BIOTEKNOLOGI FARMASI

(PRODUK REKOMBINAN DI BIDANG FARMASI)

ANA INDRAYATI
anabintisuryanto@gmail.com
0815 626 689 1

Fakultas Farmasi
Universitas Setia Budi Surakarta
PRODUK REKOMBINAN DI BIDANG FARMASI

 PRODUK BERBASIS ASAM NUKLEAT (DNA, RNA)

 VAKSIN DNA

 TERAPI GEN

 TEKNOLOGI ANTISENSE

 KIT DIAGNOSIS

 TERAPI GEN

 PRODUK BERBASIS PROTEIN:

 VAKSIN SUBUNIT REKOMBINAN

 ANTIBODI MONOKLONAL

 PROTEIN TERAPEUTIK.

 PRODUK TRANSGENIK
PROTEIN TERAPI
PROSES PRODUKSI PROTEIN TERAPI
REKOMBINAN
PENYISIPAN GEN
ISOLASI DAN
KE DALAM
KARAKTERISASI
VEKTOR
GEN
(PLASMID

PRODUKSI
KLONING GEN KE
PROTEIN
DALAM SEL
TERAPETIK

ISOLASI DAN
KARAKTERISASI
PEMURNIAN
PROTEIN
PROTEIN
TERAPETIK
TERAPETIK
PABRIK BIOLOGIS PROTEIN TERAPEUTIK

 Escherichia coli:  RAGI: Saccharomyces

 PERTUMBUHAN CEPAT cerevisiae, Hansenulla
polymorpha dan Pichia
 PENANGANAN MUDAH
pastoris
 PROTEIN > 50% MASSA
PROTEIN TOTAL SEL  SISTEM MAMALIA: Chinese
 GENOM hamster ovary (CHO), baby
TERKARAKTERISASI hamster kidney (BHK)
LENGKAP-> MUDAH
DIMODIFIKASI  HEWAN TRANSGENIK
 BIAYA PRODUKSI RELATIF
MURAH  TANAMAN
Insulin rekombinan
Modifikasi insulin

• Meningkatkan waktu paro

• Mudah berikatan dengan reseptornya sehingg aktivitas
meningkat
• Metode: site directed mutagenesis (SDM)
INSULIN REKOMBINAN-ANALOG

Insulin analog adalah insulin yang sudah diganti asam aminonya

25 tahun setelah humulin (FDA): lebih dari 130 protein (sekitar 95 protein
diproduksi secara rekombinan) disetujui oleh FDA untuk penggunaan klinis

DIABETES
INFERTILITAS
GANGGUAN PERTUMBUHAN

ANEMIA KARENA
KERUSAKAN GINJAL
 HEMOFILIA
INFARK MIOKARDIA
TROMBOSITOPENIA DAN
TROMBOSIS
LEUKIMIA, HEPATITIS KRONIS,
AIDS, KANKER

KARSINOMA SEL GINJAL

SISTIK FIBROSIS DAN GAUCHER

The 20 top-selling biopharmaceutical products
in 2013
Volume 32. NUMBER 10. OCTOBER 2014. nature biotechnology
VAKSIN REKOMBINAN
SEJARAH VAKSIN
• Definisi vaksin: bahan
berisi antigen yang dapat
menginduksi tubuh
untuk menghasilkan
imunitas, tetapi tidak
menyebabkan penyakit
• Antigen: bakteri,
virus, bagian dari
bakteri
(polisakarida),
bagian dari virus
(subunit: protein
kapsid, materi
genetik), toksin
PRINSIP VAKSINASI
SEL MEMORI
• Mengingat antigen
spesifik dan akan
merespon dengan
cepat bila terjadi
infeksi kedua.
• Bersirkulasi di dalam
darah pada jangka
waktu lama
• Membelah dengan
cepat menjadi sel
plasma (penghasil
antibodi) jika sewaktu-
waktu dibutuhkan
TIPE VAKSIN
Attenuated vaccine:
tuberculosis (BCG), campak, rubella, oral polio vaccine (OPV)

Killed vaccine:
inactivated polio vaccine (IPV), difteri, rabies

Conjugate vaccine: Toxoid vaccine:

