LAPORAN PRAKTIKUM VIROLOGI

Materi : Pemeriksaan Molekuler Virus Metode Hibridisasi

Tujuan :

1. Memahami konsep dasar pemeriksaan hibridisasi

2. Melakukan hibridisasi DNA untuk mendeteksi sekuens spesifik.
3. Menganalisis hasil pemeriksaan Molekuler metode hibridisasi

I.Dasar Teori

Hibridisasi molekuler adalah hubungan antara untaian DNA dan RNA yang kenetika nya diatur
oleh derajat keterkaitan intra dan antaruntai, jenis pelarut, kekuatan ionik pelarut, suhu, dan
waktu. hibridisasi adalah pembentukan ikatan dupleks stabil antara dua rangkaian nukleotida
yang saling komplementer melalu perpasangan basa N. Hibridisasi dapat menunjukkan suatu
keseragaman sekuens. Pasangan DNA–DNA, DNA–RNA, atau RNA–RNA. Hibridisasi DNA–DNA
terbentuk dalam blot Southern sedangkan hibridisasi DNA–RNA terbentuk dalam blot Northern.
Hasil ikatan basa yang dibentuk dari hibridisasi disebut hibrida.

Hibridisasi asam nukleat adalah salah satu alat yang paling banyak digunakan dalam biologi
molekuler dan oleh karena itu diterapkan dalam beberapa teknik diagnostik dan penelitian.
Teknik ini mengenali target DNA dan RNA yang dapat divisualisasikan dengan dua jenis probe,
fluoresen (hibridisasi fluoresen in situ; FISH) atau kromogen (hibridisasi in situ kromogenik;
CISH), berdasarkan prinsip prosedur yang sama. Subtipe ISH sangat luas sehingga perlu untuk
memilih beberapa metode ISH terpenting yang direkomendasikan untuk digunakan sebagai alat
diagnostik khusus.

Teknik hibridisasi molekuler menggunakan probe yang diarahkan pada bagian genom virus yang
unik dan terpelihara , sangat spesifik dan hanya berikatan dengan rangkaian DNA atau RNA
komplementer. Probe sangat berguna untuk mendeteksi dan mengetik virus yang tidak tersedia
metode kultur yang dapat diandalkan. Pemeriksaan molekuler tersedia sebagai perangkat
komersial untuk mendeteksi HPV, HSV , CMV , virus hepatitis B (HBV),dan HCV , HIV. Untuk
beberapa virus, konsentrasi genom virus dalam spesimen pasien langsung mungkin terlalu
rendah untuk memungkinkan deteksi dengan sensitivitas yang memadai (misalnya, probe HSV
dan CMV yang tersedia secara komersial hanya mendeteksi 70% hingga 90% spesimen positif
melalui isolasi). Meningkatnya sensitivitas NAAT telah merevolusi pengujian di laboratorium
virologi klinis . seperti PCR , amplifikasi perpindahan untai (SDA), amplifikasi berbasis urutan
asam nukleat (NASBA), dan sistem amplifikasi yang dimediasi transkripsi (TMA) termasuk
replikase Q-beta dan reaksi berantai ligase (LCR), dan Beberapa pengujian komersial dan
pengujian internal (“home-brew”) telah dikembangkan. Kuantifikasi genom virus dalam plasma
atau serum dapat digunakan untuk menentukan prognosis, memilih pasien untuk terapi
antivirus , dan memantau respons terhadap pengobatan di berbagai populasi pasien. Uji
multipleks yang mampu mendeteksi sejumlah virus dalam satu reaksi amplifikasi telah
dikembangkan, misalnya untuk virus herpes , virus enterik, virus yang ditularkan melalui darah,
dan virus pernapasan. Karena pengujian ini menggunakan sistem tertutup (yaitu, amplifikasi
dan deteksi terjadi dalam satu tabung yang tidak perlu dibuka setelah reaksi selesai), pengujian
ini juga kurang rentan terhadap kontaminasi. NAAT telah diterapkan untuk genotipe virus
(misalnya HIV, HBV , dan HCV) serta untuk mendeteksi mutasi yang menyebabkan resistensi
terhadap agen antivirus. tiga pendekatan telah diambil: amplifikasi target amplifikasi probe,
amplifikasi sinyal, seperti uji DNA rantai cabang (bDNA) dan uji penangkapan hibrid.
Pengembangan PCR real-time otomatis menggunakan teknik fluoresensi dan deteksi produk
yang diperkuat secara terus-menerus telah mempersingkat waktu deteksi secara signifikan
dibandingkan dengan pengujian PCR konvensional.

II. Alat dan Bahan

A.Alat
1. Termocycler
2. Gel Elektroforesis
3. Transfer Gel
4. Incubator atau Oven
5. Spektrofotometer
6. Autoradiografi atau Scanner Fluoresen

B. bahan

1.Sampel DNA
2. Probe DNA
3. Buffer Hibridisasi
4. larutan Pencucian
5. Reagen Deteksi
6. Gel Loading Dye
7. Marker atau Ladder DNA

