kita pelajari itu
adalah DNA, RNA kemudian protein, kemudian bagaimana interaksi diantara molekul-
molekul tersebut dan juga bagaimana regulasi atau pengaturan interaksi tersebut di dalam
suatu sel atau di dalam suatu jaringan,
Jika dilihat dari gambar ini, jika kita lihat dari histologi konvensional kita hanya
melihat sel kemudian morfologinya kemudian nukleusnya ukurannya masih sama atau tidak,
bentuknya bagaimana, sel juga demikian, ukurannya lalu bentuknya. Nah sedangkan pada
histologi molekuler kita melihat lebih dalam lagi, yaitu isi dari sel-sel tersebut bisa mulai dari
organelanya misalnya atau apa yang ada di dalam nukleus, lalu kemudian yang ada di dalam
nukleus itu kita kupas lagi, misalnya kromosomnya, lalu kromosom itu kalau misalnya kita
uraikan disana ada DNA. Nah kemudia kalau kita ingat dogma central biology, bahwa nanti
dari DNA itu nanti ketika suatu gen, jadi DNA itu terdiri dari gen , ketika dia mau digunakan
atau dimanfaatkan oleh sel maka harus diubah atau diekspresikan, nah bentuk antaranya yaitu
RNA. Jadi ekspresi pada level RNA, lalu kemudian ekspresi lagi pada level protein, nah ini
yang dipelajari pada biologi molekuler dan juga dalam hal ini dalam histologi molekuler.
Nah kalau kita lihat, ini adalah metode metode yang digunakan pada teknik biologi
molekuler, jadi tadi sudah saya sampaikan yang diperiksa bisa jadi adalah DNA nya, bisa jadi
RNA nya, bisa jadi proteinnya, dengan berbagai macam metode yang bisa menggunakan
PCR, bisa kalau RNA menggunakan Revers Transkrip-PCR, kemudia kalau protein bisa
menggunakan imunohistokimia maupun metode yang lain misalnya SDS page, elektroforesis
dengan menggunakan SDS page lalu menggunakan metode immunogloteng misalnya. Yang
sebelah kanan ini tidak saya kotakin, karena di sini kita lebih melihat pada reaksi respon imun
yang ini tidak disinggung biasanya pada tehnik biologi molekuler.
Kalau kita lihat yang saya kotakin ini, ketika kita mempelajari mengenai DNA
biasanya kita lihat itu apakah gennya ada, kemudian apakah gen itu mengalami perubahan
misalnya apakah ada polimorsisme atau misalnya apakah ada mutasi misalnya. Kemudian
pada level RNA, kita melihat apakah ada ekspresi di level RNA, itu bisa kita lakukan baik
secara kualitatif dan juga kuantitatif. Lalu kemudian, level berikutnya yaitu pemeriksaan
protein, disini kita bisa melihat apakah ada protein fungsionalpada suatu kejadian, misalnya
kejadian fisiologis, harusnya proteinnya ada, kemudian kita periksa, ohhh ternyata proteinnya
tidak ada, oleh karena itu diketahui ooohhhh makanya ini menyebabkan suatu penyakit,
misalnya demikian.
Nah ini ada suatu contoh ya, contoh misalnya pada kejadian kanker nasofaring.
Kanker nasofaring itu adalah kanker tenggorikan di area nasofaring khususnya, jadi di
belakang hidung sana, di daerah tenggorokan. Nah kanker ini terjadi dengan melibatkan
adanya infeksi virus Epstein-Barr atau virus EBV. Nah kita disini membandingkan antara
pemeriksaan histologipatologi konvensional dan juga pemeriksaan histopatologi molekuler.
Pada pemeriksaan histopatologi konvensional yang dilihat disini hanya morfologi sel-
sel pada area tumor, dari situ nanti kita bisa menentukan tipe tumornya apa, oohhhh sel
selnya ternyata tidak terdeferensiasi, trus kemudian tidak ada keratin, sehingga disini
diketahui tipenya tidak terkeratinisasi dan kemudian disini juga kelihatan nukleus nukleusnya
sudah tidak beraturan bentuknya, makanya disini kita bisa menyampaikan bahwa ini adalah
tidak terdeferensiasi. Nah namun pada pemeriksaan dengan menggunakan histopatologi
molekuler ternyata lebih banyak lagi yang bisa diperiksa, contohnya disini kita bisa
memeriksa penanda penanda kanker ya, trus kita bisa memeriksa karena tadi ada keterlibatan
EBV kita bisa melihat apakah ada protein EBV yang terekspresi pada jaringan tubuh tumor
ya ini bisa diperiksa contohnya misalnya dengan imunohisokimia atau tadi misalnya saya
sampaikan bisa diperiksa dengan menggunakan immunoglotein misalnya. Kemudian bisa
dilihat ekspresi RNA EBV nya apakah ada atau tidak, ini bisa diperiksa dengan hibridisasi in
situ, lalu kemudian bisa juga misalnya kita mau memeriksa DNA EBV nya misalnya dari segi
jumlah, jumlahnya ternyata pada pasien A dan B dengan keparahan yang berbeda misalnya
oooo ternyata jumlah DNA EBV nya berbeda, lalu kemudia misalnya bisa juga diperiksa
oooo ternyata pasien emplisi dari negara di Indonesia misalnya dengan yang terjadi di Eropa
misalnya ya, oooo ternyata urutan basa DNA EBV nya itu berbeda, ada perbedaan misalnya,
ooo ternyata demikian. Nah ini bisa diketahui dari pemeriksaan histologi molekuler sehingga
kita bisa mendapatkan informasi yang lebih tidak hanya dari morfologinya saja.
Nah tehnik utama pada histologi molekuler itu yang sering dilakukan adalah
pemeriksaan molekul secara in situ. Secara in situ itu artinya dilakukan langsung pada
jaringan tumornya, nah ini yang banyak digunakan metodenya adalah imunohistokimia ya
untuk memeriksa protein lalu kemudia untuk memeriksa asam nukleat bisa menggunakan
hibridisasi insitu yang bisa digunakan untuk memeriksaan DNA dan RNA. Yang lebih
berkembang adalah yang hidtologi molekuler yang bisa mengambil molekul yang ada di
dalam jaringan tsbt misal protein dna rna yang dipisahkan dari jaringannya untuk dilaukan
peemriksaan baik itu karakteristik2 ataupun maupun molekul2 lain yang terlibat entah itu
fisiologis maupun atologis.
Kemudian ada pedukung lainnya menggunakan atau menumbuhkan sel di luar
jaringan nya yaitu dengan tehnik kultur sel. Nah ini yang akan kita bahas disini adalah poin
isolasi molekul dari sel dalam jaringan (protein, DNA, RNA) untuk pengerjaan metode
molekuler, yang akan di titik beratkan pada DNA dan kemudian berikutnya adalah sel kultur.
Imunohistokimia itu digunakan untuk pemeriksaan protein yang ada di dalam sel atau
jaringan secara in situ atau secara langsung pada jaringan, nah metode ini tidak dianggap
sebagai metode molekuler namun metode ini dianggap sebagai metode dasar reaksi antigen
dan antibodi yang mana mendasari tehnik tehnik yang kemudian di kembangkan. Metode ini
yang diperiksa adalah molekul dalam bentuk protein yang ada pada sel atau jaringan
kemudian diperiksa dengan antibodi yang spesifik terhadap proteinnya tersebut kemudian
dikenali lagi dengan antibodi sekunder yang mengenali antobodi primer atau antibodi yang
pertama, dimana antibodi yang kedua atau sekunder ini sudah di konugasi atau di ling dengan
contonya dengan enzim bisa peroksidase atau alkalin fosfatase, kemudia akan diberikan
warna yang sudah ditambahi substrat dari enzimnya sehingga terjadi perubahan warna. Nah
di area yang terjadi ikatan itu terjadi perubahan warna sehingga diketahui bahwa pada area
tersebut itu ada atau mengandung protein yang kita periksa.
