POLYMERASE CHAIN REACTION

DAN APLIKASINYA
ANA INDRAYATI
Fakultas Farmasi
Universitas Setia Budi Surakarta

anabintisuryanto@gmail.com
08156266891
 REPLIKASI (SINTESIS DNA)
 IN VIVO

 IN VITRO (PCR)
REPLIKASI IN VIVO
REPLIKASI IN VITRO (PCR)
 Polymerase Chain Reaction
 Proses penggandaan DNA secara in vitro (tabung)
 Mengkopi DNA sehingga jumlahnya menjadi miliaran
kali jumlah DNA semula
 Meniru proses replikasi in vivo (di dalam sel)
 Enzim DNA polimerase
 Terjadi beberapa siklus yang berulang: 20-40 siklus
 Setiap siklus DNA pol menggandakan DNA sehingga
jumlah DNA menjadi 2xsemula
 30 siklus: 230- 1.073.741.824 kali!
 SIKLUS PCR
 Dalam setiap siklus reaksi PCR terdiri atas 3 tahap yaitu:
 Denaturasi
 Memisahkan utas ganda DNA menjadi untai tunggal

 Semua reaksi enzimatis berhenti

 Suhu: 92-94oC

 Annealing
 Perlekatan primer pada masing masing utas tungal DNA

 Suhu: 25-65oC

 Polimerisasi
 Pemanjangan primer dengan bantuan Taq polimerase

 Suhu: 70-75oC
Tahap reaksi PCR
 ALAT UNTUK REAKSI PCR

Mesin Thermal Cycler: dapat menaikkan dan menurunkan

suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR
KOMPONEN PCR
 KOMPONEN PCR
 DNA cetakan: yang akan digandakan
 DNA polimerase: memperpanjang DNA
 Termostabil: tahan pada suhu tinggi

 Tag DNA polimerase

 Diisolasi dari bakteri termofilik: Thermus aquaticus

 Primer: sepasang DNA untai tunggal/oligonukleotida yang menginisiasi dan

membatasi pemanjangan rantai DNA
 dNTP (deoxynucleoside triphosphate); batu bata untuk pembentukan DNA
baru (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
 Dapar/buffer: berupa bahan-bahan kimia yang menstabilkan reaksi dan
DNA pol agar berjalan optimum
 Ion logam bivalen(mg2+) atau monovalen (K+) berfungsi sebagai kofakor
DNA pol
 PRIMER
 PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu
sepanjang10000-40000 pb
 Panjang primer: 20-30 nukleotida
 Primer dirancang untuk memiliki urutan yang komplemen
dengan DNA cetakan
 Primer dirancang agar menempel dan mengapit daerah
tertentu pada DNA yang kita inginkan
 Primer yang digunakan dalam PCR ada 2 buah (satu pasang)
yaitu primer forward (PF) dan primer reverse (PR)
PERANCANGAN PRIMER
www.ncbi.nlm.nih.gov
 RANCANGLAH SEPASANG PRIMER BERUKURAN 10
NUKLEOTIDA UNTUK MENGAMPLIFIKASI GEN DIATAS

PRIMER REVERSE

5’-AAGACGAAGC……GAAAGGAGCG-3’
3’-TTCTGCTTCG…….CTTTCCTCGC-5’
PRIMER FORWARD
PR: 5’ CGCTCCTTTC 3’
PF: 5 AAGACGAAGC 3’
LATIHAN: PERANCANGAN PRIMER
PROGRAM PERANCANGAN PRIMER

molbiol-tools.ca/PCR.htm
 SPESIFISITAS PRIMER
 Mengenali/mengamplifikasi gen target saja tidak
mengenali gen yang lain
 Pada elektroforesis diperoleh satu pita (single
band)
 BAGAIMANA PCR DILAKUKAN?

 Menentukan GEN yang akan diamplifikasi

 Merancang primer: manual atau program
 Mencampurkan komponen PCR
 Menentukan kondisi PCR
 Proses PCR: alat PCR (2-2,5 jam)
 Karakterisasi hasil PCR: elektroforesis, sekuensing
 DETEKSI HASIL PCR
 Elektroforesis gel agarosa
 Kebenaran ukuran

 DNA sekuensing

 Kebenaran urutan nukleotida (DNA

sekuenser otomatis)
 Hibridisasi dengan probe (SOUTHERN
BLOT)
ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
 Mengetahui ukuran produk PCR
 Kualitatif (ada atau tidak ada)
 CONTOH HASIL PCR

1400 pb

PRODUK PCR 500 pb

 DNA SEKUENSING
 Proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida, urutannya disebut
SEKUEN DNA (sekuensing)
 Fungsi: identifikasi dan fungsi gen dengan cara membandingkan
sekuennya dengan sekuen DNA lain (Bank data, NCBI)
 Metode Sanger (Frederick Sanger):metode terminasi rantai
 cetakan DNA yang akan disekuensing (ditentukan urutan basa nukleotidanya)
 DNA polimerase
 Primer (satu bukan sepasang)
 Basa nukleotida GTAC
 Basa nukleotida pemutus rantai dalam umlah kecil (di-deoksinukleotida)
 Pemisahan dengan elektroforesis
Sekuensing DNA
APLIKASI PCR
 PCR DIAGNOSIS
GEN TARGET
P1

P2

PRODUK PCR: 458 pb

 DETEKSI HBV (HEPATITIS B VIRUS)

 PENYEBAB KANKER HATI

 VIRUS DENGAN MATERI GENETIK DNA
 TIDAK BISA DIKULTUR IN VITRO
 INANG MANUSIA/SEL HIDUP LAIN
 FAKTOR VIRULENSI: GEN HBsAg (HEPATITIS SURFACE
ANTIGEN)
 METODE DETEKSI
1. ISOLASI KROMOSOM
 KARAKTERISASI HASIL

HBV POSITIF

MARKER
KONTROL POSITIF
 DETEKSI MUTASI PADA rpoB
Dengan rifampicin
Tanpa rifampicin

 Rifampicin berikatan dengan sisi aktif RNAP

 Mutasi pada gen pengkode RNAP (WARNA
MERAH) menyebabkan resistensi antibiotik
• Rifampicin berikatan pada subunit β RNAP
• Rifampicin mengubah konfromasi RNAP
• RNAP tidak bisa berikatan dengan promotor.
• Transkripsi TIDAK TERJADI
MULTIDRUG RESISTANT TB (MDR-TB)

 IDENTIFIKASI MUTASI GEN rpoB PADA ISOLAT Mycobacterium

tuberculosis MULTIDRUG RESISTANT
 Multidrug resistant TB (MDR-TB): M. tuberculosis yang
resisten terhadap isoniazid dan rifampisin, obat
antituberkulosis pertama yang efektif
 Rifampisin adalah antibiotik yang dihasilkan oleh Streptomyces
mediterrania
 Target rifampisin subunit (β) dari RNA polymerase, yang
dikode oleh rpoB
 Deteksi dengan PCR hasilnya dibandingkan dengan gen rpoB
M. tuberculosis yang terdapat pada database
URL://www.ncbi.nlm.nih.gov.
 PCR FORENSIK: TEST DNA
 DNA TERDAPAT DI DALAM KROMOSOM
 JUMLAH KROMOSOM NORMAL: 46 (22 PASANG
KROMOSOM SOMATIK DAN 1PASANG KROMOSOM SEX
(XX atau XY)

 STRUKTUR DNA UNTAI GANDA: SATU UNTAI DARI IBU, SATU

UNTAI DARI AYAH
 TEST DNA
 PENENTUAN ORANG TUA BIOLOGIS
 MELIHAT SUSUNAN DNA PADA ANAK, DIBANDINGKAN
DENGAN TERDUGA ORANG TUA BIOLOGIS
 SUSUNAN DNA ADA PADA ANAK-> ANAK KANDUNG