III. Langkah Kerja

1. Siapkan sampel yang mengandung materi genetik virus, seperti darah, air liur, cairan
tubuh, atau jaringan biologis yang relevan.
2. Ekstraksi asam nukleat ( RNA atau DNA) dari sampel menggunakan teknik ekstraksi yang
sesuai
3. peroleh probe DNA atau RNA yang spesifik untuk virus yang ingin Anda deteksi.
Probenya dapat berupa radioisotop, fluoresen, atau non-radioaktif, tergantung pada
preferensi dan metode deteksi yang digunakan.
4. Panaskan sampel asam nukleat bersama dengan probe pada suhu tertentu untuk
memungkinkan terbentuknya pasangan basa komplementer antara probe dan materi
genetik virus jika ada.
5. Cuci sampel untuk menghilangkan probe yang tidak terikat ke materi genetik virus.
6. Deteksi sinyal hibridisasi, baik dengan menggunakan autoradiografi (jika Anda
menggunakan probe radioisotop) atau teknik fluoresensi (jika Anda menggunakan probe
fluoresen). Perangkat seperti scanner fluoresen atau alat radiografi dapat digunakan
untuk mengambil gambar dan menganalisis hasil.
7. Analisis hasil hibridisasi untuk menentukan keberadaan atau kuantitas materi genetik
virus. Hasil positif akan menunjukkan kehadiran virus yang diidentifikasi oleh probe.
8. Validasi hasil dengan menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif untuk
memastikan keakuratan dan keandalan hasil.
IV. Interpretasi Hasil

Positif

positif ditandai dengan deteksi atau kemunculan sinyal hibridisasi yang muncul dalam
eksperimen. Tanda-tanda positif ini akan bervariasi tergantung pada metode hibridisasi yang
digunakan.

1. Hibridisasi Radioisotop ditandai dengan sinyal otonom dari radioaktif yang digunakan
dalam probe.
2. ibridisasi Fluoresen ditandai dengan fluoresensi dari probe yang digunakan.
3. Hibridisasi Non-radioaktif ditandai oleh kemunculan pita atau sinyal pada membran
yang telah diinkubasi dengan probe yang spesifik.

Negatif

Ditandai dengan ketidaan deteksi atau kemunculan sinyal hibridisasi yang muncul dalam
eksperimen. Tanda-tanda negatif ini akan bervariasi tergantung pada metode hibridisasi yang
digunakan.

1. Hibridisasi Radioisotop ditandai dengan tidak ada sinyal otonom dari radioaktif yang
digunakan dalam probe.
2. ibridisasi Fluoresen ditandai dengan tidak ada fluoresensi dari probe yang digunakan.
3. Hibridisasi Non-radioaktif ditandai olehb tidak ada kemunculan pita atau sinyal pada
membran yang telah diinkubasi dengan probe yang spesifik.
V. Daftar Pustaka

Veselinyová, D., Mašlanková, J., Kalinová, K., Mičková, H., Mareková, M. and Rabajdová, M.Veselinyová,
D., Mašlanková, J., Kalinová, K., Mičková, H., Mareková, M., & Rabajdová, M. (2021). Selected In
Situ Hybridization Methods: Principles and Application. Retrieved from
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8270300/

Stoler, D. L., & Michael, N. L. (1995). Nucleic Acid Blotting Techniques for Virus Detection.
https://doi.org/10.1016/b978-012748920-9/50004-2

‌
 LAPORAN PRAKTIKUM VIROLOGI

MATERI: Pemeriksaan Molekuler Virus Metode Western Blotting

TUJUAN :

1. Memahami konsep dasar pemeriksaan western Blotting

2. melakukan western blotting untuk mendeteksi protein spesifik dalam sampel.
3. Menganalisis hasil pemeriksaan Molekuler metode western blotting

L Dasar teori
Western blotting adalah teknik ampuh yang banyak digunakan dalam penelitian ilmiah dan
medis untuk memisahkan dan mendeteksi berbagai protein utama, terutama protein yang
jumlahnya lebih sedikit dalam sampel diagnostik penting. Ini melibatkan tiga langkah besar,
yaitu pemisahan protein berdasarkan berat molekul, transfer protein yang dipisahkan ke
membran, dan deteksi target protein dengan bantuan antibodi. Ini memiliki aplikasi yang luas
dalam penelitian dasar maupun lanjutan, seperti deteksi dan kuantifikasi protein, interaksi
protein-protein, interaksi protein-DNA, modifikasi pasca-translasi dan diagnosis penyakit.

Prinsip-prinsip western blotting adalah pemuatan protein yang sama, pemisahan protein
berdasarkan berat molekul, transfer elektroforesis ke membran yang sesuai, dan pemeriksaan
antibodi.

Western blotting (WB) adalah pendekatan standar emas yang paling umum digunakan untuk
memisahkan, memvisualisasikan, mengidentifikasi dan mengukur berbagai protein dari
campuran protein kompleks . Campuran protein dipisahkan oleh SDS-PAGE berdasarkan berat
molekul, diikuti dengan transfer elektroforesis protein ke membran adsorben nitroselulosa atau
polivinilidena difluorida . Teknik ini mengidentifikasi satu atau beberapa target protein sekaligus
melalui dua langkah utama, yaitu SDS-PAGE dan immunoblotting, dan melibatkan tiga elemen
kunci: pemisahan berdasarkan ukuran, transfer ke membran adsorben dan identifikasi protein
target menggunakan antibodi primer yang sesuai, diikuti dengan pengobatan antibodi
sekunder. Langkah-langkah ini memungkinkan deteksi protein spesifik dari campuran protein.
Dengan demikian, WB memungkinkan pemisahan dan identifikasi protein dalam penelitian
ilmiah dan biomedis, sehingga mendukung diagnosis berbagai penyakit.
ll. Alat dan Bahan

Alat:

1. Gel Elektroforesis
2. Transfer Elektroforesis
3. Termocycler
4. Unit Blok Ekspresi Gen (gel bloting)
5. Blocker
6. Sistem Deteksi

Bahan :

1. Protein Sampel
2. Marker Molekuler atau Ladder Protein
3. Antibodi Primer dan Sekunder
4. