Pemeriksaan Imunohistokimia

A. Tujuan Pewarnaan IHC

Untuk mengetahui ada atau tidaknya penanda dari tumor dengan melihat ada tidaknya
peningkatan antigen antibody spesifik.

Imonohistokimia  Suatu metode kombinasi dari anatomi,imonologi dan biokimia untuk

mengidentifikasi komponen jaringan yang memiliki ciri interaksi antara antigen target dan
antibodi spesifik yang diberi label.

Metode untuk mendeteksi keberadaan antigen spesifik di dalam sel suatu jaringan dengan
menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi (Ab) pada jaringan hidup. Jika kita
membuat irisan dari suatu jaringan lalu kita warnai tidak dapat keliatankarna preparat
histologi atau jaringan hanya dapat melihat morfologi suatu jaringan atau pola dari epitel saja
. sedangkan imonohistokimia dapat melihat pengikatan dari antigen dan antibodi pada
jaringan hidup. Antigen dalam tubuh antibodi yang dimaksud disini adalah antibodi yang
dibuat.

B. Prinsip Pewarnaan IHC

“Perpaduan antara reaksi imunologi, kimiawi, dimana reaksi imunologi ditandai
reaksi Ab dan Ag. Reaksi kimiawi ditandai dengan reaksi enzim dan substrat.”

C. Persiapan sampel

Persiapan membuat preparat ajringan dari jaringan yang masih segar

1. Mendapatkanjaringan yang masih segar

2. Fiksasi: direndam di larutan fiksatif (formaldehid, NBF 10%)
3. Dehidrasi – menrik air – alkohol terangkat
4. Clearing : pergantian alkohol dengan xylol. Zat yang dapatmenghantarkan parafin
5. Embeding; memasukan jaringan ke parafin cair
Impreghation – jaringan masuk ke parafin cair
Blocking – parafin di padatkan
Trimming – memotong blok parafin (tebal 10-15mikron) sampai terlihat jaringan
6. Sectioning : pemotongan jaringan tebal (4-6mikron) hasil pita lembaran jaringan
7. Mounting: menempelkan potongan jarinan ke objek glas
8. Defarafinisasi: Ag retrieval umtuk membalikan komponen protein Ag yang tertutup
pada proses fiksasi

D. Pada sampel labelling : Fiksasi , Cromogen , Counterstaining, Ounting media,

Inactivasi dan blocking
Fungsinya/Tujuannya :
- Fiksasi :
- Cromogen :
- Counterstaining :
- Ounting media :
- Inactivasi : menghambat enzim yang bersifat endogen untuk menghindari ikatan yang
tidak spesifik yang akan mengganggu pewarnaan dengan menginkubasinya dengan H2O2
3% Selama 10 menit.
- Blocking : untuk memblokir sisa-sisa residu jaringan yang akan menyebabkan hasil
+ palsu.

E. Deteksi dan Troubleshooting

- Deteksi :
- Troubleshooting :
A. Non spesifik Staining ( Pewarnaan yang tidak spesifik)
 Alasan
1. Konsentrasi antibodi primer atau sekunder terlalu tinggi.
2. Antibodi primer dinaikkan terhadap spesies yang sama dengan jaringan yang ternoda
(mis. Antibodi primer kelinci yang diuji pada jaringan kelinci).
3. Aktivitas peroksidase endogen.
4. Bagian / sel telah mengering.
 Penjelasan
- Cobalah mengurangi konsentrasi antibodi dan / atau periode inkubasi.
- Gunakan antibodi primer / sekunder yang ditimbulkan terhadap spesies yang berbeda dari
jaringan Anda.
- Gunakan inhibitor seperti H2O2.
- Jangan biarkan bagian jaringan mengering.
B. High Background ( Latar belakang terlalu gelap )
 Alasan
1. Pemblokiran tidak memadai.
2. Antibodi primer yang digunakan adalah berkonsentrasi.
3. Ikatan sekunder dari antibodi sekunder.
4. Cuci tidak memadai.
5. Sectivity peroksidase endogen.
6. Terlalu banyak media yang ditambahkan.
7. Chromogen rescts dengan PBS.
8. Permesbilisasi telah merusak pasir membran yang menghilangkan protein membran.
 Penjelasan
- Menekan periode pemblokiran inkubasi Gunakan konsentrasi yang lebih encer.
- Jalankan kontrol sekunder tanpa antibodi primer.
- Cuci dengan PBS di antara semua langkah.
- Gunakan penghambat seperti H2O2.
- Kurangi waktu inkubasi substrat.
C. No Staining ( Tanpa Pewarnaan )
 Alasan
1. Antibodi primer dan sekunder tidak cocok.
2. Apakah antibodi cocok untuk protokol IHC.
3. Antibodi sekunder tidak disimpan dalam gelap.
4. Tidak cukupnya antibodi primer mengikat protein yang diminati.
5. Protein yang diinginkan tidak banyak terdapat dalam jaringan.
6. Protein yang diinginkan adalah protein inti dan antibodi tidak dapat menembus nukleus.
7. Deparaffinisasi tidak memadai.
8. Formalin mungkin menutupi antigen.
9. Kontaminasi PBS.
 Penjelasan
- Antibodi sekunder harus melawan spesies yang ditimbulkan oleh antibodi primer - anti
spesies itu.
- Antibodi yang digunakan mungkin tidak mengenali bentuk protein asli.
- Tes pada western blot yang tidak terdenaturasi dan didenaturasi untuk memastikan
antibodi mengenali antigen yang tidak terdenaturasi.
- Direkomendasikan untuk menghindari paparan antibodi sekunder terhadap cahaya.
Simpan di tempat gelap.
- Menggunakan larutan antibodi yang lebih pekat atau menambah waktu inkubasi.
- Menggunakan larutan antibodi yang lebih pekat.
- Tambahkan langkah permeabilisasi sehingga antibodi dapat mengikat antigen.
- Inkubat lebih lama dalam xilena. Selalu gunakan solusi make up xylene segar.
- Gunakan metode pengambilan antigen.
- Gunakan pengawet seperti 0,01% azida dalam buffer penyimpanan antibodi PBS atau
gunakan PBS steril segar.