 FORENSIK: IDENTITAS KORBAN (BOM, PEMERKOSAAN,

PEMBUNUHAN)
 PRINSIP TEST DNA
 SAMPEL BIOLOGIS:
 DARAH (SEL DARAH PUTIH, BERINTI)
 RAMBUT (AKAR RAMBUT: DNA INTI; POTONGAN
RAMBUT: DNA MITOKONDRIA),
 SPERMA (KASUS PERKOSAAN, BAGIAN KEPALA SEL
SPERMA MENGANDUNG DNA INTI)
 DAGING, TULANG, KUKU, URIN
 PUNTUNG ROKOK (JEJAK DNA YANG TERTINGGAL
DARI EPITEL BIBIR)
 JUMLAHNYA KECIL: AMPLIFIKASI (PCR)
 TAHAPAN TEST DNA
1. Isolasi sampel > RAWAN KONTAMINASI
2. Pemurnian sampel DNA
3. Proses PCR
4. Karakterisasi hasil PCR: pola STR
 TEST DAN
 ANALISA POLA DAN HASIL PCR MENGGUNAKAN MARKA short tandem
repeats) (STR)
 STR: SUSUNAN BASA BERULANG (2-6 BASA DALAM LOKUS TERTENTU)
 SUSUNAN DNA SETIAP ORANG BERBEDA SEHINGGA POLA STR-NYA
JUGA BERBEDA (DNA SIDIK JARI, DNA FINGER PRINT)
 JIKA ADA KEMIRIPAN POLA STR ANTARA ANAK DENGAN TERDUGA
ORANG TUA SEKITAR 16-> ORANG TUA BIOLOGIS
 NOMOR KROMOSOM:
 MISAL KROMOSOM NO 1 MEMILIKI URUTAN AGCCTTA DENGAN
PENGULANGAN 2 KALI
 AYAH DAN IBU TERDUGA MEMPUNYAI POLA YANG SAMA,, TERDAPAT
HUBUNGAN KELUARGA
JUMLAH STR: 10.000
 TEST DNA DI INDONESIA
 Laboratorium Pusdokkes Polri Jakarta Timur
 Lembaga Bio Molekuler Eijkman Jakarta Pusat
 APLIKASI PCR
 MEMPELAJARI MUTASI
 MENGISOLASI ENZIM: KITINASE, AMILASE
 MENCARI KANDIDAT VAKSIN
 MEMPELAJARI RESISTENSI BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIK
 IDENTIFIKASI MIKROBA: BAKTERI PENYEBAB KARANG GIGI
 KEAMANAN PANGAN
 PERUBAHAN RESEPTOR: RESISTENSI INSULIN
Terima kasih
APLIKASI PCR
 APLIKASI PCR
 Diagnosis penyakit
 Pencarian mikroba baru (penghasil enzim potensial,
pendegradasi minyak)
 Mempelajari mutasi gen (penyakit)
 Mempelajari resistensi mikroba terhadap antibiotik
(rpoB)
 Mencari kandidat vaksin
 Farmakogenomik
 PCR DIAGNOSIS
GEN TARGET
P1

P2

PRODUK PCR: 458 pb

 DETEKSI MUTASI PADA rpoB
Dengan rifampicin
Tanpa rifampicin

 Rifampicin berikatan dengan sisi aktif RNAP

 Mutasi pada gen pengkode RNAP (WARNA
MERAH) menyebabkan resistensi antibiotik
• Rifampicin berikatan pada subunit β RNAP
• Rifampicin mengubah konfromasi RNAP
• RNAP tidak bisa berikatan dengan promotor.
• Transkripsi TIDAK TERJADI
MULTIDRUG RESISTANT TB (MDR-TB)

 IDENTIFIKASI MUTASI GEN rpoB PADA ISOLAT Mycobacterium

tuberculosis MULTIDRUG RESISTANT
 Menurut WHO (2010), terdapat adanya multidrug resistant TB
(MDR-TB): M. tuberculosis yang resisten terhadap isoniazid
dan rifampisin, obat antituberkulosis pertama yang efektif.
 Rifampisin adalah suatu antibiotik yang dihasilkan oleh
Streptomyces mediterrania
 Target rifampisin subunit (β) dari RNA polymerase, yang
dikode oleh rpoB
 Deteksi dengan PCR hasilnya dibandingkan dengan gen rpoB
M. tuberculosis yang terdapat pada database
URL://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Terima kasih