Hibridisasi in situ yang diperiksa adalah asan nukleat yang langsung diperiksa pada
jaringan. Pada hibridisasi insitu yang digunakan itu bukan antibodi, tetapi sebetulnya kalau
kita lihat prinsip pengerjaannya itu juga seperti reaksi antigen antibodi hanya disini yang kita
gunakan itu disebut dengan probe. Probe adalah suatu sequence pendek dari basa nukleotida,
bisa probe itu dari berupa DNA probe, atau bisa juga RNA probe atau bisa juga probe yang
sifatnya sintetik. Probe ini yang pendek tadi, kita gunakan untuk memeriksa daerah target pd
suat gen atau mungkin di dalam kromoson tetapi langsung kita kerjakan pada jaringannya.
Syaratnya lihatpada gambar dmana probenya pada awalnya ini DNA probe ya, probe yang
dibuat dari DNA, dipotong, hanya pendek, lalu kemudian probe nya dilabel, nah disini karena
flouresence insitu hibridisation jadi labelnya dengan flouresence. Nah setelah itu syarat dari
pengerjaan hibridisasi insitu adalah denaturasi. Yang denaturasi siapa? Kalau dia DNA probe
katakanlah double stranded dalam hal ini yang dicontohkan disini double stranded DNA
probe, maka DNA probenya harus di denaturasi. Selain itu, target yang akan dikenali oleh
probenya juga harus didenaturasi. Gambar disini terlihat DNA pada jaringannya di denaturasi
nanti bakal di kenali oleh probe yang sudah di denaturasi, pengenalan ini yang dinamakan
dengan hibridisasi, syarat hibridisasi adalah dilakukan pada suhu tertentu, jika hibridisasi
sudah terjadi maka nanti pada area yang dikenali, yang gennya tadi atau area targetnya
dikenali oleh probenya, disitu, karena disini tadi labelnya pake flouresence, maka akan
nampak disini ada pendaran flouresence sesuai dengan warna flouresence yang digunakan.
Nah ini nanti diperiksa di bawah atau menggunakan mikroskop flouresence.
Yang akan kita pelajari hari ini adalah memeriksa molekul (DNA, RNA, Protein)
yang akan berfokus pada pemeriksaan DNA yang diisolasi dari sediaan histologi. RNA itu
tidak terlalu baik apabila jaringan histologinya yang kita gunakan adalah jaringan histologi
yang sudah di proses dengan parafin. Untuk pemeriksaan RNA yang baik adalah
menggunakan frozen section atau potongan beku, atau jaringan yang dipotong beku. Untuk
DNA dan Protein masih baik jika dilakukan pada potongan parafin.
Tujuan dari isolasi atau memisahkan molekul yang akan diperiksa dari preparat
histologi, disini karena biasanya nanti kita akan mengidentifikasi marker-marker, penanda-
penanda atau molekul yang lebih spesifik yang ada di dalam misalnya baik itu DNA, RNA
maupun pada protein misalnya. Contohnya disini kita akan melihat atau menidentifikasi gen.
Ada tidak gen tertentu atau misalnya gen B53 pada kejadian kanker payudara misalnya,
kemudian kita ingin melihat ekspresi gennya, baik kita lihat misalnya pada level RNA, berarti
yang diisolasi adalah RNAnya atau mungkin ekspresinya akan kita lihat pada level protein,
maka kita isolasi proteinnya, nah kemudian kalau tadi kita lihat gen B53, kita mau
membandingnkan nih antara orang yang sehat dan orang yang kanker payudara, gen B53 nya
apakah pada orang sehat itu normal, sedangkan pada yang kanker payudaya ada mutasi
misalnya, nah itu juga bisa diperiksa apabila kita memisahkan atau mengisolasi molekul-
molekul tersebut dari jaringan histologinya. Kita bisa melihat penanda-penanda tadi misalnya
keterlibatannya pada etiologi atau kejadian penyakit, nah bisa juga ini memberikan
kemanfaatan diagnosis yang lebih dibandingkan kalau kita hanya melihat morfologinya, atau
juga kedepannya misalnya ooohhh untuk mengembangkan terapi dan lain lain, jadi banyak
yang bisa dilakukan dengan mempelajari.........
DNA nya kita rancang untuk melihat gen spesifik, misalnya gen B53, nah itu kita
lakukan misalnya PCR dengan menggunakan primer spesifik gen B53. Kemudian lanjutkan,
karena yang ingin dilihat misalnya ada mutasi atau tidak,kita ingin melihat pada gen B53 itu
ada perubahan sequence basa nukleotidanya tidak? Nah itu nanti kita bandingkan pada
dengan sequnce yang normal yang ada pada .............. genomnya. Kita sudah lebih maju lagi,
spesifik, sekarang yang akan kita bicarakan, mengenai isolasi DNA ya. Kalau isolasi DNA itu
yaitu pemisahan DNA dari dalam sel, bisa sel apa saja, kita mau mengisolasi DNA sel
bakteri, nah kita mau mengisolasi DNA dari sel tumbuhan bisa, kita mau mengisolasi DNA
dari sel manusia juga bisa atau misalnya DNA dari virus juga bisa. Ini dipisahkan dari apa?
Ini dipisahkan dari komponen lain yang ada di dalam sel, misalnya dipisahkan dari RNA nya,
dipisahkan dari proteinnya, dipisahkan dari lipid yang ada di dalam sel. Nah isolasi DNA
dalam hal ini kita bicarakan adalah DNA dari manusia yang ini misalnya kita dapatkan dari
sampel klinis, bisa dilakukan pada sampel apa saja, diantaranya adalah kita bisa mengisolasi
DNA dari sampel darah. Nah kita juga bisa mengisolasi DNA dari jaringan yang sudah di
buat blok parafin, nah kita juga bisa mengisolasi DNA dari jaringan segar. Yang akan kita
bicarakan hari ini nanti adalah isolasi DNA dari jaringan parafin. Untuk jaringan segar
umumnya prosesnya sama, hanya pada jaringan segar tidak diperlukan langkah
deparafinisasi, kalau pada jaringan yang sudah di buat parafin perlu dilakukan deparafinisasi
untuk menghilangkan parafinnya, bedanya. Tetapi langkah utama atau apa yang harus selalu
di jalankan pada waktu kita melakukan isolasi DNA, yaitu
1. Melisiskan sel. Sel apa? Karena kita mau mengisolasi DNA yang ada di dalam sel,
maka membran sel nya harus di lisiskan, kemudian membran nukleusnya dari sel juga
harus di lisiskan. Kemudian reaksinya apa di sana?
2. Reaksi enzimatik dan kimia untuk menghilangkan protein, RNA dan makromolekul
yang lain.
