- Mahasiswa dapat menjelaskan konsep biologi molekuler, serta perkembangan penggolongan MH dari yang paling
sederhana sampai ke aras molekuler
- Sbg TLM pengambilan sampel darah pasien melalui tindakan invasive resiko untuk petugas dan pasien,
baik sampel dari darah, sputum, feces, urin, LCS dan komponen jaringan yang lain infeksi mempelajari
materi biologi sel dan molekuler petugas bekerja dengan benar dan aman kemajuan tehnologi
diagnosis molekuler
PENDAHULUAN BIOLOGI MOLEKULER
Sel : unit terkecil dari kehidupan, memiliki bentuk dan ukuran yang berbeda –beda tergantung tempat
dan fungsi dari jaringan yang disusunnya
Sel Robert Hooke (1665), cellula : bilik kecil , didalamnya mengandung komponen protoplasma .
Berdasarkan jumlah , sel dikelompokkan : - organisme uniselluler
- organisme multiseluler
Berdasarkan struktur ultra sel : - sel prokariot, organisme prokariot, uniseluler : Mis : bakteri
- sel eukariot , organisme eukariot uniselluler, mis : yeast
organisme eukariot multiseluler, mis : manusia
KONSEP BIOLOGI MOLEKULER
Biologi molekuler : mempelajari sel, meliputi pengertian, organel yang ada dalam sel serta fungsi sampai kearas molekul
penyusunnya.
Paradigma dalam biomol : setiap organisme (termasuk manusia) t.d. sel, Sel t.d sejumlah molekul baik struktur &
fungsi yg ditunjukan organisma, termasuk fungsi yg menunjukkan organisma adl sesuatu yg hidup ditentukan molekul tsb.
- Penyakit gangguan fungsi normal tubuh,biomol krn adanya perubahan molekul dalam tubuh.
- Molekul kehidupan pd MH : hidrokarbon, lipid, protein,karbohidrat & asam nukleat. Yang berperan utama pd biomol :
protein & asam nukleat.
Keuntungan Molekul-molekul yang membentuk dasar
mempelajari kehidupan memberikan para ilmuwan lebih
biomolekule mudah memprediksi dan menjadi alat
r mekanistik untuk dipelajari para ilmuwan.
Dpt menggunakannya untuk menentukan fungsi gen tunggal
atau protein dan mencari tahu apa yang akan terjadi jika gen
atau protein itu tidak ada atau salah.
Digunakan untuk memeriksa kapan dan mengapa
gen tertentu diaktifkan "on" atau "off".
Mengembangkan pengobatan ketika
mekanisme/aktivitas dalam tubuh
makhluk hidup tidak bekerja dengan
Molecular Level to Organism Level
Molecular Level to Organism Level
Telaah atas efek
perbedaan genetik
pd makhluk hidup,
misal: telaah
Telaah dlm skala mengenai mutan Telaah zat-zat kimia
molekul atas (Genetik) & proses-proses
proses replikasi, vital yg
transkripsi, & berlangsung pd
translasi bahan makhluk hidup
genetik (Biomol) (Biokimia)
Hubungan
Biomol,
Biokimia,
Genetika
Peran biologi molekuler
di bidang kesehatan
Produk farmasi
Produk farmasi dengan teknologi DNA rekombinan
Produk Kegunaan
Hormon adenocorticotropic Pengobatan penyakit rematik
Alfa dan gamma interferon Terapi kanker dan infeksi virus
Sel beta faktor pertumbuhan Pengobatan kelainan imun
Erytropoietin Pengobatan anemia
Hormon pertumbuhan manusia Terapi defisiensi pertumbuhan pada anak-anak
Lympotoxin antitumor
Vaksin hepatitis B Mencegah hepatitis B
Interleukin-2 Pengobatan kanker, merangsang sistem imun
Antibodi monoklonal Terapi kanker dan rejeksi transplantasi
Nerve growth factor Memperbaiki syaraf yang rusak
protein fungsional
- Penggenapan (komplementaritas) model double helix dari Watson & Crick Menunjukkan bahwa replikasi molekul DNA
- Pada replikasi ini double helix memisahkan diri dari komplemennya, Masing-masing rantai kemudian berperan
sebagai template dimana utas pelengkap (komplementery) baru dapat disintesis. 2 molekul DNA double helix yang baru
dibentuk masing-masing mengandung satu utas dari molekul DNA induk double heliks kmd dapat dibagikan antara 2 sel
anak. tiap sel anak akan mgd molekul DNA dengan informasi sama dengan Yang dimiliki induknya (tiap sel anak molekul
DNA sel induknya hanya diawetkan Setengah) semi konservatif : setiap molekul DNA turunan tersusun dari
sebuah untaian asli & sebuah untaian bentukan baru
- DNA Polymerase bertugas untuk menggabungkan DNA sub unit untuk membentuk rantai DNA baru. DNA yang lama
digunakan sebagai DNA Template.
- Enzim primase bertujuan untuk membentuk RNA primer.
RNA primer berfungsi untuk mengawali atau menginisiasi pemanjangan DNA copi. Pada sisi lain DNA digandakan
dengan cara terbalik karena replikasi hanya bisa berjalan dari sisi 5 ke 3 sehingga DNA polymerase harus menunggu kerja
enzim helicase. Setelah membuka maka akan dilakukan penggandaan secara bertahap dan menjadikan fragment DNA
yang disebut dengan fragmen okazaki. Fragmen fragmen ini nantinya akan digabungkan dengan menggunakan enzim
ligase.
LANGKAH – LANGKAH REPLIKASI DNA
1. Inisiasi
Replikasi DNA dimulai pada lokasi spesifik disebut sebagai asal replikasi, yang memiliki urutan tertentu yang bisa
dikenali oleh protein yang disebut inisiator DnaA. Mereka mengikat molekul DNA di tempat asal, sehingga
mengendur untuk perakitan protein lain dan enzim penting untuk replikasi DNA. Sebuah enzim yang disebut helikase
direkrut ke lokasi untuk unwinding (proses penguraian/seperti membuka resleting) heliks dalam alur tunggal.
2. Sintesis primer
Sintesis baru, untai komplementer DNA menggunakan untai yang ada sebagai template yang dibawa oleh enzim
yang dikenal sebagai DNA polimerase. Selain replikasi juga memainkan peran penting dalam perbaikan DNA dan
rekombinasi.
DNA polimerase tidak dapat memulai sintesis DNA secara independen, dan membutuhkan 3′ gugus hidroksil untuk
memulai penambahan nukleotida komplementer. Ini disediakan oleh enzim yang disebut DNA primase yang
merupakan jenis DNA dependent-RNA polimerase. Ini mensintesis bentangan pendek RNA ke untai DNA yang ada.
segmen pendek ini disebut primer, dan terdiri dari 9-12 nukleotida. Hal ini memberikan DNA polimerase platform
yang diperlukan untuk mulai menyalin sebuah untai DNA. Setelah primer terbentuk pada kedua untai, DNA
polimerase dapat memperpanjang primer ini menjadi untai DNA baru.
Pembukaan resleting DNA dapat menyebabkan supercoiling (bentukan seperti spiral yang
mengganggu) di wilayah garpu berikutnya. Ini superkoil DNA dibuka oleh enzim khusus yang disebut
topoisomerase yang mengikat ke bentangan DNA depan garpu replikasi. Ini menciptakan memotong
pada untai DNA dalam rangka untuk meringankan supercoil tersebut.
Pada untai berlawanan, DNA disintesis secara terputus dengan menghasilkan serangkaian fragmen kecil dari DNA
baru dalam arah 5 ‘→ 3’. Fragmen ini disebut fragmen Okazaki, yang kemudian bergabung untuk membentuk
sebuah rantai terus menerus nukleotida. Untai ini dikenal sebagai lagging Strand (untai tertinggal) sejak proses
sintesis DNA pada untai ini hasil pada tingkat yang lebih rendah.
5. Penghapusan primer
Meskipun untai DNA baru telah disintesis primer RNA hadir pada untai baru terbentuk harus digantikan oleh DNA.
Kegiatan ini dilakukan oleh enzim DNA polimerase I (DNA pol I). Ini khusus menghilangkan primer RNA melalui ‘5→ 3’
aktivitas eksonuklease nya, dan menggantikan mereka dengan deoksiribonukleotida baru dengan 5 ‘→ 3’ aktivitas
polimerase DNA.
7. Terminasi ( pemutusan )
Replikasi ini terhenti di lokasi terminasi khusus yang terdiri dari urutan nukleotida yang unik. Urutan ini diidentifikasi
oleh protein khusus yang disebut tus yang mengikat ke situs tersebut, sehingga secara fisik menghalangi jalur
helikase. Ketika helikase bertemu protein tus itu jatuh bersama dengan untai tunggal protein pengikat terdekat.
Replikasi DNA adl proses duplikasi DNA didalam nukleus
Proses replikasi dimulai pada pangkal replikasi DNA , helikase berfungsi untuk membuka rantai ganda DNA induk
Enzim primase berfungsi membentuk RNA primer yang merupakan segmen pendek RNA sebagai pemula terjadinya
sintesis
Dari ujung 3 RNA primer, DNA polimerase menambahkan pasangan basa nitrogen pada rantai tunggal DNA induk dan
terbentuk rantai DNA yang bersambungan secara kontinyu yang disebut leading strand
Pada rantai tunggal induk yang lain, DNA polimerase membentuk lagging strand ( merupakan keseluruhan rantai kopian
DNA yang pertumbuhannya tidak kontinyu) dengan memperpanjang RNA – RNA primer di beberapa tempat sehingga
membentuk segmen – segmen DNA baru yang saling terpisah ( fragmen okazaki)
DNA polimerase yang lainnya , menggantikan RNA primer dengan DNA dan enzim ligase menghubungkan segmen –
segmen okazaki, sehingga terbentuk salinan DNA baru, DNA baru akan melanjutkan tahapan sintesis protein selanjutnya
yaitu transkripsi dan translasi
KESALAHAN DALAM REPLIKASI DNA MENYEBABKAN MUTASI
Salah satu ciri yang paling mengesankan dalam replikasi DNA : ketelitiannya Pada
proses ini terdapat beberapa mekanisme pengoreksi yang bertugas
membuang nukleotid yang salah posisi urutan nukleotid dalam sebuah
molekul DNA disalin dengan kesalahan < 1 untuk setiap 109 nukleotid yang
ditambahkan. - Tetapi kadang-kadang mesin replikasi menambahkan nukleotid
lebih dari semestinya/memasangkan T padahal seharusnya C/ memasangkan A
padahal seharusnya G, setiap perubahan spt ini dalam urutan DNA adl sebuah
kesalahan genetik : mutasi yang akan terus disalin & ditransmisikan ke semua
Generasi sel berikutnya.
