Pemeriksaan Tes Cepat Molekuler

Xpert MTB/RIF Ultra untuk

Mendeteksi Mycobacterium
tuberculosis dan Kepekaan terhadap
Rifampisin

Basti Andriyoko
Departemen/KSM Patologi Klinik
Fakultas Kedokteran Universitas
Padjadjaran Rumah Sakit Umum Pusat Dr
Hasan Sadikin
Bandung
Disclaimer

• Tidak disponsori oleh pihak manapun

Xpert® MTB/RIF
 Catridge MTB/RIF Catridge MTB/RIF Ultra
Deteksi Mycobacterium MTB complex MTB complex
Deteksi Resistensi Mendeteksi resistensi rifampisin Mendeteksi resistensi
sebagai surrogate untuk TB- rifampisin sebagai
MDR surrogate untuk TB-MDR
Amplifikasi untuk deteksi TB Single target: Multi target:
rpoB core region - rpoB core region
- IS6110 + IS1081
Deteksi resistensi Real-time PCR Melting curve
5 probes bind to rpoB gene 4 probes bind to rpoB gene
Volume spesimen yang dimasukkan ke 2 ml 2 ml
dalam
catridge
Volume reaksi PCR 25 ul 50 ul
Turnaround time 112 min 65-87 min
Limit of detection 131 cfu/ml 16 cfu/ml
Sensitivitas dan spesifisitas untuk diagnosis 85% dan 98% 90% dan 96%
tuberkulosis paru
Sensitivitas dan spesifisitas untuk diagnosis 81% dan 98% 88% dan 95%
tuberkulosis paru pada populasi HIV
Sensitivitas dan spesifisitas untuk 96% dan 98% 94% dan 99%
mendeteksi resistensi rifampisin
pada tuberkulosis paru
Target Cakupan Setiap Probe pada Xpert MTB/RIF Ultra
untuk Mendeteksi MTB dan Kepekaan Rifampisin

Target Gen
 IS6110 + IS1081  Untuk mendeteksi Mycobacterium tuberculosis
(MTB positif atau negatif)

 rpoB :
 Kepekaan rifampisin (Rifampisin resisten atau sensitif)
 Dibagi menjadi 4 daerah deteksi: rpoB1, rpoB2, rpoB3, rpoB4
(menggunakan Sloppy molecular beacon)
Wile BM, Ban K, Yoon Y-S, Bao G. Molecular beacon–enabled purification of living cells by
targeting cell type–specific mRNAs. Nature Protocols. 2014;9(10):2411-24.
Sloppy molecular beacon probes

Schematic representation of the four sloppy molecular beacon probes. Each probe possessed a different sequence and a differently colored fluorophore,
enabling the four probes to be used simultaneously in the same reaction mixture and to be distinguished from each other by the spectrofluorometric thermal
cycler used to perform the assays. Probe A was labeled with fluorescein (red) and dabcyl (gray), probe B was labeled with Alexa Fluor 546 (blue) and dabcyl,
probe C was labeled with Alexa Fluor 594 (orange) and BHQ2 (black), and probe D was labeled with Cy5 (green) and BHQ2.

El-Hajj HH, Maíías SA, ľyagi S, Shashkina E, Kamboj M, Kiehn ľE, Glickman MS, Kíameí FR, Alland D. Use of sloppy moleculaí beacon
píobes foí identification of mycobacteíial species. J Clin Micíobiol. 2009 Apí;47(4):1190-8
 Xpert® MTB/RIF
5 probe molecular beacon
• Sequence yang lebih pendek
• Tidak akan menempel bila ada mutasi
 target failure Digunakan
untuk menentukan resistensi
4 probe sloppy molecular beacon (SMB)
• Sequence yang lebih Panjang
• Tidak terpengaruh oleh silent mutation
(tetap menempel walaupun ada mutasi)
 menggunakan analisis melt peak
untuk menentukan resistensi
Analisis menggunakan melting temperature

• Melting temperatur (Tm) adalah

temperatur yang diperlukan untuk
memisahkan setengah (50%) dari
untai ganda DNA menjadi satu
untai (single stranded).
• Nilai Tm setiap sequence bersifat
spesifik sesuai dengan jumlah
ikatan G-C dan A-T yang dimiliki.
• Apabila terdapat mutasi, akan
terjadi perubahan profil nilai
Tm
bila dibandingkan dengan wild type Depiction of the primer melting temperature (T
) at which 50%
m
of the double stranded DNA dissociates into single stranded
DNA
https://the-dna-universe.com/2022/09/05/primer-design-guide-
the-top-5-factors-to-consider-for-optimum-performance/
 Analisis menggunakan Kurva Melting
• Kurva melting diperoleh dengan cara
mendenaturasi (melting) DNA atau
cDNA melalui rentang perubahan suhu
yang akan menyebabkan perubahan
sinyal fluoresensi
• Sinyal fluoresensi akan tinggi saat
untai berpasangan, dan menurun saat
untai terpisah

A Guide to High Resolution Melting (HRM) Analysis: Fundamentals of Fluorescent

DNA Melting Analysis. www.appliedbiosystems.com
(A) Menggambarkan nilai Tm dari 4 sequence wild type (rpo1-4);
(B) Menggambarkan pergeseran nilai Tm menjadi lebih rendah pada
sequence rpo1 akibat mutasi L511P (sequence mutan)
(C) Deteksi sequence heteroresisten pada berbagai proporsi strain wild
type dan mutan dalam satu spesimen.

WT: wild type; mut: mutan.

 Database nilai Tm pada Xpert MTB/RIF Ultra
Sequence wild type Sequence mutan
rpoB1 melt rpoB1 Mut melt
rpoB2 melt rpoB2 Mut melt
rpoB3 melt rpoB3 Mut melt
- rpoB4 Mut melt A
rpoB4 melt
- rpoB4 Mut melt B
Database nilai Tm Wild Type

Database nilai Tm mutan  Cao Y, Parmar H, Simmons AM, Kale D, Tong K, Lieu D, et al. Automatic Identification of Individual rpoB Gene Mutations Responsible for Rifampin
Resistance in Mycobacterium tuberculosis by Use of Melting Temperature Signatures Generated by the Xpert MTB/RIF Ultra Assay. J Clin Microbiol. 2019;58(1).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6935902/pdf/JCM.00907-19.pdf
Algoritme Xpert MTB/RIF Ultra
Gen IS gagal/tidak terdeteksi Fail
Invalid karena gen IS
tidak terdeteksi, sehingga
rpoB diabaikan
Notes: MTB DETECTED TRACE, RIFAMPICIN INDETERMINATE
(DNA Mycobacterium tuberculosis terdeteksi dengan jumlah sangat sedikit, resistensi
Rifampisin belum dapat ditentukan
Pelaporan hasil Xpert MTB/RIF Ultra
Hasil
MTB Negative
MTB Detected (High, Medium, Low, Very Low);
Rifampicin Resistance Not Detected
MTB Detected (High, Medium, Low, Very Low);
Rifampicin Resistance Detected
MTB Detected (High, Medium, Low, Very Low);
Rifampicin Resistance Indeterminate
MTB Detected Trace, Rifampicin Resistance
Indeterminate
Invalid
Error
No result
Interpretasi
DNA MTB tidak terdeteksi
DNA MTB terdeteksi, resistensi rifampisin tidak
terdeteksi (rifampisin sensitif)
DNA MTB terdeteksi, resistensi rifampisin terdeteksi
(rifampisin resisten)
DNA MTB terdeteksi, resistensi rifampisin tidak dapat
ditentukan
DNA MTB terdeteksi sangat sedikit (trace), resistensi
rifampisin tidak dapat ditentukan
Keberadaan MTB belum dapat ditentukan karena
terjadi kegagalan proses pemeriksaan karena kontrol
gagal
Keberadaan MTB belum dapat ditentukan karena terjadi
kegagalan proses pemeriksaan karena faktor
hardware atau spesimen (lihat kode error)
Keberadaan MTB belum dapat ditentukan karena data
tidak mencukupi akibat proses pemeriksaan dalam alat
terhenti
 Interpretasi hasil Xpert Ultra
• Kelemahan dari pemeriksaan berbasis molekuler untuk
mendeteksi patogen
 Tidak dapat membedakan antara materi genetik yang berasal
dari patogen hidup atau hanya sisa dari patogen mati.
 Interpretasi hasil dilakukan dengan mempertimbangkan
klinis, riwayat penyakit, dan riwayat pengobatan pasien
sebelumnya
• Hasil MTB trace:
• Pertimbangkan kemungkinan sisa DNA dari pengobatan sebelumnya
 penting diperoleh informasi mengenai riwayat pengobatan serta
klinis dan penunjang lainnya seperti radiologis untuk pengambilan
keputusan diagnosis tuberkulosis.
• Riwayat pengobatan TB: Riwayat minum obat OAT dalam kurun
waktu 5 tahun kebelakang.
WHO consolidated guidelines on tuberculosis. Module 3: diagnosis - rapid diagnostics for tuberculosis detection, 2021 update
World Health Organization. Frequently asked questions about the WHO Technical
Expert Consultation findings on Xpert® MTB/RIF Ultra. 2017.
 Hasil MTB Trace
• Pada spesimen-spesimen yang berasal dari kelompok tertentu
seperti pasien HIV, anak, dan ekstrapulmonal (paucibaciller) hasil
MTB Trace dapat dipertimbangkan sebagai hasil positif (true positive)
untuk pengambilan keputusan klinis, karena umumnya pada
kelompok tersebut bersifat paucibaciller