Karena membran itu terdiri dari lipid, terdiri dari protein, maka nanti kita bisa
melisiskan baik itu dengan cara mekanik atau dengan cara enzimatik dan juga dengan
cara kimiawi. Kimiawi misalnya penggunaan deterjen, enzimatik menggunakan
protease atau proteinase, yaitu enzim yang digunakan untuk memecah proteinnya.
Kemudian setelah itu, jika DNA nya telah dipisahkan dari selnya nanti, untuk proses
selanjutnya dia harus dilarutkan, jadi ada proses
3. melarutkan DNA
 nah secara umum dulu, saya ulangi isolasi DNA dari darah, yang harus selalu kita
ingat bahwa DNA itu hanya terdapat di dalam sel yang mempunyai nukleus karena apa?
DNA itu didalam nukleus kan di kemas di dalam kromosom. Kromosom itu kalau di buka
ikatannya maka itu terdiri dari DNA yang panjang sekali. Yang perlu diingat adalah bahwa
DNA hanya terdapat pada sel yang bernukleus. Jadi misalnya contohnya di dalam sel darah
merah, karena sel darah merah tidak mempunyai nukleus, disana tidak ada DNA. Nah apabila
kita mempunyai sampel darah, kemudian darah tersebut di sentrifugasi atau ditunggu sampai
mengendap, maka akan terjadi 3 endapan: yang paling bawah yang berwarna merah adalah
eritrosit, lalu diantara yang putih yang putih disini ini yang bening ini adalah cairan atau
plasma, kemudian diantara plasma dan juga eritrosit dan sel darah merahnya disini ada
lapisan putih nah ini yang kita sebut dengan bufficoat, nah bufficoat disini ada platelet dan
juga ada sel-sel darah putih, atau leukosit, ini adalah sel yang mempunyai nukleus, jumlahnya
ini dari keseluruhan di dalam darah itu hanya 1%. Nah kita bisa mengisolasi DNA itu dari
leukosit tersebut. Caranya itu: darah di sentrifugasi, kemudian nanti terpisah sel darah
merahnya, kemudian diberi lisis buffer untuk melisiskan sel darah merah, nah setelah itu sel
darah merahnya akan lisis, setelah lisis kemudian dilakukan sentrifugasi, kalau ternyata nanti
di peletnya masih ada yang berwarna merah maka diulang lagi proses melisiskan sel darah
merah ini sampai bersih, nah setelah itu di tambahkan lisis buffer, disini lisis buffernya
sekarang untuk melisiskan leukosit atau sel darah putihnya, fungsinya adalah untuk memecah
leukosit tadi yah dan juga tenu saja nukleusnya agar nanti DNA yang ada di dalam leukosit
atau nukleus leukosit tadi bisa di ambil atau di isolasi, nah kalau sudah diberikan lisis buffer
di tambahkan buffer untuk presifitasi protein ya, disini juga setelah itu nanti di tambahkan
buffer untuk presifitasi DNA atau biasanya presifitasi DNA bisa dengan etano, saja lalu ini
juga sekalian mencuci DNA nya, nah nanti kalau sudah DNA nya itu ditemukan dalam
bentuk pelet yang ada di dasar tabung ya, setelah dihilangkan semua cairannya dikering
anginkan, maka nanti bisa dilarutkan dengan menggunakan, bisa menggunakan air atau bisa
menggunakan contohnya TE Buffer ya.
Nah sekarang bagaimana jika kita mau mengisolasi DNA dari preparat histologi, nah
yang disini saya contohkan adalah kalau preparat tersebut sudah di buat dalam sediaan block
parafin, tentu saja block parafin tersebut di potong potong lalu diletakkan pada slide, nah ini
kalau untuk pemeriksaan histologi biasanya pemotongannya sekitar 3 sampai 5 mikron, nah
tetapi jika untuk pemeriksaan dan akan diisolasi DNA nya nanti bisa sampai dengan 10
mikron juga tidak papa. Jadi slide histologi ini, parafin ini bisa langsung dari slide parafin
tersebut tentu saja yang belum diwarnai langsung dikerok lalu dimasukkan di dalam tabung
microcup. Nah itu kalau tidak ada, menurut protocolnya menurut prosedurnya kita tidak perlu
memisahkan bagian tertentu ya, atau misalnya jika pada kanker memisahkan area yang
mengandung tumor dan area yang normal, kalau tidak diperlukan itu, kita bisa langsung
mengerok semuanya. Nah tapi ada pemeriksaan untuk kaker-kanker tertentu yang harus
diambil itu hanya aarea yang ada sel tumornya saja, nah kalau syaratnya demikian kita harus
melakukan yang namanya anotasi, nah anotasi itu bagaimana? Ini jadi kita misalnya punya 10
potong yang berdempetan karena nanti yang mau diisolasi misalnya 6 slide, nah salah satu
potongan tersebut, diwarnai dengan HE lalu kita periksa di bawah mikroskop. Nah biasanya
untuk menentukan mana area tumor, mana bukan, nah ini kita bekerja sama dengan patologi
ya, patologi anatomi. Nah kemudian nanti patologist itu akan menandai area tumor tersebut
nah contohnya ini pada gambar yang tengah disini yang ada tumornya kemudian di tandai
dengan spidol atau marker permanent, nah ternyata ada 4 area. Nah setelah ditandai, nah ini
ditempelkan pada yang tadi, kan kita punya 10 slide yang mau kita pake misalnya 6 untuk di
isolasi, kita tempelkan pada slide yang belum diwarnai, nah itu kita blad/blat area yang
ditandai tadi pada area yang belum d warnai tadi, nah nanti yang dikerok hanya daerah yang
sudah di tandai, itu namanya anotasi, nah itu biasanya dilakukan pada pemeriksaan kanker
dan kalau memang ada syarat harus hanya area tumornya saja yang diambil, nah setelah itu
misalnya ini juga tergantung dari protocolnya mau berapa potong slide yang digunakan, ada
yang menggunakan 6 ada juga yang misalnya 10.
Nah setelah semua di kerok di masukkan ke mikrocup, nah setelah dimasukkan dalam
mikrocup kemudian dilakukan deparafinisasi. Deparafinisasi dilakukan dengan Xylene, nah
nanti setelah deparafinisasi dengan xylen tentunya saja ada proses untuk menghilangkan
xylenenya, nah setelah itu biasanya juga ditambahkan Proteinase, setelah itu jaringan tadi
meskipun sudah di deparafinisasi tapikan jaringannya masih bentuk jaringan yang saling
berikatan dengn yang lain, nah proteinase K disini memang untuk membantu untuk melepas
ikatan ikatan protein yang ada di jaringan tersebut, namun biasanya tidak cukup dengan
hamya menggunakan protein, penghancuran jaringannya juga dilakukan dengan cara mekanik
kalau itu jaringan utuh ya. Kalau slide ini jaringannya kan utuh ya, leh karena itu perlu
dilakukan penghancuran dengan cara mekanik yaitu dengan dihancurkan dengan
homogenizer. Homogenizer ini alat mekanik, gampangannya seperti diulek. Stelah itu nanti
degradasi proteinnya menggunakan proteinase K lagi jadi ini secara enzimatik, nah setelah itu
diinkubasi over night biasanya agar proteinase K nya bekerja dengan baik, semua ikatan
ikatan protein yang ada di dalam jaringan tersebut bisa dilepaskan, nah setelah itu ada
pemisahan protein dengan asam nukleatnya nah ini dilakukan dengan pemberian Phenol-
cloroform. Setelah itu dilakukan presipitasi DNA bisa menggunakan Ammonium Sulfate,
bisa menggunalan Ethanol, bisa menggunakan Glycogen. Setelah dipresipitasi tentu saja nanti
ada pencucian lagi, DNA nya di cuci dengan ethanol sampai bersih lalu kemudian di
sentrifugasi di ambil peletnya, lalu pelet DNA nya itu di larutkan, bisa dengan air, bisa
dengan TE Buffer. Nah ini bisa dilakukan dengan reagen yang kita siapkan sendiri atau bisa
juga sekarang ini sudah banyak KIT KIT untuk isolasi DNA dari block parafin.
Nah jadi prinsipnya ada deparafinisasi dulu kemudian penghancuran jaringan, lalu
melisiskan membrane sel nya dengan proteinase K dengan detergen, detergen yang
digunakan itu misalnya SDS atau misalnya menggunakan ND40 atau juga twin atau traiten.
Kemudian degradasi protein selulernya menggunakan proteinase K lagi. Lalu dilakukan
presipitasi protein dan juga presipitasi DNA, kalau protein dengan garam, DNA dengan
Ethanol. Lalu melarutkan DNA nya, nah sehingga DNA yang telah dilarutkan baik itu dengan
TE Buffer atau air itu sudah siap untuk digunakan untuk proses selanjutnya. Nah DNA itu
jika sudah diisolasi jadi bentuk DNA dia cukup stabil, sehingga bila kita lupa tidak disimpan
di 4 derajat atau minus 20 atau kita diamkan di suhu kamar dia biasanya DNA nya masih
utuh, contohnya setelah isolasi DNA kita mau melakukan eksperimennya itu di kota lain
misalnya, lab nya itu adanya di kota lain misalnya iu juga bisa kita bawa pada suhu kamar
biasa, itu juga tidak papa. Berbeda dengan RNA, kalau RNA itu sangat ringkih sehingga
sangat mudah terdegradasi, nah untuk RNA ini harus terjaga dia harus selalu beku, oleh
karena itu pengerjaan RNA ada step step tambahan dan juag memperlakukan RNA nya
banyak sekali step tambahan.
Setelah kita mendapatkan DNA, sebelum DNA itu digunakan tentu saja kita harus
mengecek kualitasnya. Nah quality control dna hasil isolasi ini yang kita periksa ada 3 yang
penting, yaitu konsentrasinya, nah konsentrasinya bisa kita ukur dengn menggunakan
spektrofotometer atau dengan nanodrop spektrofotometer atau alat sejenisnya pada saat kita
mengukur konsentrasi biasanya kita juga ini sekaligus mengukur kemurnian DNA nya, nah
karena apa? Karena biasanya disini yang kita ukur adalah absorbansi atau optical densitynya
yang nantinya bisa dihitung di konversi jadi konsentrasi, nah untuk mengukur kemurnian
DNA nya kita membandingkan angka OD atau Rasio OD atau absorbansi itu untuk Rasio OD
pada panjang gelombang 260/280 itu untuk melihat adanya kontaminasi protein atau tidak,
nah angkanya kalau bagus itu harus diantara 1,8 sampai 2, jika angkanya memenuhi berarti
tidak ada kontaminasi protein. Nah untuk Rasio OD 260/230 itu untuk mengecek apakah ada
kontaminasi garam sisa phenol atau tidak, angkanya harus diatas 1,8, jika itu semua sudah
terpenuhi maka DNA ini secara kemurniannya sudah terpenuhi. Biasanya kita juga ada syarat
nanti kitab harapannya mendapatkan DNA dengan syarat sekian konsentrasinya atau
misalnya untuk proses selanjutnya konsebtrasi yang dibutuhkannya sekian sehingga tentunya
harus memenuhi konsentrasi tersebut. Nah selain dua hal tersebut yang harus diperiksa adalah
integritas DNA. Nah walaupun tadi disampaikan bahwa DNA itu relatif stabil sehingga
kebanyakan elektroforesis DNA ini hampir semuanya lolos, kalau elektroforesis DNA nanti
gambaran yang didapatkan itu DNA nya akan berhenti di atas seperti ini, jadi yang
didapatkan iu adalah pita yang sangat tebal di bagian atas seperti ini, nah kalau demikian itu
artinya DNA nya baik, tetapi jika di bawah pita ini kemudian anda temukan pita kecil kecil
banyak itu berarti Dna nya terdegradasi. Nah dengan mengecek QC ini, ini harus dipenugii (3
hal tadi) artinya kalau ini tidak dipernuhi DNA yang kita hasilkan tidak bagus, kalau DNA
nya tidak bagus maka proses isolasi harus diulang kembali, kalau yang kurang adalah
kemurniannya saja itu bisa dibersihkan lagi misalnya dengan melakukan presifitasi protein, di
presifitasi lagi dengan protein yaitu dengan garam, nah untuk membersihkan gramnya tentu
saja nanti ada proses pencucian, nah ini masih bisa biasanya, tapi biasanya juga dengan
melakukan pemurnian ini biasanya konsentrasinya menurun, tetapi kalau integritas yang di
dapatkan adalah DNA yang terdegradasi ini yang tidak bisa dihindari artinya harus diulangi
apalagi jika DNA yang diatas ini sudah habis tidak ada pita diatasnya itu dan pita pitanya
terdegradasi di bawah nah itu berarti DNA nya sama sekali tidak bisa digunakan meskipun
anda temukan konsentrasinya cukup tinggi misalnya. Nah dari DNA yang diisolasi tersebut
digunakan untuk apa to?
Ini bisa digunakan untuk deteksi gen, kelainan gen misalnya mutasi atau bisa juga
untuk pemeriksaan Polymorphism misalnya sekarang ini yang juga sangat populer misalnya
kita mau melihat perubahan dari gen yang menyebabkan suatu penyakit dalam sekali
pemeriksaan kita bisa memeriksa sekaligus beberapa gen misalnya dengan Next generation
sequensing, hanya saja untuk next generation sequensing ini dibutuhkan konsentrasi yang
sangat tinggi bisa juga saat ini pemeriksaan dengan menggunakan DNA array, nah DNA
Array ini dapat memeriksa seluruh genome pada manusia kemudian di situ bisa dilihat mana
area area yang nanti mengalami mutasi, biasanya itu untuk skrining dulu dilakukan dengan
array, setelah ditemukan baru nanti secara spesifik gen yang bersangkutan itu diperiksa
mutasinya misalnya demikian.
nah ini adalah simpulan ya untuk metode histologi molekuler ya jadi penggunaan
metode biologi molekuler yang digunakan untuk mengidentifikasi mengetahui fungsi dan
keadaan molekul di dalam jaringan, ini adalah definisi dari histologi molekuler kemudian
pemeriksaan itu dapat bersifat insitu tadi diperiksa langsung pada jaringannya dengan metode
baik itu immunohistokimia kalau itu protein atau hibridisasi in situ kalau itu adalah asam
nukleat atau bisa juga kita mengisolasi atau memisahkan molekul molekul tersebut dari
jaringannya. Nah kemudian ini prinsipnya untuk mengisolasi DNA kemudian setelah di
dapatkan DNA nya maka bisa digunakan untuk pemeriksaan lanjutan mislnya melihat
keberadaan gen, mutasi, polomorpisme, sidik dari DNA dan sebagainya. Dengan
menggunakan berbagai metode yang sudah dipelajari.
Tadi DNA bisa juga diisolasi dari potongan beku atau frozen section, nah prosesnya
hampir sama hanya tanpa deparafinisasi jadi langsung dari homogenasi atau penghancuran
jaringan kemudian reaksi enzimatik menggunakan proteinase untuk melisiskan membran lalu
kemudian dilakukan reaksi enzimatik lain lagi biasanya dengan detergen umtuk melisiskan
membran sel nya sehingga nanti DNA nya dapat diambil, prinsipnya sama, hanya tidak
melakukan deparafinisasi

Pada peemriksaan histologi molekuler kita pasti melakukan kultur sel, nah kadang
kadang belum tentu yang kita perlukan untuk memeriksa itu langsung pada jaringan baik itu
dari manusia maupun dari hewan tetapi untuk mempelajari apa yang terjadi secara biologi
kita bisa melakukan eksperimen secara in vitro yaitu dengan melakukan kultur sel,
contohnya, misalnya kita mau mempelajari mengenai perilaku kanker payudara, sel kanker
payudara kita bisa mempelajari bukan langsung pada sel tumornya ya, kalau jaringan
tumornya itu mungkin sudah mati ya karena sudah diambil dari biopsi atau misalnya kita
menggunakan hewan coba dibuat jadi kanker payudara tapi ketika mempelajari apa yang
terjadi itu kan juga pasti sudah diambil dari hewan coba nya lalu berarti sudah dalam kondisi
jaringan tersebut mati. Nah kalau kita ingin melihat proses pada kondisi sel kankernya masih
kondisi hidup, itu bisa dilakukan dengan cara kultur sel, nah itu mengapa kultur sel juga
penting kalau kita belajar mengenai histologi molekuler.
Kultur sel ini adalah metode memisahkan baik itu sel hewan ya, manusia disini masuk
dalam kategori hewan atau tumbuhan, sel tersebut dipisahkan dari jaringannya lalu
ditumbuhkan pada lingkungan buatan yang sesuai, sel itu diambil dari jaringan atau
dipisahkan dari jaringan itu secara enzimatik atau mekanik, jadi ya itu penghancuran
jaringan, contohnya dari splin atau lien, contohnya dari splin atau lien itu bisa juga dilakukan
penggerusan liennya lalu kemudian setelah itu kita saring yang kita ambil disitu misalnya sel
sel limfosit yang ada pada lien itu pemisahannya biasanya secara mekanik atau bisa juga
pemisahan secara enzimatik sehingga nanti selnya bisa diambil dari jaringan, sudah terpisah
kemudian diambil nah setlah itu ditanam pada medium kultur nah tentu saja kondisinya itu
buatan tapi tentu saja yang sesuai dengan kondisi yang dibutuhkan untuk sel tersebut nah itu
kalau dari hewan atau tumbuhan. Kita juga sering mendengar ada yang namanya sel lain.
Kultur juga bisa dilakukan pada sellain atau sel splin, nah sel lain ini apa? nanti pada bagian
dalam dari uraian ini akan saya sampiakan. Jadi kultur itu bisa diambil langsung dari
tumbuhan atau hewan atau langsung dari jaringan bisa kita mengkultur sel lain.
nah ini sejarahnya ya mulai tahun 1885 mulai dari ohhh ternyata embrio ayam itu bisa
di jaga agar tetap hidup di dalam larutan garam sampai kemudian perjalanan sampai
ditemukan medium yang sesuai, berbagai macam medium yang sesuai dengan berbagai
macam medium yang sesuai dengan berbagai macam sel kemudian sampai kemudian mulai
dari tahun 80 sampai sekarang ini penelitian itu buan dilakukan kalau dulu dilakukan
bagaimana to apakah kultur itu bisa dilakukan, apa kira kira mediumnya, nah sekarang itu
hampir semua sudah ditemukan, yang dilakukan sekarang adalah kita menggunakan metode
kultur untuk mendukung penelitian.
Nah kultur sel pada penelitian itu bisa digunakan untuk berbagai macam, contohnya
kita membuat sistem permodelan, misalnya tadi saya sampiakan oohhhh ingin melihat nih
kalau misalnya pada sel kanker payudara, kalau misalnya dia itu diberi suatu reagen atau
agen yang bisa untuk mencegah pertumbuhannya apa bisa itu terjadi? Nah terus kemudian
bisa juga untuk melakukan uji toksisitas misalnya kita punya suatu bahan yang ini nanti
harapannya bisa digunakan sebagai obat misalnya bahan herbal nah apakah dia mempunyai
kemampuan untuk mencegah pertumbuhan sel misalnya terus kemudian untuk studi virologi
kemudian studi studi kanker kemudian rekayasa genetik trus kemudian mau merancang terapi
gen nah itu biasanya studi awalnya itu dilakukan pada kultur sel. Nah secara umum ya disini
saya bicara mengenai sel hewan, jadi tidak bicara mengenai sel tumbuhan, nah sel hewan
termasuk dalam ini juga sel manusia.
nah ada 3 jenis sel pada kultur sel berdasarkan morfologinya, ada jenis yang disebut
dengan fibroblastic (fibroblast-like) sel ini sifatnya bipolar atau multipolar, bipolar artinya dia
mempunyai fisik contohnya apikal sama basal, atau kalau multipolar berarti ada apikal ada
basal ada lateral, nah jadi ada atas, bawah, kanan kiri, kalau bipolar hanya atas bawah
misalnya. Nah untuk selnya biasanya memanjang, ini jadi kalau digambar ini yang paling
atas, sel yang sifatnya fibroblastic atau fibroblast-like ini biasanya dia tumbuh melekat pada
substrat (yang dikatakan dalam literatur) kalau saya katakan ini melekat pada plate atau
plastik dimana dia di tumbuhkan atau botolnya. Nah yang berikutnya adalah Epithelial-like,
nah bentuknya ini poligonal, poligonal itu dia bentuknya misalnya heksagonal, dimensinya
lebih teratur biasanya terus dia tumbuhnya juga melekat pada substrat atau adern juga pada
botol atau plate nya tapi dia dalam kumpulan kumpulan yang lebih mengelompok
mengelompok. Nah jenis yang ketiga yaotu yang Lymphoblast like ini biasanya bentuknya
bulat seperti bola ya terus dia tumbuh dalam suspensi, jadi dalam cairan jadi kalau tadi
sebetulnya juga ditumbuhkannya di dalam cairan, tetapi setelah nanti dia tumbuh dia akan
melekat kalau yang fibroblastic sama yang epithelial-like, tetapi untuk yang lymphoblast like
dia tetap melayang layang pada cairannya.