Tabel. Fungsi enzim
SIFAT KIMIA RNA
- Asam ribonukleat : polimer ribonukleotida purin & pirimidin yang diikat bersama oleh jembatan 5‘ - 3‘
fosfodiester.
mRNA adalah jenis RNA yang disintesis oleh DNA dalam nukleus sebagai pembawa informasi genetik yang akan
diterjemahkan pada saat transkripsi., mRNA dibentuk oleh DNA
mRNA disintesis oleh DNA template dengan bantuan enzim polymerase III. mRNA hasil transkripsi pada sel
eukariotik tidaklah sama dengan mRNA hasil transkripsi pada sel prokariotik. Dimana pada eukariotik, mRNA hasil
transkripsi di dalam nukleus sebelum bisa meninggalkan nukleus, transkripsi RNA eukariotik pada gen pengkode
protein dimodifikasi dengan berbagai cara untuk menghasilkan RNA yang fungsional yang bisa terhindar dari
degradasi enzim-enzim hidrolitik yang ada di sitoplasma sedangkan pada prokariotik tidak terjadi modifikasi
Messenger RNA adalah komplementer dengan DNA kromosom; membentuk hibrida RNA-DNA setelah pemisahan
dua untai DNA. Sintesis mRNA dicapai dengan hanya satu dari dua untai DNA, yang digunakan sebagai template.
Enzim RNA polimerase bergabung dengan ribonucleotides, dengan demikian, menjadi katalis dalam pembentukan
ikatan 3'-5'-fosfodiester yang membentuk tulang punggung RNA. Dalam hal ini sintesis rasio AU / GC RNA mirip
dengan rasio AT / GC dari DNA. Sintesis mRNA dimulai pada ujung 5 'dan arah pertumbuhan adalah dari ujung 5'
ke ujung 3
Pada prokariota m RNA sering bersifat polisistronik : pengkodean lebih dari satu protein pada m RNA yang sama
Pada eukariota m RNA bersifat monosistronik, hanya memiliki satu protein per satu mRNA
Gambar : ekspresi informasi genetika dalam DNA menjadi bentuk transkripsi m RNA
t RNA
- Terdiri atas 75 nukleotida
- Berfungsi sbg pencocok untuk translasi informasi dalam rangkaian nukleotida m RNA kedalam asam-
asam amino spesifik
- Struktur primer yakni rangkaian nukleotida semua molekul t RNA memungkinkan banyak lipatan &
komplementaritas dalam utas membentuk struktur sekunder yang nampak seperti daun semanggi.
- Ciri- ciri molekul t RNA : urutan ACC pada ujung 3‘ gugus karboksil as. amino terikat pada gugus 3‘
hidroksil bagian adenosil melalui suatu ikatan ester.
- Lengkung antikodon pada ujung batang yang terdapat pasangan basa mengenali triplet
nukleotida/kodon dari cetakan m RNA
- Hampir semua molekul t RNA terdapat lengkung yg mengandung nukleotida ribotimin & pseudouridin &
lengkung lain yang mgd basa dihidrourasil.
- Lengkung timidin – pseudouridin – citidin diperlukan pd pengikatan amino asil t RNA ke permukaan
ribosom pada tempat sintesis protein
- Lengkung DHU : salah satu tempat penting untuk pengenalan yang tepat dr t RNA oleh enzim aminoasil
t RNA.
t.RNA yang memiliki kemampuan untuk menggabungkan khusus dengan hanya satu asam amino dalam reaksi
yang dimediasi oleh seperangkat amino enzim-asam tertentu, yang disebut aminoasil-tRNA sintetase; transfer
asam amino dari "asam amino pool" untuk tempat sintesis protein dan mencocokkan kodon mRNA dikenal
sebagai RNA transfer (tRNA))
a. molekul tRNA dengan ukuran yang relatif kecil dari 75 sampai 90 ribonucleotides dan, dengan demikian,
lebih kecil dari mRNA atau salah satu rRNA, dan memiliki koefisien sedimentasi 4S
b. Rasio A: U dan G: C yang dekat kesatuan yang menunjukkan pembentukan DNA seperti segmen ganda
heliks (struktur sekunder). Dalam segmen heliks ganda ini, G: pasangan basa C lebih umum daripada A: U
dengan oleh rasio AU: GC = 0.3:0.7
c. Semua molekul tRNA memiliki struktur tersier dan konsentrasi ion Mg2+ yang penting bagi stabilisasi.
d. Sejumlah nukleotida yang ditemukan "tidak biasa" di tRNA (misalnya, pseudouridine ψ atau psi), inosin (Ι),
dihydroxyuridine (DHU), dll).
Gambar tRNA seperti daun semanggi
Gambar : struktur 3 dimensi molekul RNA sebagaimana ditentukan dgn kristalografi sinar X. Asam amino
khusus melekat pd terminus ACC 3‘. Diperlihatkan lengkung T U C, lengkung dihidrourasil (DHU)
& lengkung antikodon
Asal tRNA
Seperti mRNA dan tipe-tipe RNA yang lain, molekul RNA transfer (tRNA) ditranskripsikan dari cetakan DNA. Dalam
sel eukariotik, tRNA seperti mRNA dibuat dalam nukleus dan harus berpindah dari nukleus ke sitoplasma, tempat
translasi terjadi
tRNA disintesis dalam inti dengan bantuan katalisis oleh enzim RNA polymerase III
STRUKTUR rRNA
RNA ribosom (rRNA), stabil atau tidak larut RNA merupakan bagian terbesar (hingga 80%) dari RNA total seluler.
rRNA (ribosome-Ribonucleic Acid) atau Asam Ribonukleat ribosomal adalah molekul utama penyusun ribosom.[1]
rRNA dan protein secara bersama membangun subunit-subunit ribosom yang terdiri dari subunit kecil dan subunit
besar untuk kemudian bergabung membentuk ribosom fungsional ketika dua subunit terikat pada mRNA saat
translasi.
Memiliki empat basa RNA utama dengan tingkat metilasi yang rendah dan menunjukkan perbedaan dalam
proporsi relatif dari basa-basanya
Sel-sel eukariotik memiliki empat jenis molekul rRNA, yaitu 28S rRNA (konstanta sedimentasi bervariasi antara 25S dan
30S tergantung pada spesies), 18S rRNA, 5.8 S dan 5S rRNA. The 28S rRNA, 5,8 S dan 5S rRNA terjadi pada 60S
subunit ribosom, sedangkan 18S rRNA terjadi pada 40S subunit ribosom 80S ribosom dari eukariota
Sel-sel prokariotik mengandung tiga jenis rRNA molekul, yaitu 23S rRNA, 16S, rRNA dan 5S rRNA. The 23S rRNA dan
5S rRNA terjadi pada 50S subunit ribosom, sedangkan 16S rRNA terjadi pada subunit 30S ribosom dari 70S ribosom
prokariota)
ASAL rRNA
Sintesis atau pembentukan ribosomal RNA (rRNA) terjadi di nukleus melalui proses transkripsi dengan melibatkan
enzim RNA polymerase I (tapi tidak untuk 5S, unit ini disintesis dengan melibatkan enzim Polymerase III )
FUNGSI rRNA
rRNA berfungsi sebagai katalis namun tidak membawa informasi /pesan genetic sebagaimana mRNA. rRNA yang
merupakan komponen dari Ribosom juga berfungsi sebagai tempat dimana polipeptida disintesis dalam mekanisme
translasi. Selain itu rRNA juga berperan dalam memvalidkan kode triplet basa nitrogen yang akan ditranslasi oleh
ribosom
Amplifikasi gen 16S
Molekul 16S rRNA mempunyai fungsi yang identik pada seluruh organisme. Daerah-daerah molekul 16S rRNA memiliki sifat
yang sangat lestari dan terdistribusi secara universal. Proses amplifikasi gen dengan reaksi berantai polimerase sangat
mudah karena ukuran gen 16S rRNA cukup memadai untuk proses sekuensing. Hanya beberapa bagian lain yang daerahnya
bersifat semi-lestari dan variabel. Gen 16S rRNA terdapat 9 daerah variabel dengan tanda V1 sampai V9. Daerah-daerah
variabel ini dapat membedakan organisme pada tingkat genus hingga spesies, tetapi tidak mampu membedakan hingga ke
tingkat antar strain dalam spesies yang sama. Amplifikasi gen 16S rRNA bakteri dapat dilakukan pada daerah yang sangat
lestari menggunakan metode reaksi berantai polymerase.
Amplifikasi gen 16S rRNA bakteri dengan metoda reaksi berantai polimerase secara umum menggunakan primer universal.
Pada spesies bakteri tertentu digunakan primer spesifik.
Primer universal gen 16S rRNA bakteri adalah primer yang komplemen dengan suatu urutan nukleotida. Jenis
primer universal tersedia secara melimpah di dalam gen 16S rRNA dengan sumber bakteri yang berbeda-beda dan
beragam.
Primer universal yang dipakai untuk amplifikasi gen 16S rRNA bakteri yaitu primer 27F, 765R dan 1495R.
Pada gen 16S rRNA Bacillus dirancang primer khusus berdasarkan penjajaran urutan gena, yaitu 400F, 700F, dan
1000F.
Sedangkan primer 16S rRNA yang digunakan untuk mendeteksi Paenibacillus macerans adalah MAC 1, dan MAC 2
Pada Bacillus subtilis digunakan primer Bsub5F dan Bsub3R. [
3. STRUKTUR RNA
- strukturnya berbeda dengan DNA
Tabel . Persamaan dan perbedaan komponen dan struktur DNA dan RNA serta macamnya
Diagram menunjukan bahwa terdapat 3 langkah utama pada aliran informasi genetik dari genom
Transkripsi Pada Prokariot
- Pada bakteri, semua molekul RNA (mRNA, r RNA, dan t RNA) disintesis oleh enzim yang sama, yaitu RNA polymerase.