• Pada hasil MTB Trace, kepekaan rifampisin belum dapat ditentukan

 penelaahan kasus lebih lanjut diperlukan (riwayat pengobatan
sebelumnya ?), penggunaan tes lain (kultur dan uji kepekaan OAT)

WHO consolidated guidelines on tuberculosis. Module 3: diagnosis - rapid World Health Organization. Frequently asked questions about the WHO
diagnostics for tuberculosis detection, 2021 update Technical Expert Consultation findings on Xpert® MTB/RIF Ultra. 2017.
Alur Penegakkan diagnosis TBC
 Detecting mutations
associated with resistance
towards
• isoniazid (INH),
• fluoroquinolones (FLQ),
• second-line injectable drug
(SLID) (amikacin,
kanamycin, capreomycin),
• ethionamide (ETH)

https://www.cepheid.com/en/tests/Critical-Infectious-Diseases/Xpert-MTB-XDR
Bainomugisa A, Gilpin C, Coulter C, Marais BJ. New Xpert MTB/XDR: added value and
future in the field. European Respiratory Journal. 2020;56(5):2003616.
Contoh Kasus
Kasus 1.
Pasien anak, 8th
Spesimen:
Sputum

• Hasil 1
Hasil ke2
Kasus 2.
Spesimen:
FNAB
Penanganan dan Pengolahan Spesimen
Penanganan Spesimen untuk TCM
Preparat FNAB
• Kontainer/pot berulir
• Untuk jaringan: jangan ditambahkan
formalin dan cairan apapun seperti NaCl
• Jangan kirim cairan dalam spuit
 pindahkan ke dalam pot bersih
• FNAB  Kirim dalam bentuk
slide/preparat (Slide dimasukkan
kedalam pot bersih)
• Stabilitas spesimen:
- Suhu 2-8o C : 7 hari
- Suhu ruang: 3 hari
Pengolahan Spesimen untuk TCM
• Bila memerlukan sentrifugasi cairan
dan penggerusan Jaringan  BSC
• Pengolahan Spesimen seperti jaringan
padat, swab, aspirasi pus, cairan tubuh
<5ml, feses, slide FNAB, dapat dilakukan
seperti sputum (tanpa BSC) dengan
menggunakan APD yang sesuai
Contoh pengiriman spesimen

Feses Jaringan tulang Cairan tubuh: Urine Preparat FNAB Swab

Picture from: https://imdpath.com/

Terima Kasih