Jadi bagaimana ya sel itu diisolasi dari jaringan ya kemudian ditumbuhkan pada
kultur secara in vitro, jadi prosedurnya yaitu jaringannya dulu diambil, contonya tadi kalau
yang gampang misalnya plein/plin, plin itu di gerus, setelah digerus kemudian di saring,
kemudian sel yang didapatkannya itu di tumbuhkan pada medium kultur, nah kalau kita
melakukan kultur langsung diambil dari jaringannya llalu kemudian di tumbuhkan itu
namanya kultur primer, kultur primer ini sifatnya sangat tidak stabil mudah sekali berubah
sifatnya ya, oleh karena kultur primer ini agak susah dilakukan apalagi misalnya yang tadi di
sampaikan kalau kita mengkultur limfosit dari sling itu mudah, tapi misalnya kita mengambil
misalnya sel kanker, misalnya gitu, lalu kemudian kita tumbuhkan pada kultur, nah itu
ternyata susah sekali untuk mempertahankan atau menumbuhkan sel yang sifatnya itu sama
dari aslinya, kalau kultur primer ini sudah berhasil lalu kemudian dilakukan sub kultur. Kalau
sub kultur dari kultur primer itu yang dinamakan kultur sekunder, kemudian dari kulture
sekunder nanti kalau sudah berhasil nanti dilakukan sub kultur kembali nah itu yang
dinamakan cell line, hanya saja tentu ada syaratya bagaimana dia menjadi cell line, tentu saja
setelah stabil beberapa saat melalui sub kultur atau passage baru kemudian setelah
dikarakterisasi sifatnya itu stabil dia bisa dikatakan sebagai cell line, nah kemudian cell line
ini biasanya sifatnya banyak yang juga mempunyai sifat imortal atau dia tidak mudah mati,
karena dia mengalami transformasi yang bisa terjadi secara spontan atau juga bisa dengan
cara dibuat atau direkayasa. Nah cell line yang imortal ini yang kita sebut sebagai continues
culture atau kultur berkelanjutan.
Tipe kulture invitri: kultur primer. Adalah kultur sel yang langsung diisolasi dari
jaringan terus ditumbuhkan dalam medium buatan yang sesuai terus kemudian nanti ditunggu
sampai dia mencapai kondisi yang stabil atau dia akan memenuhi seluruh mediumnya, nah
kalau suatu kultur itu tumbuh degan baik maka dia memenuhi seluruh mediumnya ini yang
dinamakan dia bisa mencapai kondisi influens, nah jika sudah sampai pada kondisi konfluens
maka dia siap di sub kultur atau di passage. Nah jika sudah confluence itu memang harus di
sub kultur atau dipindahkan ke abung baru dengan medium yang segar, nah ini memberikan
ruang agar sel itu nanti bisa mbuh semakin banyak, karena jika dia sudah confluence tapi kita
biarkan saja lama kelamaan dia berdesak desakan mereka akan berebut nutrisinya lama lama
mereka kurang gizi terus nanti mati.
Nah berikutnya kan tadi dari primer di sub kultur jadi kultur sekuder, jadi sekunder
susdah tidak langsung berasal dari jaringannya tapi sudah dari sub kultur primer. Kultur
sekunder bisa langsung diseleksi dari kultur primernya atau misalnya kita bisa melakukan
suatu rekayasa dulu pada kultur primernya, misalnya melakukan kloning atau rekayasa
apapun terus kemudian di kultur itu juga bisa jadi kultur sekunder. Nah umur dari kultur
sekunder ini biasanya terbatas kalau kultur primer adi lebih terbatas lagi karena untuk kultur
primer ini bisa mencapai conflurence saja sudah Alhamdulillah biasanya. Nah sering kali
jarang berhasil atau snagat sulit berhasil kalau kultur primer itu mencapai kondisi confluence,
jadi kita harus sangat hai –hati dan mempunyai trik trik tertentu agar kultur primer itu
berhasil tmbuh. Nah makanya disini dikatakan nuntuk kultur sekunder ini masa hidupnya
terbatas, nah kemudian pada kultur sekunder ini biasanya dia fenotipenya itu fenotipe
terdeferensiasi artinya mirip seperti asalnya, jadi kalau kita mengambil sel dari suatu
jaringanpasti sel nya itu adalah sel yang sudah terdeferensiasi, misalnya kita mengambil dari
kulit, kulit ini adalah sel yang sudah terdeferensiasi ketika nanti ditumbuhkan jadi kultur
primer dia akan menjadi sel kulit yang tumbuh yang sudah terdeferensiasi tadi. Padasekunder
juga penotifenya masih penotofe terdeferensiasi. Kalau untuk primer faktor utama itu adalah
sel yang anchorage dependent, anchorage dependent adalah sel yang tumbuhnya melekat
pada permukaan, misalnya pada permukaan plastik atau kaca. Nah kemudian kultur ini juga
ada yang namanya sifat contact inhibition, contact inhibition itu artinya dia mempunyai
regulasi atau pengaturan sehingga dia nanti hanya tumbuh satu lapis saja jadi tidak akan
tumpuk tumpuk tumpuk. Kultur pada umumnya punya sifat contact inhibition jadi dia hanya
akan tumbuh satu lapis saja.
Nah tadi setelah ada kultur primer, sekunder, tadi juga sudah saya sampaikan ada
kultur yang berkelanjutan. Nah ini bisa berasal dari kultur langsung tapi bisa juga dari kultur
sekunder. Sifatnya immortal (tidak mati/tidak mudah mati) jadi umurnya itu tidak terbatas,
nah bagaimana dia bisa immortal? Itu bisa jadi karena spontan (mengalami mutasi genetik
secara spontan), jadi sel yang mengatur kematian itu mengalami mutasi sehingga sel nya
tidak mati mati. Atau bisa juga dia direkayasa atau dibuat yaitu di dalam kultur tersebut
dimasukkan atau itu diinfeksi dengan ditambahkan vektor, entah itu virus atau plasmid pada
selnya sehingga sel nya nanti membawa gen yang menyebabkan dia bersifat immortal, nah ini
juga bisa. Nah kemudian, kalau kita melakukan subkultur atau passage pada kultur yang
berkelanjutan ini akan nampak semakin lama bahwa akan ada peningkatan kecepatan
pertumbuhan. Jadi kalau kita melakukan passage atau subkultur pada yang kultur
berkelanjutan ini nampak lama lama kok ooohhhh tumbuhnya lebih cepat. Populasi selnya
pada yang continues culture karena ini memang biasanya kita pilih yah pada sekunder itu
juga lebih homogen daripada yang primer, nah kalau yang pada kultur berkelanjutan ini
biasanya kalau dari sekunder ia juga akan lebih homogen lagi. Sifatnya sama yaitu anchorage
dependent melekat pada wadahnya atau pada substratnya dan contact inhibition hanya akan
membentuk satu lapis sel saja. Walaupun immortal tapi kalau invitro tetep dia mempunyai
batas kalau dibandingkan dengan sekunder atau primer umurnya itu jauh lebih panjang. Nah
secara genetic dia tidak stabil. Nah kemudian apa yang disebut dengan cell line? Cell line itu
bisa jadi merupakan subkultur dari kultur primer atau bisa jadi dari kultur sekunder, nah tapi
dalam hal ini biasanya kalau cell line sangat spesifik jadi kita mengambilnya, misalnya dari
kultur primer yang benar-benar kita ambil satu sel, sehingga dari satu sel atau beberapa sel
tadi yang telah kita pisahkan dari sifat yang sama sehingga cell line dalam (kalau kita dalam
kumpulan cell line sudah mempunyai karakteristik yang sama). Contohnya Cell Line C47D
yaitu cell line untuk kanker payudara, MCM7 juga cell line untuk kanker payudara sehingga
dalam satu sel itu hanya ada satu cell line nya. Dari waktu ke waktu karakteristiknya tidak
berubah, ada keragaman genotipe dan fenotipe dalam populasi.
Cell strain ini subpopulasi dari cell line yang biasanya agak lebih kecil lagi. Misalnya
pada cell line yang terinfeksi inbifi yaitu "ibunya lupa" yang kemudian diambil subpopulasi
nya dari cell line menjadi subpopulasi yang namanya HH514 atau "Ece five fourteen" yang
merupakan cell strain. Cell strain dibandingkan dengan sel lainnya biasanya ada pertambahan
perubahan genotipe dari cell line sebelumnya.