Holoenzim RNA polymerase terdiri dari lima rantai polipeptida yang berbeda; ß, ß’, a, ω,dan s. Setiap gen yang akan
ditranskripsi memiliki daerah yang mengawalinya yang disebut promoter.
- Kompleks RNA polymerase akan berikatan dengan promoter untuk memulai transkripsi. Sub unit sigma (s) terlibat
proses inisiasi, sub unit tersebut mengenali dan berikatan dengan dua sekuen DNA yang berbeda didaerah promoter:
yang pertama pada 10 bp upstream, yang disebut kotak Pribnow, dan yang kedua ke arah downsteam, sekuen yang
paling umum ditemui pada kotak Pribnow pada berbagai gen adalah TTGACA.
- Rantai-rantai RNA biasanya dimulai oleh 5’ adenosine trifosfat (pppA), atau guanine trifosfat (pppG). Setelah transkripsi
dimulai, factor zigma melepaskan diri dari enzim inti dan nantinya akan berasosiasi kembali dengan enzim inti yang
sama ataupun yang lain agar enzim itu bisa melekat ke promoter.
- Saat pemanjangan molekul RNA, ribonuklease trifosfat dari basa-basa A, U, G dan C berpasangan dengan basa-basa
komplementer pada untai sense DNA, kemudian digabungkan dengan ikatan 3’-5’fofodiester oleh RNA polymerase.
Dengan demikian, molekul RNA tumbuh dari ujung 5’-nya ke ujung 3’(5’-3’). Ulir ganda DNA membuka didepan DNA
polymerase yang bergerak maju untuk memaparkan semakin banyak bagian untai sense guna memanjangkan rantai
RNA.
- Setelah enzim tersebut telah melalui suatu daerah tertentu, DNA di daerah itu kembali ke bentuk ulir gandanya. RNA
polymerase pada bakteri menghentikan transkripsi rantai RNA pada sekuen DNA yang disebut terminator. dan
melepaskan diri dari DNA
Pada bakteri, satu transkrip tunggal RNA seringkali mengandung daerah-daerah pengkode bagi gen-gen ganda. Tipe
RNA tersebut disebut dengan polisistronik atau poligenik. Satu gen tunggal dapat ditranskripsikan secara bersamaan
oleh beberapa molekul RNA polimerase, dan RNA yang dihasilkan akan terlepas pada setiap polimerase, kejadian
tersebut akan meningkatkan jumlah mRNA yang ditranskripsi dari gen target, yang membantu sebuah sel untuk
memproduksi protein dalam jumlah yang besar.
Pada bakteri, transkripsi berlanjut melalui suatu sekuens terminator pada DNA, terminator yang ditranskripsikan (suatu
gen RNA) berfungsi sebagai sinyal terminasi, menyebabkan polimerase melepaskan diri dari DNA dan melepaskan
transkrip, yang dapat digunakan langsung sebagai mRNA.
Ada tiga jenis utama RNA polimerase yang berperan (pada bakteri hanya satu), yaitu RNA polymerase II yang
bertanggung jawab terhadap sintesis mRNA, sedangkan RNA polimerase I dan III masing-masing bertanggung jawab
terhadap sintesis rRNA dan tRNA. Sintesis dan pemprosesan rRNA terjadi dalam satu atau lebih daerah-daerah
terspesialisasi pada nukleolus.
Sintesis dan pemprosesan rRNA terjadi dalam satu atau lebih daerah-daerah terspesialisasi pada nukleolus. Daerah-daerah
promotor untuk pol I, terletak ke arah upstream dari start transcription point. Inisiasi sintesis RNA sangatlah spesifik pada tiap
spesies. Satu atau lebih protein (protein tersebut sangat penting bagi proses transkripsi)
mengenali promotor-promotor hanya pada rRNA pada spesies yang sama.
Mekanisme transkripsi pada eukariota berbeda dengan bakteri. Pada eukariota, RNA polimerase II mentranskripsikan sekuen
pada DNA yang disebut poliadenilasi, yang mengkodekan suatu sinyal poliadenilasi (AAUAA) pada pre-mRNA, kemudian pada
suatu titik sekitar 10-35 nukleotida yang mengarah ke downstream dari sinyal poliadenilasi protein-protein berasosiasi dengan
transkrip RNA yang sedang tumbuh memotong bagian itu hingga terlepas dari polimerase, dan pre-mRNA dilepaskan.
Akan tetapi polimerase akan terus mentranskripsikan DNA sebanyak ratusan nukleotida setelah tempat pre-mRNA dilepaskan.
Struktur gen pada eukariota mengandung ekson (sekuen yang diekspresikan), yang akan ditemukan. yang akan ditemukan
pada molekul mRNA dan akan ditranslasikan menjadi protein, dan intron, Strukture yang di transkripsi akan tetapi tidak di
translasi.
Intron akan di buang melalui mRNA yang prosesnya disebut RNA splising. Pengenalan titik
potong dilakukan oleh small nuclear ribonucleoprotein (snRNP), yang terletak pada nukleus sel dan
tersusun atas molekul-molekul RNA dan protein, RNA didalamnya disebut small nucleus RNA (snRNA),
Dan memiliki panjang 60-300 nukleotide. Rangkaian ini akan berasosiasi dengan protein besar lain
sehingga membentuk spliceosome yang ukurannya hampir setara dengan ribosom. snRNPs mengenali
dan mengikat simpangan antara ekson-intron. simpangan antara ekson-intron mempunyi sekuen GU
pada ujung intron. dan sekuen AG pada ujung 3’, sehingga dapat dipisahkan secara akurat.
Tidak seperti mRNA pada bakteri, eukariota terbentuk dari post-transcriptional modification
yang memiliki struktur DNA yang sangat panjang yaitu sekitar 5.000-50.000 nukleotida, yang sering
disebut sebagai pre-mRNA. Pre-mRNA kemudian disintesis dengan penambahan cap pada ujung 5’,
biasanya merupakan bentukan 7-methylguanosine, yang diletakkan pada gugus 5’-hydroxil dengan
penghubung triphosphate.
Setelah proses sintesis selesai, pre-mRNA dimodifikasi dengan dengan penambahan ekor poly-A
pada ujung ke 3’, yaitu sekitar 200 bp., dalam beberapa lpenelitian penjumlahan berkisar antara 50-250
nukleotida. Tudung 5’ dan ekor poli-A memiliki beberapa fungsi penting. Pertama, keduanya tampak
memfasilitasi ekspor mRNA matang dari nukleous. Kedua, membantu melindungi mRNA dari degradasi
oleh enzim-enzim hidrolitik. Ketiga, keduanya membantu ribosom untuk melekat ke ujung 5’ mRNA
setelah mRNA mencapai sitoplasma. Pada wilayah upstream sebelum start codon menuju daerah 5’- cup
dan
4. PROTEIN
- Salah satu dari 4 makromolekul
- Protein pada manusia : enzim, hormone, darah, immunoglobulin dst
- Protein pada bakteri : enzim katalase, oksidase, koagulase untuk identifikasi bakteri
- Pada tubuh manusia maupun hewan berperan sebagai komponen penyusun struktur sel ( protein trans membrane),
antibody, protein hemoglobin, myoglobin, hormone, enzim
- Merupakan polimer asam amino, yang dihubungkan dengan ikatan peptide polipeptida
5. Asam Amino
- Tersusun dari unsur C,H,O,N dan sebagian ada unsur S
- Mempunyai gugus amino (-NH2) atau dalam bentuk NH3 dan gugus karboksil (-COOH) atau dalam bentuk (-COO)
- Rumus umum asam amino adanya R merupakan rantai samping yang paling sederhana, berisi unsur H asam amino
glysin
MEKANISME SINTESIS PROTEIN PADA SEL EUKARYOT
- Sintesis protein memerlukan DNA banyak gen, setiap gen protein,gen berbeda protein berbeda
- Gen bagian dari DNA urutan nukleotida tertentu pada DNA mengkode protein tertentu dan
pembawa sifat keturunan dari orang tua ke keturunannya
Gen sbg cetakan menghasilkan mRNA, DNA m RNA proses transkripsi ,
m RNA protein proses translasi
- Tidak semua gen pada DNA dapat ditranslasi menjadi protein
gen kelas II protein,
gen kelas I r RNA, penyusun ribosom, terletak pada RE kasar, tempat sintesis protein
gen kelas III tRNA, berada pada sitoplasma, berfungsi mentransfer asam amino yang ada di sitoplasma
menuju ribosom
SINTESIS PROTEIN PADA SEL EUKARYOT
Meliputi beberapa tahapan :
- Transkripsi gen kelas II menghasilkan mRNA, terjadi didalam inti sel, proses transkripsi terjadi dalam 2
tahap : tahap pertama dihasilkan mRNA yang belum masak, ukurannya panjang
tahap kedua, transkripsi akhir yang menghasilkan mRNA masak, ukurannya lebih pendek Dikeluarkan dari
inti sel melalui pori – pori membrane inti ribosom
Ribosom permukaaan RE kasar proses translasi ( memerlukan tRNA) protein, belum dapat
digunakan disempurnakan di badan golgi disebut proses folding, asetilasi, metilasi, karboksilasi. Setelah protein
sempurna, disimpan di lisosom dan siap digunakan
Transkripsi dan translasi pada sel
eukariotik Transkripsi dan translasi pada sel prokariotik
a. Transkripsi
proses sintesis RNA dengan DNA sebagai cetakannya, transkripsi pada gen kelas II berlangsung di dalam inti sel dan
menghasilkan m RNA . Proses transkripsi diawali ketersediaan cetakan DNA diawali denaaturasi enzim
gyrase memotong ikatan H 2 rantai/strand yang terpisah masing – masing strand menjadi cetakan
Proses transkripsi awal menghasilkan mRNA immature, ukurannya panjang ( semua bagian intron dan exon
ditranskripsikan ). Pada transkripsi akhir terjadi pemotongan pada mRNA immature mRNA matur
Proses transkripsi terjadi melalui 3 tahapan : 1. inisiasi transkripsi atau pengawalan
2. Elongasi transkripsi atau pemanjangan
3. Terminasi transkripsi atau pengakhiran
1. Iniisiasi transkripsi
Awal mulai transkripsi, protein regulator dan RNA polymerase mulai menempel pada promoter dari gen
dimulai dari ujung 5‘ ke arah 3‘, selain diperlukan enzim RNA polimerase juga diperlukan substrat dari enzim
yaitu ribonukleotida NTP ( Nukleotida Triphosphat), Macam – macamnya NTP : - GTP
- CTP
- UTP
- ATP
Enzim RNA polymerase menentukan awal dan akhir transkripsi
2. Elongasi transkripsi
setelah inisiasi transkripsi selesai dilanjutkan elongasi transkripsi. Setelah enzim RNA polymerase bergerak sampai
gen structural diikuti menempelnya ribonukleotida bebas ( gugus P pada atom C5 dari gula ribose) pada gugus OH pada
atom C3 dari ribonukleotida pada molekul RNA yang sedang tumbuh. Setelah RNA polymerase samapai terminator maka
proses penambahan ribonukleotida akan berhenti terminasi transkripsi
b. Translasi
- proses sintesis protein dengan mRNA sebagai cetakannya
- diperlukan : mRNA
Ribosom
tRNA
Asam amino
- Dibantu tRNA yang berfungsi mentransfer asam amino dari sitoplasma ke ribosom
- Urutan nukleotida pada mRNA hanya berupa kode, setiap 3 basa pada mRNA mengkode 1 asam amino
disebut kodon
• TRANSLASI
a) PERANGKAT TRANSLASI
1. mRNA sebagai pola cetakan dalam sintesis protein
- mRNA sebagai pembawa informasi dari gen (DNA) dalam proses translasi mRNA sebagi pola cetakan dalam
penyusunan rangkaian asam amino dalam translasi
- Dalam satu rantai mRNA hanya bagian tertentu yang menjadi pola cetakan : ruas yang diapait kodon awal dan
kodon akhir. Kodon awal = AUG dan kodon akhir (3) : UAA,UAG.UGA.
2. tRNA sebagai pengangkut asam amino
- Berkat adanya simpul antikodon dan kemampuan satu kompleks dengan asam amino yang disebut aminoasil-
tRNA
3. RIBOSOM
- Tempat berlangsungnya translasi
- Dalam ribosom terdapat satu situs untuk mRNA dua situs untuk tRNA dan satu situs untuk enzim transferase
peptidil (enzim yang berperan dalam merangkaikan satu asam amino dengan asam amino yang lainnya).
- Situs mRNA terdapat pada subunit kecil, sedangkan situs tRNA : situs A dan situs P ; situs transferase peptidil
pada sub unit besar.
- Adanya rRNA pada ribosom untuk mengenali tRNA dan mRNA
b) Tahapan translasi
- Translasi = proses penerjemah rangkaian kodon mRNA menjadi rangkaian asam amino polipeptida.
- Ribosom akan membaca kodon-kodon yang berdampingan mulai dari kodon (AUG) awal sampai salah satu
kodon akhir (UAA,UAG,UGA)
- Tahapan translasi terdiri dari :
1. Pembentukan aminoasil – tRNA
2. Inisiasi atau pengenalan kodon awal
3. Perpanjangan rantai polipetida
4. Penutup sintesis polipetida pada kodon akhir.
a. Permulaan
Pindahnya mRNA ke sitoplasma, ujung 51 berikatan dengan subunit yang lebih kecil dari suatu ribosom. Suatu
tRNA inisiator yang mengikatkan diri pada kodon AUG pada ujung 5 1 mRNA untuk mengawali setiap pesan.
Asam amino yang dibawa tRNA inisiator = metionin pada waktu yang sama tRNA menempel pada yang
pertama dari 2 tempat sub unit ribosom yang lebih besar (50S).
b. Tahap pemanjangan
Jika pengikatan kedua ditempati oleh tRNA kedua yang membawa asam amino kedalam sub unit 50S. Asam
amino sebelumnya (metionin pada awal translasi) berikatan dengan asam amino yang baru masuk tRNA
inisiator dibebaskan dari situsnya dan ribosom menggeser satu kodon kearah kanan yang menempel pada
tempatnya dan hal ini memindahkan tRNA yang paling akhir datangnya ke peptida yang menempel ditempat
dan menunggu kedatangan tRNA yang lain yang membawa asam amino ketiga untuk peptida yang sedang
tumbuh
c. Terminasi
Perpanjangan nukleotida berlangsung seperti diatas sampai adanya pesan untuk tanda berhenti : kodonnva
UAG./UGA/UAA
KODE GENETIK
Kode genetik : Aturan-aturan yang dianut oleh rangkaian nukleotid sebuah gen ketika ditranslasikan kedalam
urutan as. Amino sebuah protein
Kodon : unit keturunan yang mengandung informasi untuk satu as.amino t.d.3 nukleotida (triplet)
- Informasi ini mula-mula ditranskripsi kedalam mRNA yang mengandung rangkaian basa komplementer
DNA yang dikopi, 3 urutan basa pada mRNA dinamakan kodon.
- Kodon dibaca dalam grup 3 basa, masing-masing mewakili 1 as.amino
- Karena RNA = sebuah polimer linier yang tersusun dari 4 mc.nukleotid maka kita memp. 4 3 : 64 triplet
kodon yang mungkin as.amino yang ditemukan dalam protein 20 mc. Kebanyakan as.amino
dispesifikasikan oleh beberapa kodon.
- Kodon-kodon dalam sebuah molekul mRNA tidak secara langsung mengenali as.amino yang
dispesifikasikan. Translasi mRNA kedalam protein bergantung pada molekul-molekul adaptor yang
mengenali as.amino maupun kelompok tiga nukleotidnya t.RNA
- Panjang porsi kode pada gen tergantung pada panjang pesan yang akan ditranslasikan yaitu sebanyak
as.amino dalam protein.
STRUKTUR GEN
- Tersusun atas urutan basa nukleotida, yang terdiri dari daerah yang mengkode suatu informasi genetis
(ekson), daerah yang tidak mengkode informasi genetis (Intron), serta bagian yang mengatur ekspresi gen
yaitu sekuens pengontrol ekspresi gen
- Pada manusia diperkirakan ada 50-100 ribu gen yang menjadi protein spesifik (± 20% dari seluruh DNA
manusia, 80% DNA manusia tidak menjadi protein)
- RNA ditranskripsi dari DNA dari arah bagian 51 kebagian 31 pada molekul RNA. Hal ini diawali dan dikontrol
oleh potongan spesifik : blok TATA atau blok CAT
- Beberapa gen hanya mempunyai satu rangkaian DNA yang aktif sebagai DNA yang punya arti.
KODON
3 basa berurutan pada mRNA
51 31
64 kodon (43) : 61 kodon untuk as.amino dan 3 nonsense kodon 9 (stop kodan)
I t RNA > 1 kodon
U C A G
U UUU Phe UCU UAU Try UGU Cys U
UUC UCC UAC UGC C
UUA UCA Ser UAA Stop UGA Stop A
UUG Leu UCG UAG Stop UGG Trp G
C CUU CCU CAU his CGU U
CUC CCC CAC CGC C
CUA Leu CCA pro CAA CGA arg A
CUG CCG CAG gln CGG G
A AUU ACU AAU asn AGU ser U
AUC ile ACC AAC AGC C
AUA ACA thr AAA AGA A
AUG start ACG AAG lys AGG arg G
G GUU GCU GAU asp GGU U
GUC GCC GAC GGC C
GUA val GCA ala GAA GGA gly A
GUG GCG GAG glu GGG G
STRUKTUR GEN t.d :
Pada manusia diperkirakan ada 50 – 100 ribu gen yg menjadi protein spesifik (± 20 % dr seluruh DNA manusia,
80% DNA manusia tidak menyandi protein )
a.Fisi pengaturan
b.TATA blox
c.Inisiasi transkripsi, baru kmd
d.Exon : bagian DNA yang nanti menghasilkan mRNA yang akan diterjemahkan menjadi polipeptida.
e.Intron : bagian DNA yang ditranskripsi menjadi mRNA tetapi tidak ditranslasi menjadi polipeptida.
Ekson dan intron silih berganti sampai kodon terminasi
Hasil transkripsi ini biasanya menghasilkan prekursor RNA, baru kemudian oleh enzim dipotong menjadi
mRNA yang ditransport ke sitoplasma, baru kemudian ditranslasi menjadi polipeptida. Adanya repetisi dan
intron pada DNA dan potongan DNA diantara gen, maka sebagian besar DNA tidak diketahui fungsinya serta
tidak dapat menunjukan fenotip.
- RNA ditranskripsikan dari DNA dari arah bagian 5‘ ke bagian 3‘ pada molekul RNA, hal ini diawali &
dikontrol oleh potongan spesifik : Blox TATA/Blox CAT
- Beberapa gen hanya mempunyai satu rangkaian DNA yg aktif sbg DNA yg punya arti.
Akhir
Sisi pengatur Awal transkip transkripsi
Intron
Intron
Tata box Exon Exon Exon
Transkripsi
Pemotongan
Prekursor RNA
Penyambungan
mRNA Translasi
Protein
- Kodon kodon dalam sebuah molekul mRNA tidak secara langsung mengenali asam amino yang
dispesifikasikan. Translasi mRNA kedalam protein bergantung pd molekul adaptor yg mengenali
asam amino maupun kelompok tiga nukleotidanya t RNA.
- Panjangnya porsi kode pada gen tergantung pada panjang pesan yg akan di translasikan : sebanyak
asam amino dalam protein.
- Kode genetik bersifat degeneratif : > satu kodon dapat menghasilkan asam a mino yg sama.Mis :
UCU, UCC, UCA, UCG Serin
- Kode genetik bersifat universal : kode yang sama digunakan oleh semua organisme hidup mulai dari
bakteri, tumbuhan dan hewan.