Haemophillus influenza tipe B (Hib) difteri dan tetanus

Recombinant vaccine:
Vaksin Dna, Vaksin Hepatitis B virus (HBV),Vaksin Human
papilloma virus (HPV)
MACAM-MACAM VAKSIN
 LIVE-ATTENUATED VACCINE: VIRUS HIDUP YANG DILEMAHKAN
 PASASE: menumbuhkan virus pada telur berembrio atau sel
kultur beberapa seri sehingga kemampuan replikasi virus
pada sel manusia hilang.
 Virus masih bisa menginduksi respon imun.
 Kemungkinan reversi patogen

 KILLED OR INACTIVATED VACCINE: VIRUS YANG DIINAKTIVASI/DIBUNUH

 Panas atau zat kimia (formalin, formaldehid)
 Non reversi patogen
 TOXOID: TOKSIN BAKTERI YANG DIINAKTIVASI Inaktivasi
toksin: panas, zat kimia
 Clostridium tetani: neurotoksin (tetanospamin)

 CONJUGATE VACCINE: KOMPONEN BAKTERI DIKONJUGASI

DENGAN KARIER (PEMBAWA)
 Ukuran kecil, meningkatkan reposn imun, vaksin bakteri
penumokokus

 SUBUNIT VACCINE: KOMPONEN PATOGEN (PROTEIN)

VAKSIN DNA VAKSIN DNA YAITU DNA SEBAGAI
ANTIGEN (BAHAN VAKSIN)

Juni 2015, Australia, DNA

vaksin untuk manusia ->
Japanese enchephalitis
vaccine (IMOJEV)
 VAKSIN HEPATITIS B

PLASMA VIRUS HEPATITIS B

INAKTIVASI GEN HBsAg

PURIFIKASI Saccharomyces
cerevisiae

HBsAg HBsAg
VAKSIN REKOMBINAN: HEPATITIS B

• ENGERIX-B
• RECOMBIVAX HB
 Distribusi geografis hepatitis B

• Peradangan pada hati->oleh virus hepatitis B (HBV)

• Hepatitis kronik, sirosis hati dan kanker hati->kematian
• Penyebaran: aktivitas seksual, pemakaian alat injeksi, hemodialisis,
transmisi lewat operasi dan infeksi karena penerimaan produk darah
dan organ
• Vaksinasi-> HBsAg plasma derived, HBsAg rekombinan
Substitusi asam amino glisin (GGA) menjadi arginin (AGA)

Pre S1 119 aa Pre S2 55 aa S 226 aa

80 aa 100 aa

• Produksi antigen -> terdiri dari 100

asam asam amino 80-180 dari protein
S->11 kDa
• Daerah “major hydrophilic loop” sangat
antigenik dan fenomena “vaccine
escape mutant” terjadi karena mutasi
pada daerah ini.
• Komponen diagnostik dan vaksin
“vaccine escape mutant”.
Fenomena vaccine escape mutant

Ag HBsAg
mutan

Ag HBsAg
Ab–anti HBsAg WT
WT

Mutan HBV tidak lagi dikenali oleh antibodi yang sudah

terbentuk pada saat imunisasi sehingga virus ini masih
mampu menginfeksi orang yang telah divaksinasi
 Vaccine escape mutant: Mutan lolos vaksin
• Infeksi oleh virus hepatitis B dapat
menyebabkan penyakit pada hati,
seperti hepatitis kronik, sirosis hati dan
kanker hati pada anak dan dewasa.
• Penyebaran: aktivitas seksual,
pemakaian alat injeksi, hemodialisis,
transmisi lewat operasi dan infeksi
karena penerimaan produk darah dan
organ.
• HBsAg adalah protein permukaan
virus Hepatitis B (HBV) yang
berperan dalam pelekatan HBV ke
sel hepatosit manusia
• Vaksin konvensional: „HBsAg
plasma derived”
• Vaksin rekombinan: kloning HBsAg
• Kejadian dimana individu yang
sudah divaksinasi HBV ternyata
masih menderita infeksi hepatitis B
• Mutasi pada gen pengkode HBsAg
• HBsAg wild type->HBsAg mutan
• Kegagalan vaksinasi
• Kegagalan deteksi
 Gardasil: HPV tipe 6, 11, 16, and
18 (FDA, 2006)
 Cervarix: HPV tipe 16 dan 18
(FDA, 2009)
VAKSIN EDIBEL (MOLECULAR PHARMING)

Status vaksin: uji

praklinik-> patogen
penyebab diare (ETC,
rotavirus, vibrio
cholera)
HOW TO MAKE AN EDIBLE VACCINE
William H. R. Langridge
Scientific American sp 16, 46 - 53 (2006) doi:10.1038/scientificamerican1206-46sp
Vaksin edibel
 Tanaman: mudah dikembang biakan, vaksin dapat di target
ke biji, buah
 Mengurangi kontaminasi (misal virus hewan)
 Dapat dikonsumsi langsung
 Tidak memerlukan pemurnian
 Penyimpanan lebih gampang -> tidak harus di lemari
pendingin
 Biaya lebih murah
 Distribusi gampang tidak perlu suhu dingin
 Mudah pemberian (admisnistrasi)
 VAKSIN EDIBEL
Keunggulan
 Mudah: pemberian dan
penyimpanan.
 Murah: produksi skala besar
dan transportasi.
 Aman: bebas patogen dan
toksin.
 Efektif: menginduksi sistem
imun humoral/mukosal dan
sistemik.
 Efisien: vaksin dengan
beberapa antigen
Kekurangan
 Dosis tidak terdefinisi
 Produksi vaksin antar batch tidak
bisa homogen
 Kestabilan vaksin di dalam
tanaman/buah tidak diketahui
 Seleksi tanaman terbaik untuk
produksi vaksin sulit
 Kerusakan protein terutama
untuk vaksin yang diproduksi di
buah/sayur yang memerlukan
pemasakan (misal: kentang).
VAKSIN UNTUK TERAPI-KANKER
 Meningkatkan respon imun
untuk mengatasi sel kamker
 Menghambat proliferasi sel
kanker
 Eradikasi sel kanker
 Dibuat dari sel-sel kanker
yang dlilemahkan atau
dimatikan
 Sel kanker penderita itu
sendiri (vaksin autologus)
 Sel kanker penderita lain
(vaksin allogenik)
 Sel kanker payudara,
prostat, kolon, pankreas,
paru-paru, rahim dan sel
kanker kulit
 Molekul-molekul spesifik:
carcinoembryonic antigen
(CEA), cancer testis
antigens, Mucin-1 (MUC1),
gangliosida dan mutan
protein p53
 FDA: vaksin untuk terapi
kanker prostat (Sipuleucel,
Provenge)
ANTIBODI MONOKLONAL
• Antibodies, also referred to as
immunoglobins, are made by B
lymphocytes and are an essential part
of humoral immunity.
• The variable (V) region is the portion of
the antibody that distinguishes it from
all others. This region is where the
antigen binds to the antibody
ANTIBODI DAN ANTIGEN

 Antibody: imunoglobulin
 Antigen: imunogen
 The strength of binding
between the antibody
and an antigen at a
single binding site is
known as the antibody‟s
affinity for the antigen
 EPITOP
 The specific region on an antigen that an antibody
recognizes and binds to is called the epitope, or
antigenic determinant.
 An epitope is usually made up of a 5-8 amino acid
long chain on the surface of the protein.
 Since an antigen can have multiple different
epitopes, a number of antibodies can bind to the
protein
 EPITOP DAN PARATOP

 PARATOP: sisi pada antibodi tempat epitop berikatan

 EPITOP: sisi pada antigen tempat paratop berikatan
 ANTIBODI POLIKLONAL DAN
MONOKLONAL

 Antibodi poliklonal:
 antibodi yang mengenali banyak
epitop dari antigen

 Antibodi monoklonal:
 antibodi yang hanya mengenali
satu epitop dari antigen
Monoclonal
antibodies
(mAb) are
antibodies that
are identical
because they
were produced
by one type of
immune cell, all
clones of a single
parent cell
http://en.wikipedia.org/wiki/Monoclonal_antibody (Access: 90514)
 KARAKTERISTIK mAb
 Monospesifik: hanya mengenali satu epitop
(determinan antigenik)
 Homogen: berasal dari satu klon
 Memungkinkan dihasilkan dalam jumlah besar.
 TEKNOLOGI HIBRIDOMA
(Kohler dan Milstein et al, NOBEL 1984)
 TEKNOLOGI HIBRIDOMA UNTUK PRODUKSI
MAb

 Imunisasi mencit dengan antigen X, antibodi terhadap antigen

X dihasilkan oleh sel B
 Isolasi dan seleksi sel B penghasil antibodi tehadap X dari
limfa mencit
 Penggabungan sel B dengan sel mieloma (sel kanker) pada
kultur sel dengan PEG (polietilen glikol) atau elektro fusi
 Sel B: umurnya pendek-penghasil antibodi

 Sel mieloma: imortal-dapat dibiakkan terus menerus

 Penggabungan antara sel B dengan sel mieloma menghasilkan

sel hibrid (hibridoma).
SELEKSI SEL HIBRIDOMA
 Sel B
 HGPRT positif (HGPRT: hypoxanthine phosphoribosyl transferase)
merupakan enzim untuk sintesis basa purin/DNA jalur salvage)
 Sintesis DNA: jalur salvage dan jalur de novo
 Sel B mampu mensintesis DNA dari jalur salvage (HGPRT positif) dan de
novo
 Sel mieloma
 HGPRT negatif (jalur salvage off)
 Jalur de novo on
 Medium HAT (hipoxantine, aminopterin, timidin)
 Aminopterin menghambat sintesis DNA jalur de novo, sel dipaksa sintesis
melalui jalur salvage
 Sel B: mati (umurnya pendek)
 Sel mieloma: mati (HGPRT negatif sehingga jalur salvage off)
 Sel hibridoma: hidup (HGPRT positif sehingga jalur salvage on)
SELEKSI
Sintesis nukleotida dari Sintesis nukleotida dari daur
prekursor metaboliknya: ulang basa bebas atau
asam amino, ribosa-5- nukleosida dari pemecahan
fosfat, CO2, dan unit satu asam nukleat.
karbon
Prinsip ELISA
 Karakterisasi protein berdasarkan reaksi antigen - antibodi
 Mampu mendeteksi satu protein dalam campuran
 Dapat memberikan informasi mengenai MW protein
menggunakan rainbow marker
 Diperlukan antibodi yang spesifik mengenali protein
target  antibodi primer
 Antibodi sekunder  dikonjugasi dengan enzim tertentu
Contoh : horseradish peroxidase, alkalin fosfatase
ELISA (Enzyme Linked Immunosorben Assay
Problem…..
Many patients develop immune response to
monoclonal antibodies produced in mice, as
these are foreign proteins
Aplikasi ANTIBODI MONOKLONAL
TRASTUZUMAB (HERCEPTIN): kanker payudara

 Pada sel kanker payudara, terjadi

overekspresi HER2.
 Protein ini berperan dalam
tranduksi sinyal untuk proliferasi sel
 Semakin banyak HER2 maka
proliferasi sel meningkat
 Pada kanker terjadi overekpresi
HER2
 mAb menghambat EGF (epidermal
growth factor berikatan dengan
reseptor-nya sehingga ekspresi
HER2 dihambat.
 Proliferasi sel yang sangat cepat
tidak terjadi
 Pregnancy Tests
 A pregnant woman has the hormone human chorionic
gonadotrophin (HCG) in her urine.
 Monoclonal antibodies to HCG have been produced.
These have been attached to enzymes which can later
interact with a dye molecule and produce a colour
change.
 Monoclonal antibodies with bound HCG will bind to
antibodies in test region and activate dye molecules,
producing a colour change
Pregnancy Tests

Sumber??
 Diagnosis of HIV Infection
 The test of HIV infection is based on detecting the
presence of HIV antibody in the patient’s blood
serum.
 Treatment of Cancer
 Cancer cells carry specific tumour-associated
antigens (TAA) on their plasma membrane.
 Monoclonal anti-TAA antibodies have been
produced.
 Drugs which kill tumour cells or inhibit key proteins
in tumour cells are attached to monoclonal anti-
TAA antibodies.
 Cancer cells are specifically targeted, avoiding
damage to healthy host cells.
• Rituximab- mAb terapi kanker limfoma non Hodgkin
• Setiap sel memiliki protein penanda yang disebut antigen
• Rituximab mengenali protein penanda C20 yang ada pada permukaan sel B abnormal
(ditemukan pada limfoma)
• Rituximab menyerang sel limfoma
RNA antisense
 RNA antisense

• MENGHAMBAT PROSES TRANSLASI

• TRANSLASI ADALAH PROSES
SINTESIS PROTEIN (INFORMASI
YANG ADA DI mRNA
DITERJEMAHKAN MENJADI PROTEIN)
• mRNA YANG DIRUSAK
• MENGGUNAKAN OLIGONUKLEOTIDA
PENDEK
• TERBENTUK DOUBLE RNA (ds RNA)
RNA antisense-pengobatan kanker

• Ekspresi gen: DNA-mRNA-

protein
• Genta scientists:
mengisolasi mRNA Bcl-2
(protein regulator sel
kanker)
• DNA komplemen mRNA
12-22 basa-obat
• Duplek DNA/mRNA
• Translasi dihambat,
protein Bcl-2 tidak dapat
disintesis
TERAPI GEN
Terapi gen
 Gene untuk mengobati atau mencegah penyakit
 Inaktivasi atau ‘knocking out’ gen yang termutasi
 Memasukkan gen ‘baik’ untuk mengganti gen yang rusak (gen yang rusak tetap di
dalam sel)
 Mengganti gen yang rusak dengan gen yang baik (gen yang rusak dibuang)
 The technique remains risky and is still under study to make sure that it will be
safe and effective
 Virus sebagai vektor:
 Viruses can deliver the new gene by infecting the cell.
 Viruses are modified so they can’t cause disease when used in people
 Retroviruses->integrate their genetic material
 Adenovirus->not integrated into a chromosome
 The vector can be injected or given intravenously (by IV) directly into a specific
tissue in the body
ADA Deficiency (ADA-SCID)
 Severe combined immune deficiency (SCID): abnormalitas pada gen ADA
(adenosine deaminase)-> adenosin dan deoksiadenosin terakumulasi di
dalam sistem sirkulasi dan toksik bagi sel B dan sel T (sel-sel sistem
kekebalan)-> PENDERITA RENTAN TERHADAP PENYAKIT
 Terapi gen untuk ADA-SCID
 This was the first clinical trial gene therapy.
 Peripheral blood lymphocytes (T cells) from 2 girls were collected and expanded
ex vivo. They were infected with LASN, a retroviral vector expressing the human
ADA cDNA.
 After 9 in vitro amplifications, 700 million autologous lymphocytes (corrected T
cells) per kg of body weight were infused.
 The same operation was repeated monthly, and the last infusion took place in
October 1992.
 Since then, both girls showed clinical improvements. The toxic level of adenosine
and deoxyadenosine were lowered because of the presence of ADA+ circulating
lymphocytes
Familial Hypercholesterolemia
 Hiperkolesterolemia (Familial): kerusakan pada gen yang mengkode
reseptor untuk low density lipoproteins (LDL) pada pasein penyakit hati
 Konsekuensi: LDL tidak bisa diproses di dalam hati, sehingga LDL
bersirkulasi dalam pembuluh darah dan menyebabkan penyumbatan
pembuluh darah-> PENYAKIT KARDIOVASKULER DAN JANTUNG.
 Terapi gen untuk hiperkolesterolemia
 A 29-year-old patient with no functional LDL-receptor gene underwent hepatic
resection. Hepatocytes were isolated and transduced ex vivo with a retroviral
vector expressing the cDNA for the LDL receptor.
 Three days later, the hepatocytes were transfused into the patient's liver, where
they became established, expressed the LDL receptor cDNA and produced
functional LDL receptor.
 Hypercholesterolemia of this patient was partially corrected, and maintained at a
stable level for 18 months.
 The patient's condition, based on lipid profiles, showed significant improvement.
No immune response against the autograft was detected.
PRODUK TRANSGENIK
 Jagung-tahan terhadap hama, menghasilkan insektisida sendiri, U.S. Food and
Drug Administration (FDA): jagung transgenik dikonsumsi manusia
 Kedelai-resisten terhadap herbisida
 Kapas-resisten pestisida
 Pepaya-tahan virus, komersial: Hawaii 1999
 Beras-kaya vitamin A
 Tomat-pematangan ditunda, permukaan tidak cepat rusak
 Rapeseed atau Canola-
 Dairy products-sapi transgenik, besar, bovine growth hormone (rbGH)
 Kentang-tahan terhadap hama tikus, modifikasi: Bacillus thuringiensis var.
Kurstaki Cry 1 (toksin), kontroversi karena ternyata toksin Cry1 stabil di usus
tikus
 Kacang-kacangan-resisten terhadap pestisida
http://www.dailymail.co.uk/news/article-514799/The-orange-purple-green-
cauliflowers-scientists-claim-healthier-you.html
 World's First Blue Roses On Display In Japan

Danielle Demetriou, Daily Telegraph, October 31, 2008,

Tokyo, Japan - World's first blue roses have been unveiled to

the public for the first time at an international flower fair in
Japan, following nearly two decades of scientific research.
The blue-hued blooms are genetically modified and have
been implanted with a gene that simulates the synthesis of
blue pigment in pansies.
Its scientists successfully pioneered implanting into
the flowers the gene that produces Delphinidin, the
primary plant pigment that produces a blue hue but is
not found naturally in roses. The Blue Rose was
The world's first genetically modified blue roses were developed by Suntory
unveiled in the laboratory four years ago, although further Flowers
research was required to make them safe to grow in nature.
JAGUNG TRANSGENIK-BT
BACILLUS THURINGIENSIS

• Modifikasi: gen
penghasil toksin dari
bakteri Bacillus
thuringiensis
dimasukkan ke sel
tanaman jagung

• Hama (ulat): mati

saat makan batang,
daun dari jagung
tersebut
Mekanisme Kerja Toksin Bt
 Mekanisme Kerja Toksin Bt

Sisa tubuh
serangga
Pembentukan pori sebagai substrat
pada membran untuk sporulasi
epitel- Bt-Siklus hidup
Aktif toksin berlanjut
menembus ketidakseimbanga
membran usus- n konsentrasi ion-
Toksin dimakan LISIS sel
serangga-aktivasi berikatan
protoksin oleh dengan reseptor
protease (saluran spesifik
pencernaan, pH
basa)

Reseptor: brush border membrane vesicles (BBMV)

aminopeptidase N dan famili cadherin

Ronald D. F., C. G. Yua, M. John, M. Terry, S. Xiaomei, A. Herbert , A. Siqueirab, and S.D. Blair , 2005, Identifi cation, cloning and
expression of a Cry1Ab cadherinreceptor from European corn borer, Ostrinia nubilalis (Hübner)(Lepidoptera: Crambidae), Insect
Biochemistry and Molecular Biology, 35:1. pp. 33-40. doi:10.1016/j.ibmb.2004.10.001.
Jagung Bt Jagung non Bt
 Kapas tahan serangga

 The new genetically engineered cotton plant

contains an extra gene inserted from Bacillus
thuringiensis, a common bacterium.
 This bacterium produces toxin naturally to kill
cotton bollworms or other insects which eat the
cotton plant's leaves and flower buds.
 As a result, the transgenic cotton plant can
produce the same toxin from their leaves to kill
those insects
• Modifikasi: gen toksin dari bakteri Bacillus thuringiensis
dimasukkan ke dalam sel tanaman kapas
• Kapas menghasilkan toksin yang dapat membunuh serangga
• Bovine somatotropin (BST) atau bovine growth hormone (BGH): protein
yang dihasilkan kelenjar pituitari sapi
• Gen pengkode BST dimasukkan ke dalam sel telur dari sapi
• Sapi transgenik: kelenjar mamary mengambil nutrisi lebih banyak dari
darah dan menghasilkan susu lebih banyak (meningkat hingga 20%)
Pro dan kontra produk transgenik
 Aspek ekonomi
 tebu transgenik lebih manis
 minyak goreng Canola transgenik lebih banyak hasilnya
 Aspek kesehatan
 kedelai transgenik: reaksi alergi pada individu
 kedelai transgenik: pemicu kanker pada tikus
 kapas transgenik (gen aad dapat berpindah ke bakteri penyebab
kencing nanah (GO), Neisseria gonorrhoeae)-> kebal terhadap
antibiotik streptomisin dan spektinomisin
 Aspek lingkungan
 jagung Bt (gen resisten pestisida dapat dipindahkan kepada gulma
milkweed, Asclepia curassavica)-> pakan kupu-kupu raja (Danaus
plexippus)-> keracunan
TERIMA KASIH