Tadi disampaikan kalau cell line nya umur nya lebih terbatas dibandingkan dengan sel
yang berkelanjutan. Cell line juga ada cell line yang berkelanjutan. Sel secara umum biasanya
setelah membelah beberapa kali akan mempunyai kemampuan untuk berhenti membelah
yang dikenal sebagai cell senescence yang menyebabkan umurnya terbatas. Tetapi pada sel
yang berkelanjutan atau yang bersifat imortal gen pengatur kematiannya itu mengalami
perubahan sehingga umurnya akan jauh lebih panjang dari cell line yang biasa atau normal.
Kita sudah mengenal tiga macam sel pada subkultur yaitu fibroblas, epitalium weight
dan juga lipoblast light. Dan kita bicara primer sedunder itu hanya diambil dari jaringan
langsung atau dari kultur yang sebelumnya. Kalau sudah sel dengan fenotipe dan genotipe
yang seragam maka disebut cell line. Ada sifatnya diubah lagi menjadi kontinues atau
imortal, tetapi secara penampakan atau sifat sebelumnya dibagi menjadi tiga. Cell line juga
ada yang sifatnya fibroblastik, epitelium weight dan lipoblast light. Kemudian kalau kita mau
mengkultur sel kita harus membaca dulu seperti sel ini sifat nya bagaimana, persyaratan dia
tumbuh dengan baik itu seperti apa karena waktu mau melakukan kultur sel bagaimana itu
kondisinya sangat tergantung dari tipe selnya karena sel satu dengan sel yang lain bisa jadi
sangat berbeda sehingga bagaimana kita memilih mediumnya, campuran mediumnya harus
mengandung apa nah itu tergantung dari selnya.
Namun secara umum dalam lingkungan buatan didalam medium atau dalam
lingkungan artivisial yang ada didalam medium tentu saja yang harus ada nutrisi esensial
(misalnya asam amino, karbohidrat, vitamin, mineral) tetapi hanya didalam nutrisinya itu
terkadang ada tambahan yang harus kita lihat atau kita cek, sel kita perlu yang mana.
Kemudian barangkali juga ditambah faktor pertumbuhan, ada yang perlu hormon ada yang
tidak dan lain lagi kondisi artifisial yang diperlukan itu gas (O2 atau CO2) tetapi yang umum
yang biasa digunakan itu adalah CO2. Lingkungan fisik dan kimiawi juga harus diperhatikan
pH nya berapa, sel ini tumbuh pada suhu berapa, dalam pengujuan apakah memerlukan
tekanan tertentu (tekanan osmotik) atau tidak. Sebagian besar sel itu bersifat anchorage
dependent atau melekat (antara fibroblastik atau epitelielight). Sebagiannya lagi ada yang
melayang-layang pada kultur yang merupakan kultur suspensi (limfoblast light).
Ketika kita melakukan suatu kultur sel yang harus diperhatikan adalah safety atau
keamanan karena bila kita bekerja dengan sel yang berasal dari sel hewan atau sel manusia
yang harus diperlakukan barang atau sampel yang mempunyai potensi infeksi. Sehingga kita
jangan kontak langsung terhadap selnya sendiri. Bagaimana caranya? Misalkan ada
tumpahan harus dihindari sehingga tidak menyiprat ke yang lain.
Reagen yang digunakan bisa bersifat toksik, korosif, atau mutagenik. Bahaya yang
sering terjadi bila kita bekerja di laboratorium adalah paling banyak terkena benda tajam,
contohnya tertusuk jarum, terkena pecahan kaca. Reagen atau sampel yang tumpah atau
menyiprat yang bisa tidak sengaja masuk ke mulut, masuk kearea mukosa yang lain (ke
dalam mata). Memipet dengan cara dihirup dan tidak sengaja menghirup agen-agen yang
bersifat aerosol. Safety ditujukan kepada pekerja nya atau lingkungan sekitar. Safety juga
dilakukan kepada sampel agar tidak terkontaminasi.
Untuk menjaga safety laboratorium harus memenuhi tingkat biosafety level. Ada
biosafety level 1 lab yang sangat umum atau biasa seperti lab histologi yang didalam nya
tidak mengandung sampel dengan potensi infeksi. Bisa dicegah dengan menggunakan APD
yang lengkap.
Biosafety level 2 (BSL 2) yaitu saat kita bekerja pada agen dengan risiko menengah.
Misalnya bisa menyebabkan penyakit yang variasi yang level nya bisa parah sampai tidak
parah yang cara penularannya terjadi hanya karena tertelan atau infeksi melalui kulit atau
mukosa. Contohnya SARS-COV-2 yang sebenarnya merupakan agen risiko menengah bisa
dikerjakan di BSL 2 karena kita bisa terinfeksi bila ada droplet. Laboratorium kultur minimal
berada di BSL 2 jadi bila kita akan melakukan kultur minimal BSL 2. Persyaratan lain
tergantung dari jenis sel yang akan diperiksa atau agen yang akan kuta gunakan.
Menit ke 1: 15: 58 sampai 1:30:06 menit

BSL 3 ini cocok untuk agen yang berpontensi transmisi aerosol jadi kalau misal
pontesinya apa infeksinya bisa terjadi karena hirupan itu harus di BSL 3 contohnya M.
Tuberculosis jadi kalau kita mau melakukan penelitian dengan menggunakan agen infeksi
untuk TB itu harus dilakukan di BSL 3 tidak boleh di BSL 2 karena ini sangat berbahaya ,
HIV itu BSL 2 Karena HIV itu infeksinya karena parenteral atau bisa juga ada gesekan yang
cukup berat pada permukaan mukosa tertama pada area mukosa di saluran genitourinari .

Yang lebih lagi itu misalnya BSL 4 itu agen infeksi yang menyebabkan Penyakit yang
langsung mengancam jiwa contohnya Ebola ini utk BSL 3 dan 4 tentu saja persyaratan labnya
itu sangat banyak .kemudian untuk maintence lab nya saja itu biasanya sangat mahal .
kemudian sebagai penyerta ,seperti kita melakukan pekerjaan histologi menerima jaringan
kalau labnya sendiri BSL 1 tidak masalah , tetapi sebagai tambahan kita harus menyediakan
peralatan utk menjaga keamanan , Contohnya APD utk menghandle smpel kita harus
menggunakan glopes dan jas lab,terus lebih baik kita menggunakan masker. selain itu ada
pembatasan yg kita sebut sbg pembatas primer contohnya Biosafety Cabinet karena kita
bicara ttg kultur sel jdi ada yang disebut dgn Biosafety Cabinet. BSC ini akan melindungi
terutam pekerjaanya karena di dalam BSC Aliran udaranya hanya akan berputar di dalam ,
lalu di dlmnya itu ada filter utk menyaring udaranya agar bersih lagi sehingga kalau lita
bekerja dgn agen infeksius tidak akan ada semburan yang keluar pada pekerjanya .