MUTASI
- 1. Substitusi : jenis mutasi yang paling umum terjadi. Terdapat 2 tipe subsitusi :
Transisi : terjadi ketika basa purin tersubsitusi oleh basa purin lain atau basa pirimidin tersubsitusi basa
pirimidin lain
Transversi : terjadi ketika basa purin tersubsitusi oleh basa pirimidin atau sebaliknya
2. Duplikasi : munculnya pengulangan urutan basa nukleotida pada DNA
4. Delesi : Hilangnya satu atau lebih basa nitrogen dari segmen DNA
5. Inversi : Dibaliknya urutan basa nukleotida pada DNA
6. Translokasi : Bertukarnya urutan basa nukleotida dari satu molekul DNA ke molekul DNA lain
• Jenis mutasi (berdasarkan jenis perubahan)
Perubahan struktur kimia
- DEPURINASI
- DEAMINASI
- TIMIN DIMER
MISSING C
A. T
G. C A. T Seolah-olah ada pasangan
ACRIDINE
T.A basa lagi
C . G G. C
T.A
C . G
T A C G AA T C G G G T A T T
ATGC TTAGC C C ATAA
REFLICATION IN THE
PRESENCE OF AN ACRIDINE
T A C G AG A T C G G G T A T T
ATGC TC TAGC C C ATAA
TRY GLU ILE GLY TRY
Penyebab Point Mutation (Mutasi titik) pada DNA
Point mutation (mutasi titik) adalah mutasi atau perubahan yang terjadi pada satu atau beberapa basa nitrogen dalam suatu
rangkaian DNA.
1. Radiasi
Radiasi sinar X dan sinar gamma mengenai sel, radiasi akan diserap oleh elektron terluar dari atom dan elektron tersebut
akan tereksitasi, menyebabkan timbulnya radikal bebas. Radikal bebas akan memutus ikatan fosfodiester pada DNA
sehingga double stranded DNA akan putus.
Radiasi sinar ultraviolet (UV) memancarkan energi yang lebih kecil jika dibandingkan dengan sinar X dan sinar gamma
sehingga tidak menghasilkan radikal bebas. Energi radiasi dari sinar UV hanya dapat diserap senyawa yang mempunyai cincin
organik
Gambar 1. Sinar ultra violet (UV) yang mengenali DNA akan diserap oleh timin dan
menyebabkan basa timin yang berikatan saling berikatan membentuk timin dimer; gambar
diatas menunjukkan terjadinya timin dimer
2. Senyawa Kimia
Senyawa / bahan kimia tersebut mempunyai struktur yang hampir sama dengan basa nitrogen. Seperti 5-bromouracil yang
mempunyai struktur mirip dengan basa nitrogen timin sehingga 5-bromouracil terkadang ikut menjadi penyusun
nukleotida DNA menggantikan basa nitrogen timin.
DNA polimerase tidak bisa membedakan antara 5-bromouracil dan timin. Ketika ikut menjadi penyusun DNA, 5-
bromouracil berubah struktur menyerupai basa nitrogen sitosin dan berpasangan dengan basa nitrogen guanin. Hal
tersebut menyebabkan perubahan urutan basa nitrogen (mutasi) karena pasangan basa A-T pada DNA tersebut akan
berubah menjadi pasangan G-C.
Obat kemoterapi untuk AIDS juga mengandung senyawa kimia yang analog dengan basa nitrogen. Ketika senyawa kimia
tersebut menjadi salah satu dari penyusun DNA, DNA tidak dapat ditranskripsikan dengan baik sehingga pertumbuhan
virus HIV menjadi lambat. Beberapa senyawa kimia dapat menghilangkan gugus amino pada basa nitrogen adenin dan
sitosin serta menambahkan hidrokarbon pada basa nukleotida. Keduanya dapat menyebabkan terjadi mispair pada DNA.
Point mutasi bisa terjadi secara spontan, tanpa paparan radiasi atau bahan kimia mutagenik.
Terkadang basa nukleotida cara spontan bergeser pasangan ke konformasi alternatif, atau isomer. Namun hal tersebut
terjadi kurang dari satu basa nitrogen per milyar basa nitrogen dalam satu generasi.
Sequen DNA terkadang salah menempel (berpasangan) ketika pasangan kromosom homolog saling berdekatan
(berpasangan) menyebabkan salah satu untaian (strand) DNA membentuk loop.. Kesalahan tersebut dinamakan dengan
slipped mispairing yang biasanya terjadi sementara dan segera akan diperbaiki. Mekanisme perbaikan terhadap slipped
mispairing juga dapat terjadi dan menyebabkan penghapusan (delesi) ratusan nukleotida dari salah satu kromosom. Jika
penghapusan (delesi) terjadi dan berakhir di tengah-tengah kodon (gen), maka akan menyebabkan pembacaan kodon.
Mengalami kesalahan
3 6 9 12 15 18
AUG UAU CCA AUU CCA UAG
fmet tyr pro try pro term
Hb VARIANT
-TOKUCHI Tyr
-Hb S Val
-Hb C Lys
-Hb G Gly
-J. Baltimore Asp
-Savanah Val
-Hb E Lys
-J. bangkok Asp
-Zurich Arg
-M. Saskaton Tyr
-N. Baltimore Glu
MUTASI KEMBALI ( BACK MUTATION)
- Hasil mutasi dapat merestorasi fenotip asal
Restorasi ke fenotip asal ada 2 jalan :
1. Murni terjadi mutasi kembali pada sisi gen yang sama
2. Mutasi kedua terjadi pada sisi gen yang lain mengkompensasi pada mutasi
pertama mutasi supresor tempat terjadinya supresor dapat pada satu kromosom/
kromosom yang berbeda.
DASAR MOLEKULER MUTASI :
T & G lebih stabil dalam bentuk keto, A & C lebih stabil dalam bentuk amino tetapi dapat mengalami
perubahan bentuk ENOL & AMINO kurang sta bil. Perubahan ini disebut TAUTOMERIK SHIFTS.
Kekurang stabilan disebabkan basa DNA mengalami pergantian : Purin yang satu diganti purin yang lain,
pirimidin satu diganti pirimidin yang lain,sehingga terjadi pasangan yang tidak biasa.
Misal : G dengan T/ A dengan C replikasi lagi : G = CT = A
atau A = T, C = G.
SEL NORMAL
SICKLE CELLS
Diagnostik molekuler merupakan pengujian untuk menganalisa penanda biologi secara genomik atau proteomik untuk
mendapatkan informasi kesehatan atau penyakit pasien dalam diagnostik klinis
Diagnostik molekuler memiliki kelebihan diantaranya sensitivitas yang tinggi dan dapat mendeterminasi jenis patogen dan
kekebalan antibiotiknya. Walaupun memiliki banyak kelebihan, masih terdapat hambatan terhadap pengaplikasian dalam
diagnostik klinis dalam hal biaya yang efektif
Diagnosis molekuler mempunyai nilai akurasi, sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi
- Mikrosatelit Merupakan daerah-daerah DNA dengan panjang unit-unit pengulangan kurang dari 1 kb (kilobasepair).
- Sampel yang telah terdegradasi dapat dianalisa, maka amplifikasi dengan mudah dilakukan dengan reaksi berantai
polimerase.
- Pengulangan yang sedikit hanya menghasilkan perbedaan alel dari individu heterozigot dengan ukuran yang sama.
Keberagaman jumlah pengulangan dalam penanda mikrosatelit di antara individu memberikan efektifitas tujuan
identifikasi manusia.
- Penanda mikrosatelit menjadi lebih baik pada ukuran alel mikrosatelit yang kecil. Penanda ini digunakan dalam
aplikasi forensic saat DNA yang rusak sangat banyak. Penyelesaian amplifikasi reaksi berantai polimerase dari sampel-
sampel DNA yang rusak menjadi lebih mudah pada ukuran penanda yang lebih kecil. Selama reaksi berantai
polimerase, DNA yang dibutuhkan relatif dalam jumlah yang sangat sedikit.
- Reaksi berantai polimerase juga dapat melakukan amplifikasi meski tingkat kesegaran DNA relatif lebih rendah. Teknik
ini lebih unggul dibandingkan dengan teknik Polimorfisme Panjang Berkas Restriksi yang selama ini digunakan dalam
pemeriksaan DNA forensik.
.
1. Metode LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification )
- Uji diagnostik molekuler cara langsung yang dilandasi oleh uji identifikasi asam nukleat bakteri
- Merupakan perpaduan antara metode nucleic acid sequencebased amplification (NASBA), metode self-sustained
sequence replication (3SR), dan metode strand displacement amplification (SDA).
- Kelebihan metode NASBA dan 3SR adalah amplikasi asam nukleat dilakukan pada suhu tetap dengan teknik
pemanfaatan transkripsi primer dan transkripsi balik
- kelebihan metode SDA ialah mampu meniadakan siklus denaturasi dengan cara menyediakan enzim restriksi dan
substrat DNA
- Gabungan ketiga metode ini yang membentuk metode LAMP yang memungkinkan proses amplifikasi berlangsung tanpa
perlu menunggu suhu denaturasi serta dapat meniadakan instrumen siklus termal dalam pelaksanaan reaksi
- Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan
cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui ] Teknik ini digunakan dalam riset
dasar biologi maupun berbagai bidang terapan seperti kedokteran, bioteknologi, forensic dan antropologi
- Sekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagi makhluk hidup untuk melangsungkan hidup dan berkembang
biak . penentuan sekuens DNA berguna di dalam ilmu pengetahuan 'murni' mengenai mengapa dan bagaimana makhluk
hidup dapat hidup, selain berguna dalam penerapan praktis. Karena DNA merupakan ciri kunci makhluk hidup, pengetahuan
akan sekuens DNA dapat berguna dalam penelitian biologi . Sebagai contoh, dalam ilmu pengobatan sekuensing DNA dapat
digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan penyakit genetic
. DNA SEQUENCING (PENGURUTAN ASAM NUKLEAT)
Penentuan urutan nukleotida dalam DNA dilakukan dengan DNA sequencing yang dilaksanakan dengan 2 metoda : -
1. Metode kimia (Metoda MAXAM & GILBERT) : metoda Ini didasarkan atas pemotongan DNA didaerah spesifik
oleh zat-zat kimiawi selain enzim.
2. Metode Sanger : sintesis DNA scr enzimatik terjadi melalui Pembentukan scr berurut ikatan fosfodiester antara
gugus fosfat ujung 5‘ bebas dari nukleotida Baru dengan gugus OH pada ujung 3‘ rantai yang sedang
memanjang.
Proses ini berlangsung sepanjang molekul DNA. Dideoksinukleotida tidak mempunyai Gugus OH pada ujung 3‘
nya, melainkan gugus H. Adanya dideoksinukleotida menyebabkan sintesis DNA terhenti, krn ikatan difosfat tidak
terbentuk. Pemanjangan rantai akan terhenti pada titik ini & basa terakhir di ujung 3‘ rantainya adl sebuah
terminator Dideoksi.
Dalam metode pengurutan Sanger, digunakan 4 campuran reaksi dalam pengurutan fragmen DNA. Tiap
campuran reaksi mgd molekul DNA cetakan yg akan diurutkan, primer yg telah dilabel dengan radioaktif, keempat
macam deoksinukleotida,DNA polimerase dan 4 terminator dideoksi (ddATP, ddCTP, ddGTP atau ddTTP). Jika
salah satu dari terminator ini digunakan pd untai DNA yang baru terbentuk,maka sintesis untai baru akan terhenti,
Hasilnya adl semua untai dgn panjang yg bervariasi pada campuran Reaksi akan berakhir dgn basa yang
sama. Produk radioaktif akan dipisahkan dgn elektroforesis dan divisualisasikan melalui autoradiografi. Hasil
autoradiografi dibaca dibawah GEL (fragmen terpendek yang berhenti paling dekat dengan ujung 5‘) kearah atas
untuk mengetahui sekuens basa komplementer dari untai cetakan.
Teknik Maxam & Gilbert
-Fragmen DNA yang akan diurutkan dilabel dengan radioaktif (32P) pada ujung 5ꞌꞌ
-Molekul DNA dipotong dengan piperidin
-DNA dimodifikasi menggunakan senyawa kimia tertentu
- Dimetilsulfat metilasi basa G
- Asam format Menghidrolisis A dan G
- Hidrazin menghidrolisis C dan T
Dihasilkan 4 jenis fragmen DNA dengan ukuran. Berbeda yang masing –masing memiliki
- ujung G
- ujung C
- ujung A
- ujung T
- Dielektroforesis dengan Gel poliakrilamida
- Berdasarkan pola migrasi pada gel elekroforesis dapat ditentukan urutan basa – basa DNA
METODE SANGER
Pada metode terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada
DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut primer yang komplementer terhadap DNA pada
daerah situs tersebut.
Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polymerase enzim yang mereplikasi DNA. Bersama dengan primer dan
DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basadeoksinukleotida (satuan pembentuk DNA), juga nukleotida
pemutus atau penghenti rantai (terminator rantai) dalam konsentrasi rendah (biasanya di-deoksinukleotida).
Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan
fragmen-fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida tertentu tersebut
tergabungkan.
Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya dengan elektroforesis gel poliakrilamida
Hibridisasi adalah proses menggabungkan dua pelengkap beruntai tunggal DNA atau RNA molekul dan memungkinkan
untuk membentuk molekul beruntai ganda dari rantai tunggal melalui pemasangan basa. Dalam pembalikan proses ini,
molekul DNA (atau RNA atau DNA/ RNA) beruntai ganda dapat dipanaskan untuk memecahkan pasangan basa dan
memisahkan dua untai. Hibridisasi adalah bagian dari teknik laboratorium penting seperti reaksi berantai polimerase dan
Southern blotting .
Blotting,” adalah istilah yang mengacu pada proses mendeteksi keberadaan dan kuantitas DNA, RNA, atau protein dalam
sel
Hibridisasi Southern adalah proses perpasangan antara DNA yang menjadi sasaran dan DNA pelacak. Hibridisasi southern
biasa digunakan untuk melacak adanya DNA yang sesuai dengan pelacak, misalnya untuk mengetahui integrasi transgen di
dalam organisme transgenik.
Berdasarkan prinsipnya, hibridisasi southern dapat dibagi ke dalam 4 tahap, yaitu : (1) fiksasi DNA di membran
(nitroselulosa atau nilon); (2) pelabelan pelacak; (3) prehibridisasi dan hibridisasi; dan (4) deteksi hasil hibridisasi.
Fiksasi DNA di membran dapat dilakukan melalui beberapa cara, yaitu (1) penetesan DNA (dot blot) langsung di membran;
(2) fiksasi DNA bakteri replika (plasmid rekombinan) di membran; (3) fiksasi DNA fage rekombinan dari satu replika plak di
membran; dan (4) transfer DNA dari gel agarose (yang sebelumnya telah dimigrasikan dengan elektroforesis) ke membran.
Membran yang dipergunakan untuk memfiksasi DNA biasanya menggunakan membran nilon karena lebih kuat daripada
membran nitroselulosa. Dot blot dan hibridisasi terhadap DNA replika hanya dapat digunakan untuk mendeteksi
keberadaan DNA tetapi tidak dapat mengetahui ukurannya. Sebaliknya, hibridisasi southern terhadap DNA yang difiksasi ke
SOUTHERN BLOTTING ( untuk DNA)
•Southern blotting digunakan untuk mendeteksi urutan DNA spesifik dalam campuran. Langkah-langkah yang terlibat dalam
Southern blotting adalah:
Urutan pelaksanaannya sbb :
a. Isolasi DNA sel , dapat juga digunakan gen yang sudah digandakan
b. Pemotongan DNA oleh enzim endonuklease restriksi, menghasilkan DNA yg terpotong fragmen –
fragmen yg dibatasi oleh 2 tempat restriksi.
c. ELEKTROFORESIS GEL.
Fragmen DNA akan bergerak sepanjang medan listrik dengan kecepatan yang berbeda-beda tergantung panjang
fragmen.
d. Pengalihan (BLOTTING) fragmen DNA dari Gel ke kertas saring melalui difusi.
e. Pemanasan kertas saring, akan membuka heliks ganda fragmen DNA menjadi 2 berkas yang saling komplementer
f. Aplikasi pelacak (PROBE) radioaktif. Pelacak dapat berupa cDNA atau mRNA yang di beri tanda atau muatan
radioaktif dengan urutan nukleotida yg komplementer dgn gen atau fragmen DNA yang diperiksa. Pelacak akan
berikatan dengan berkas DNA yg komplementer.
g. Kertas saring yang basah oleh larutan pembasuh kemudian dikeringkan & ditempel Kan pada film sinar X
h. Film dicuci, kemudian diperiksa,akan terlihat pita putih pada foto sinar X
SOUTHERN BLOTTING digunakan untuk mendeteksi :
- Delesi yang panjang
- Mutasi titik, bila mutasi tsb menghapus atau menimbulkan tempat restriksi.
- Southern blots digunakan untuk penemuan, pemetaan, dan evolusi dari suatu gen. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi
pada organisme,
- Southern blot digunakan sebagai test untuk memastikan bahwa bagian DNA tertentu mengenal urutan gen.
Blot utara adalah metode laboratorium yang digunakan untuk mendeteksi molekul RNA spesifik di antara campuran RNA.
Northern blotting dapat digunakan untuk menganalisis sampel RNA dari jaringan atau tipe sel tertentu untuk mengukur
ekspresi RNA dari gen tertentu.
Northern blot adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk mendeteksi urutan RNA tertentu dalam sampel darah atau
jaringan. Molekul RNA sampel dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan elektroforesis gel. Fragmen RNA dipindahkan
dari gel ke permukaan membran. Membran terkena probe DNA berlabel dengan tag radioaktif atau kimia. Jika probe
mengikat membran, maka urutan RNA komplementer ada dalam sampel
1. Elektroforesis – Proses ini memisahkan sampel RNA menjadi pita yang berbeda berdasarkan ukurannya.
2. Transfer – Pita RNA dari gel ditransfer ke membran melalui aksi kapiler.
3. Identifikasi urutan spesifik – Urutan RNA target diidentifikasi melalui hibridisasi dengan probe oligonukleotida DNA yang
ditandai.
NORTHERN BLOTTING
DOT BLOTTING
Suatu tehnik untuk mengetahui ada atau tidak adanya molekul (yang dapat dideteksi oleh probe DNA atau antibodi).
Dot Blot merupakan sebuah teknik yang digunakan untuk mendeteksi, menganalisis,dan mengidentifikasi protein. Teknik
ini menyerupai Western Blot namun perbedaannyaa dalah protein sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis akan
tetapi ditandai dengan template sirkuler secara langsung pada substrat kertas. Konsentrasi protein dalam preparasi mentah
atau kasar (misalnya kultur supernatan) dapat diperkirakan secara semikuantitatif dengan menggunakan teknik ini jika
dimiliki protein yang terpurifikasi dan antibodi untuk protein tersebut.
Dot blot dapat digunakan untuk perhitungan kualitatif pada rapid screening dari jumlah sampel yang besar atau
sebagai tehnik kuantitatif, dan terutama berguna untuk menguji kesesuaian parameter dalam desain eksperimental . Dot
blot merupakan uji serologis yang fungsinya sama dengan Western blot , yaitu untuk mendeteksi kespesifikan antara
antigen dan antibodi.
Western blot adalah sebuah metode untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan. Imunoblot menggunakan
elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli atau perubahan oleh jarak polipeptida atau oleh struktur 3-D protein.
Protein tersebut dikirim ke membran, di mana mereka dideteksi menggunakan antibodi untuk menargetkan protein.
Western blotting adalah teknik yang digunakan untuk mengidentifikasi urutan asam amino spesifik dalam campuran protein
DOT BLOTTING
P
LANGKAH-LANGKAHNYA sbb :
a. Aplikasi DNA pada 2 lembar membran nylon biasanya digunakan fragmen DNA yg sudah digandakan dengan
PCR.
b. Pemanasan membran nylon untuk memisahkan heliks ganda DNA
c. Aplikasi ASOP ( Allele Spesific Oligonukleotida Probe), digunakan 2 jenis ASOP :
- ASOP NORMAL (ASOP N) : dapat mengikat alele normal
- ASOP MUTAN (ASOP M) : dapat mengikat alele mutan
ASOP N diaplikasikan pada salah satu membran sedangkan ASOP M pada membran lain
d. Membran ditempelkan pada film sinar X
e. Film dicuci & diperiksa akan terlihat bercak (Dot) putih pada film sinar X.