BSC Ini alat yg paling penting utk memberikan lindungan dari cipratan / aerosol dari
mikroba dan juga utk mencegah kontaminasi pada kultur selnya ,karena udara yg bergerak di
dlm itu akan langsung di filter / di bersihkan . BSC yg kelas 2 itu didesain utk bekerja di lab
BSL 1 ,2 dan 3 utk BSL 4 iu BSCnya kelas tentu saja lebih tinggi lagi .BSC kelas 2 ini juga
memberikan lingkungan yg aman baik untuk pekerjanya maupun untuk kultur selnya danjuga
digunakan utk mengendalikan materi berbahaya , sehingga tdk membahayakan pekerjanya .
ini ilustrasi saja BSC saya yakin semuanya sudah pernah lihat jadi kalau kita lihat di sebelah
kanan ini yang di tutup kaca kalau sdg tdk di gunakan kaca nya itu di tutup penuh , tepai jika
sedang di gunakan dia dibuka kacanya 1/3 bagian supaya tangan kita bisa masuk dan disini
aliran udara dinyalakan karena nanti aliran udara itu akan lngsung masuk ke dlm filter
sehingga udara yg beredar di dlm BSC terjaga kebersihaannya / kemurniaanya , nah tadi
APD ya sudah sedikit disinggung jdi ada berbagai macam ,biasanya meskipun kita sudah
menggunakan BSC APD tetap diperlukan maknya kita bekerja harus menggunakan sarung
tangan , jaslab dan masker . kemudian itu tergantung apakah kita perlu pakai google atau
tidak ,perlu perlindung wajah atau tidak tergantung dari agent infeksi / agen biologi yang kita
kerjakan / yang kita kultur .Kemudian ini adalah peralatan kultur dasar BSC tadi walaupun
disini ada dikatakan laminar flowhud ini kalau utk kultur tidak disarankan sebetulnya karena
kalau laminar flow itu arah udaranya keluar , biasanya kalau laminar flow ini hanya
digunakan untuk pekerjaan yg tdk terlalu memerlukan kondisi yg steril , mis isolasi RNA Ini
hanya untuk memberikan batas2 antara kita dgn RNA yg kita kerjakan , jadi meskipun ada
flow aliran udara kea rah kita tidak akan berpotensi infeksi dan juga dia tidak perlu kondisi
yg sangat steril dalam artian kontaminasi dari mikroba atau agen infeksi yang lain .

kemudian kita perlu incubator Co2 dgn kelembaban tertentu , perlu waterbath utk
menghangatkan reagen, media / melarutkan sel dari sel tertentu sampai titik tertentu itu tdk
sampai larut semua . kemudian sentrifuge , lemari pendingin dan juga freezer dan sel kultur
itu perlu krna utk melihat misalnya sel ini jumlahnya berapa , kemudian mikroskop infertif ,
kenapa infertif karena kalau melihat kultur itu kalau infertit lensa objektifnya dari bawah
bukan dari atas karena sel itu kalau dia yg aderen dia juga melekatnya dibawah kalau pun sel
itu suspensi juga cairanya ada dibawah karena yg sebelah atas kan kosong sehingga yg
diperlukan adalah mikroskop infertif . kemudian liquid nitrogen diperlukan kalau kita punya
sel yang jumlahnya berlebih kita harus simpan atau juga bisa kita simpan untuk eksperimen
di waktu lain atau juga diberikan kepada yg lain yg memerlukan , harus disimpan tetapi
dalam kondisi rayoresertatif disimpan dl kondisi kerayu yaitu pada liquid nitrogen suhu
kurang dari – 130’C Karena kalau lebih dari itu di ajika suhuya diatas itu misalnya di -80’C
ada kemungkinan sel akan berubah genetik atau genetic trip . kemudian steril laser atau
autoclap karena pada alat yg tdk sekali pakai , atau alat yg harus disterilkan lalu kalo kita
setelah bekerja medium sisa yg masih ada bahan organismenya itu lebih baik di sterilkan .
area kerja harus aseptic / harus sangat bersih , ruang kultur itu disarankan terpisah dgn ruang
yg lain ttapi masih bisa kita bekerja di ruang besar lalu ada pojokan yg khusus digunakan utk
kultur tetapi hal ini kita harus disiplin area di sekitrnya harus bersih . lalu di beribatas orang
itu tidak boleh melebihi garis mana sehingga area itu tidak banyak utk lalu Lalang .utk yg ini
jelas BSC ini sangat utk meyediakan kondisi yg aseptic .

kemudian Teknik bekerja yg aseptic sangat penting dalam hal ini kita harus
menggunakan bahan habis pakai media itu harus semuanya dibersihkan , kalau media itu
harus steril tapi misalnya wadah2nya , kita mau bekerja wadah semuanya itu harus steril
disemprot dgn alcohol dulu sisi luarnya sebelum masuk BSC . jika kita mengambil flash
kulturnya dari incubator CO2 itu juga disemprot dulu semua dgn alcohol kemudian dilap lalu
di masukan kedlm BSC . Kenapa kita harus mengindari sumber kontaminasi terhadap kultur
yg sedang kita kerjakan tujuannya Teknik aseptic ini utk menyedikan batas agar apa yg kita
kerjakan itu dlm kondisi yg tetap steril sehingga terhindari dari kontaminasi . kalau kita mau
bekerja dgn Teknik aseptic yang harus bersih itu reagennya , higenisitas itu kita bekerja
menggunakan APD yg semestinya , sebagai tmbahan kalau mengerjkan kultur jangan makan
roti karena roti itu mnggunakan ragi (yeast) ini sering kali bisa menyebabkan kontaminasi
yeast pada kultur kita kemudian reagen dan metode harus steril terus cara bekerja itu juga
harus steril , area kerja harus steril nanti bisa di bantu caranya bagaimana semua harus dilap
dulu dengan etanol dll . higenisitas tadi harus menggunakan APD yang betul , media dan
reagen juga harus steril terus kemudian cara pengerjaan yang juga harus steril . saya tadi
menyampaikan semua harus di semprot alcohol dulu .

kemudian tips yang lain BSC itu hanya digunakan mengerjakan kultur artinya jangan
utk menyimpan nah ini saya sering liat , ah biar aja ah tipnya kan besok juga di pakai lagi gitu
/ tabungnya itukan besok juga di pakai lagi jadi botol yg isinya tabung2 kecil masih tetap di
tinggal di dlm BSC itu adalah praktek yg tidak benar,. Kemudian kalau kita mau menuang
media flash utk kultur jngn di tuang langsung semua nya lebih baik di tuangkan
menggunakan pipet lalu barang2 yg steril itu jangan di buka sebelum digunakan jadi kalau
flash itu mau digunakan baru di buka dari bungkusnya lalu di masukan ke dalam BSC pipet
juga demikian jdi jngn mendiamkan alat2 yg mau kita gunakan di dlm BSC Terbuka kalau
terpaksa yg disemprot kalau pipet kan gak bisa krna kalu sudah terbuka kita buang kalau itu
pipet glass ya kita steril ulang . kemudian kita bekerja ni teruskan lagi buka medium kita
buka mau kita ambil dengan pipet kita tuangkan kedalam plat untuk medium yg kita buka
kita letakan toh di daerah pada SC kalau menurut disini itu letakannya itu harus telungkup
atau menghadap kebawah . Nah kita asumsinya tadi sudah dibersihkan jadi di situkan steril
karena akalu terbuka nanti kelewat tangan kita meskipun pake jaslab siapa tau bawa
rontokan2 kotoran atau organisme lain itu bisa menyebabkan kontaminasi , nanti setelah itu
ditutup kembali setelah eeeee, disitu mungkin ada sisa cairan dari tutup nya itu segera kita lap
menggunakan etanol.