DOT BLOTTING digunakan : untuk deteksi mutasi titik. Syaratnya : mutasi telah diketahui sebelumnya.
Menggunakan probe cDNA atau Menggunakan DNA untai tunggal Menggunakan antibodi terhadap
RNA dengan label radioaktif atau atau RNA sebagai probe epitop antigen sebagai probe
non-radioaktif
Dapat digunakan dalam studi Digunakan untuk identifikasi Dapat mengukur protein dalam
ekspresi gen dan diagnosis kriminal, identifikasi korban, tes sampel, mendeteksi bakteri dan
penyakit paternitas, dan sidik jari DNA virus dalam serum, dan
mengidentifikasi antibodi
terhadap HIV. Hal ini juga dapat
mengidentifikasi protein yang
rusak.
Teknologi Hibridisasi
Hibridisasi Metode Target Probe Tujuan
Southern blot DNA Asam Nukleat Struktur gen
Northern blot RNA Asam Nukleat Struktur transkripsi,
pemrosesan, ekspresi
gen
Western blot Protein Protein Pemrosesan protein,
ekspresi gen
Southwestern blot Protein DNA DNA binding protein
regulasi gen
5. Microarray
Pendekatan laboratorium umum yang melibatkan pengikatan ribuan hingga jutaan fragmen asam nukleat yang
diketahui ke permukaan padat, disebut sebagai "chip." Chip tersebut kemudian dimandikan dengan DNA atau RNA yang
diisolasi dari sampel penelitian (seperti sel atau jaringan).
DNA microarray adalah salah satu jenis alat yang dapat digunakan untuk mengetahui apakah DNA seseorang mengalami
mutasi pada gen seperti BRCA1 atau BRCA2. Chip ini terdiri dari pelat kaca kecil yang dibungkus plastik. Perusahaan
tertentu membuat microarray dengan menggunakan teknik yang mirip dengan yang digunakan untuk memproduksi
microchip untuk komputer. Di luar setiap chip terdiri dari ribuan sekuens DNA beruntai tunggal yang sintetik yang
semuanya membentuk gen normal serta variasi (mutasi) gen yang ditemukan dalam populasi manusia.
Prinsip microarray DNA didasarkan pada hibridisasi antara untaian asam nukleat. Urutan asam nukleat komplementer
dapat secara khusus berpasangan satu sama lain dengan membentuk ikatan hidrogen antara pasangan basa nukleotida
komplementer. Dalam teknologi microarray DNA, sampel diberi label dengan pewarna fluoresen, dan setidaknya dua
sampel digabungkan menjadi sebuah chip.
Selama hibridisasi, urutan asam nukleat komplementer antara sampel dan probe yang melekat pada chip membentuk
ikatan hidrogen. Urutan ikatan non-spesifik tetap tidak terikat dan terhapus selama langkah pencucian proses. Urutan
target berlabel berfluoresensi yang berikatan dengan probe menghasilkan sinyal.
Kekuatan sinyal tergantung pada berbagai faktor seperti kondisi hibridisasi (misalnya suhu) dan pencucian setelah
hibridisasi. Kekuatan total sinyal tergantung pada jumlah sampel target yang ada. Dengan memanfaatkan teknologi ini,
dimungkinkan untuk menyaring keberadaan satu urutan genomik atau cDNA di antara 100,000 atau lebih urutan dalam
satu hibridisasi.
Merupakan replikasi materi genetik dilaksanakan oleh enzim DNA polimerase. Enzim tersebut menginisiasi
sintesis DNA dengan berawal dari primer yang berikatan dengan cetakan. Primer umumnya panjang 9 – 25 basa
dan menentukan situs dimulainya replikasi DNA.
- Tujuan PCR : menggandakan gen (gene cloning)
- Prinsip utama PCR adalah menggandakan untai DNA melalui alat yang bernana thermal cycler. Thermal cycler merupakan alat
yang dapat mengatur suhu rendah dan tinggi secara kontinyu serta dapat diulang-ulang sesuai kebutuhan. Suhu digunakan
untuk menjalankan reaksi berantai dalam menggandakan untai DNA atau RNA.
- Cara kerja : dimulai dari pengikatan dua oligonukleotida (primer) yang telah diketahui komposisinya ke suatu
sekuens target yang diinginkan. Kmd DNA polimerase akan memperpanjang oligonukleotida tersebut. Setiap reaksi
akan kan diulang setelah tahap denaturasi sehingga terjadi amplifikasi (penguatan) secara eksponensial.
- Pada PCR terdapat 3 suhu atau tahapan inkubasi yg diulangi sebanyak 20 – 50x. Satu ulangan dari ketiga tahap ini
disebut siklus.
- Tahap pertama : DENATURASI : dimana kedua untai molekul DNA target akan terpisah oleh pemanasan DNA
pada suhu 94ºC untuk memutus ikatan H diantara basa-basa, Menghasilkan dua untai DNA terpisah
- Tahap kedua : PENEMPELAN (ANNEALING), dimana 2 primer akan terhibridisasi menjadi sekuens
komplementer pada untai tunggal DNA, primer akan membentuk ikatan H (menempel) dengan sekuens
komplementernya sehingga terbentuklah Molekul untai ganda yang stabil. Suhu penempelan antara 37 - 60ºC.
- Tahap ketiga : EKSTENSI (ELONGASI), primer akan diperpanjang oleh DNA polimerase pada suhu 72ºC.
- Suatu tehnik untuk melipatgandakan target DNA sehingga mudah dimanipulasi & dipelajari.
PERSYARATAN PENTING :
- Urutan nukleotida pd kedua ujung gen/fragmen DNA yg akan digandakan sudah diketahui
memungkinkan pembuatan oligonukleotida yg akan digunakan sbg pemicu (primer).
- Gen/fragmen DNA yg telah digandakan kemudian dianalisis lebih lanjut,mis: ditentukan urutan
nukleotidanya(DNA sequencing).
MEKANISME KERJA :
1. Denaturasi : pemisahan double stranded DNA template menjadi single stranded pd suhu tinggi > 90ºC.
2. Annealing : penempelan primer ke DNA template yg komplementer.
3. Extension : perpanjangan fragmen DNA target yg diamplifikasi.
1. Denaturasi Di dalam proses PCR,
denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan
proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk
meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan
DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR.
Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut
mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5 °C.
PCR mesin
FRAGMEN DNA/ CETAKAN DNA
PRIMER
KRITERIA PRIMER
CARA DESAIN PRIMER
8. Lakukan Konfirmasi
Proses PCR
Proses PCR
PCR mesin
1. Real-Time PCR / RT-PCR / quantitative PCR / qPCR
Real-Time PCR / qPCR atau disebut quantitive PCR adalah metode amplifikasi DNA yang melibatkan proses kuantifikasi
DNA hasil PCR secara langsung untuk mengetahui konsentrasinya. PCR konvensional biasanya menggunakan elektroforesis
gel agarosa untuk memvisualisasikan produk PCR, sedangkan qPCR sudah secara langsung difasilitasi analisis produk PCR
yang real time saat fase eksponensial reaksi.
Prinsip utama Real-Time PCR adalah menggunakan biomarker berupa pewarna fluorescent untuk memberi
pelabelan pada oligonukleotida yang akan ditambahkan pada reaksi. Konsentrasi produk hasil PCR berupa pita
DNA ditampilkan berupa grafik pada layar komputer sebagai dasar analisis. qPCR diaplikasikan dalam studi
genotiping dan kuantifikasi patogen, microRNA, deteksi kanker, rapid-test bakteri dan virus, dan deteksi
organisme yang direkayasa (GMO).
4. Nested PCR
Nested PCR merupakan modifikasi dari teknik PCR untuk meningkatkan spesifisitas untuk memperoleh produk yang
spesifik.
Modifikasi dilakukan dalam penggunaan primer saat reaksi. Pada teknik konvensional hanya digunakan 1 pasang primer,
namun pada nested PCR menggunakan 2 pasang primer berbeda (A dan B) serta melibatkan 2 tahap reaksi amplifikasi.
Reaksi pertama, sepasang primer pertama (A) akan mengamplifikasi DNA template diluar dari fragmen target dalam jumlah
yang besar. Produk amplifikasi reaksi pertama digunakan sebagai template baru pada reaksi kedua yang diamplifikasi oleh
sepasang primer kedua (B) pada bagian spesifik pada DNA target.
Penggunaan 2 pasang primer oligonukleotida dapat meningkatkan siklus dan sensitifitas reaksi PCR, serta efisien untuk
mengamplifikasi DNA target dari template DNA yang panjang.
5. Multiplex PCR
Multiplex PCR digunakan untuk mengamplifikasi banyak target fragmen DNA dalam satu kali reaksi PCR. Kuncinya adalah
penggunaan primer dalam jumlah banyak yang telah dioptimasi berdasarkan suhu terbaik dari masing-masing primer.
Metode ini biasanya diaplikasikan dalam banyak studi genotiping, mutasi, dan analisis polimorfisme, analisis STR (Short
Tandem Repeat) mikrosatelit, deteksi patogen dan GMO. Di laboratorium dapat digunakan sebagai dasar membedakan terhadap
jenis-jenis bakteri penyebab penyakit yang sama.
adalah penerapan teknik komputasi untuk mengelola dan menganalisis informasi biologis
Mencakup penerapan metode matematika , statistic , dan informatika untuk memecahkan masalah biologi, terutama
dengan menggunakan rangkaian DNA dan asam amino serta informasi terkait.
Sebagai Contoh topik utama dalam hal ini adalah pelacakan basis data untuk mengumpulkan informasi biologis,
penyelarasan urutan ( sequence alignment ), prediksi struktur untuk memprediksi bentuk struktur protein serta struktur
sekunder RNA , analisis filogenetik , dan analisis ekspresi gen .
Kemajuan teknik biologi molekuler untuk menemukan sekuens biologi dari protein (sejak awal 1950 ) dan asam nukleat
(sejak tahun 1960an) memulai pengembangan database dan teknik analisis sekuens biologis. Basis data sekuens protein
dikembangkan pada 1960 di Amerika Serikat , sedangkan basis data sekuens DNA dikembangkan pada akhir tahun 1970
di Amerika Serikat dan Jerman (di Laboratorium Biologi Molekuler Eropa ).
Penemuan teknik sekuensing DNA yang lebih kompleks pada pertengahan 1970 menjadi dasar ledakan jumlah sekuens
DNA yang berhasil diungkap pada tahun 1980 dan 1990 , menjadi salah satu pionir proyek penemuan genom, sehingga
meningkatkan kebutuhan. untuk manajemen dan analisis sekuens, dan akhirnya mengarah pada lahirnya bioinformatika.
Perkembangan internet juga mendorong berkembangnya bioinformatika. Basis data bioinformatika yang tersedia melalui
internet memudahkan para ilmuwan untuk mengumpulkan hasil sekuensing ke database serta memperoleh sekuens
biologis sebagai bahan analisis. Selain itu, penyebaran program aplikasi bioinformatika melalui internet memudahkan
para ilmuwan untuk mengakses program tersebut dan kemudian memfasilitasi pengembangannya
APLIKASI UTAMA BIOINFORMATIKA
Sesuai dengan jenis informasi biologis yang disimpan, database sekuens biologis dapat berupa database primer untuk
menyimpan sekuens primer asam nukleat atau protein , database sekunder untuk menyimpan motif sekuens protein , dan
database struktur untuk menyimpan struktur protein atau asam nukleat.
Database utama sekuens asam nukleat saat ini adalah Genbank (Amerika Serikat), EMBL (Eropa), dan DDBJ ( DNA Data
Bank of Japan , Jepang ). Ketiga database bekerja sama dan bertukar data setiap hari untuk menjaga cakupan setiap
database. Sumber utama data urutan asam nukleat adalah penyerahan langsung dari masing-masing peneliti, proyek
pengurutan genom , dan pendaftaran paten . Selain kandungan urutan asam nukleat, entri dalam database urutan asam
nukleat biasanya berisi informasi tentang jenis asam nukleat ( DNA atau RNA), nama organisme sumber asam nukleat, dan
literatur terkait urutan asam nukleat.
contoh database penting yang menyimpan sekuens protein primer adalah PIR Archived 2006-01-11 at the Wayback
Machine ( Sumber Informasi Protein , Amerika Serikat), Swiss-Prot (Eropa), dan TrEMBL (Eropa). Ketiga database tersebut
telah digabungkan dalam UniProt (yang sebagian besar didanai oleh Amerika Serikat). Entri di UniProt berisi informasi
tentang urutan protein, nama organisme sumber protein, literatur terkait, dan komentar yang biasanya berisi penjelasan
tentang fungsi protein.
BLAST ( Basic Local Alignment Search Tool ) merupakan alat bioinformatika yang erat kaitannya dengan penggunaan
database sekuens biologis. Pencarian BLAST ( pencarian BLAST ) dalam database sekuens memungkinkan para ilmuwan
untuk mencari sekuens asam nukleat serta protein yang cocok dengan sekuens spesifik yang mereka miliki. Hal ini berguna
misalnya untuk mengetahui JENIS GEN pada suatu oranisme atau untuk memeriksa validitas hasil sekuensing serta
memeriksa fungsi gen dari hasil sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyelarasan urutan.
PDB diarsipkan 28-08-2008 di Wayback Machine . ( Bank Data Protein , Bank Data Protein) adalah database tunggal yang
menyimpan model struktur tiga dimensi protein dan asam nukleat sebagai hasil temuan eksperimental
(dengan Kristalografi Sinar X, spektrokopi NMR dan mikroskop electron ). PDB menyimpan data struktural sebagai
koordinat tiga dimensi yang menggambarkan posisi atom dalam protein atau asam nukleat.
PENYELARASAN URUTAN
Penjajaran barisan ( sequencealignment ) adalah proses menyusun/mengatur dua sequence atau lebih sehingga kemiripan
antar sequence tampak nyata. Hasil dari proses tersebut disebut juga dengan penyelarasan urutan atau
sekadar penyelarasan . Barisan barisan dalam suatu perataan disisipkan (biasanya dengan tanda "–") sehingga kolom-kolom
tersebut memuat karakter yang identik atau mirip di antara barisan tersebut. Di bawah ini adalah contoh penyelarasan DNA
dari dua rangkaian DNA pendek yang berbeda, "ccatcaac" dan "caatgggcaac" (tanda "|" menunjukkan
kecocokan antara kedua rangkaian tersebut).
ccat---caac
| || ||||
caatgggcaac
Penyelarasan urutan adalah metode dasar dalam analisis urutan. Metode ini mempelajari evolusi barisan dari nenek moyang
yang sama ( common nenek moyang ). Ketidaksesuaian pada keselarasan dikaitkan dengan proses mutasi sedangkan
kesenjangan ( gap , tanda “–”) dikaitkan dengan proses penyisipan atau penghapusan. Penyelarasan
sekuens memberikan hipotesis terhadap proses evolusi yang terjadi pada sekuens tersebut. Misalnya, dua sekuens pada
contoh penyelarasan di atas dapat merupakan evolusi dari sekuens yang sama "ccatgggcaac". Sehubungan dengan bab
ini, penyelarasan juga dapat menunjukkan posisi-posisi yang dilestarikan ( conserved ) selama evolusi rangkaian protein ,
yang menunjukkan bahwa posisi-posisi tersebut dapat menjadi penting bagi struktur atau fungsi protein.
Selain itu, penyelarasan urutan juga digunakan untuk menemukan urutan serupa dalam database urutan . BLAST
merupakan metode penyelarasan yang sering digunakan dalam pencarian database secara berurutan. BLAST
menggunakan algoritma heuristik dalam penyusunan penyelarasan .
Beberapa metode penyelarasan lain yang mendahului BLAST adalah metode "Needleman-Wunsch" dan "Smith-
Waterman". Metode Needleman-Wunsch merupakan penyelarasan global antara dua sekuens atau lebih, yang
merupakan penyelarasan seluruh sekuen. Metode Smith-Waterman menghasilkan penyelarasan lokal , yang
merupakan penyelarasan untuk bagian-bagian internal dari barisan tersebut. Kedua metode tersebut
menerapkan pemrograman dinamis ( dynamic programming ) dan hanya efektif untuk penyelarasan dua urutan
( pairwisealignment ).
Metode lain yang dapat digunakan untuk penyelarasan urutan adalah metode yang berkaitan dengan Hidden Markov
Model (“Hidden Markov Model”, HMM ). HMM merupakan model statistik yang pertama kali digunakan dalam ilmu c
omputer untuk mengenali ucapan manusia ( speech recognition ). Selain digunakan untuk penyelarasan, HMM juga
digunakan dalam metode analisis sekuens lainnya, seperti prediksi kode protein dalam genom dan prediksi struktur
sekunder protein.
PREDIKSI STRUKTUR PROTEIN
Secara kimia/fisik, bentuk struktur protein diketahui melalui kristalografi sinar X atau spektroskopi NMR , namun
kedua metode ini sangat memakan waktu dan relatif mahal. Sedangkan metode pengurutan protein relatif lebih
mudah untuk mengungkap urutan asam amino protein. Prediksi struktur protein berupaya untuk memprediksi
struktur tiga dimensi suatu protein berdasarkan urutan asam aminonya (dengan kata lain, memprediksi struktur
tersier dan struktur sekunder berdasarkan struktur primer protein). Secara alami, metode prediksi struktur protein
yang ada dapat dikategorikan menjadi dua kelompok, yaitu metode pemodelan protein komparatif dan metode
pemodelan de novo .
Pemodelan protein komparatif memprediksi struktur suatu protein berdasarkan struktur protein lain yang diketahui. Salah
satu penerapan metode ini adalah pemodelan homologi , yaitu memprediksi struktur tersier suatu protein berdasarkan
persamaan struktur primer protein tersebut. Model homologi didasarkan pada teori bahwa dua protein homolog memiliki
struktur yang sangat mirip satu sama lain. Dalam metode ini, struktur suatu protein (disebut protein target) ditentukan
berdasarkan struktur protein lain (protein templat) yang telah diketahui dan mempunyai kemiripan urutan dengan protein
target.
Selain itu, penerapan pemodelan komparatif lainnya adalah penguliran protein berdasarkan kesamaan struktural tanpa
kesamaan urutan primer. Latar belakang penguliran protein adalah bahwa struktur protein lebih kekal dibandingkan urutan
protein sepanjang evolusi; area yang penting untuk fungsi protein dipertahankan dalam strukturnya. Dalam pendekatan ini,
struktur yang paling kompatibel untuk rangkaian asam amino dipilih dari semua jenis struktur protein tiga dimensi yang
ada. Metode yang termasuk dalam protein threading mencoba menentukan tingkat kompatibilitasnya.
Pada pendekatan de novo atau ab initio , struktur protein ditentukan dari sekuens primer tanpa membandingkannya
dengan struktur protein lainnya. Ada banyak keuntungan dalam pendekatan ini, misalnya dengan mensimulasikan
proses pelipatan protein dari deret primer ke struktur tersier (misalnya dengan simulasi dinamika molekuler ), atau dengan
optimalisasi fungsi energi protein secara global. Prosedur ini lebih intensif secara komputasi, sehingga saat ini hanya
digunakan saat menentukan struktur protein kecil. Beberapa upaya telah dilakukan untuk mengatasi kekurangan sumber
daya komputasi, misalnya dengan superkomputer (misalnya superkomputer Blue Gene (1) dari IBM ) atau komputasi
terdistribusi ( distributed computing , misalnya proyek Folding @home ) serta komputasi grid
ANALISIS EKSPRESI GEN
Ekspresi gen dapat ditentukan dengan mengukur kadar mRNA dengan berbagai teknik (misalnya microarray atau
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE]). Teknik-teknik ini biasanya diterapkan dalam analisis ekspresi gen skala
besar yang mengukur ekspresi banyak gen (bahkan genom ) dan menghasilkan data berskala besar. Metode
data mining diterapkan pada data untuk mendapatkan pola yang informatif. Misalnya, metode komparatif
digunakan untuk membandingkan ekspresi antar gen, sedangkan metode clustering digunakan untuk
menganalisis data berdasarkan persamaan ekspresi gen.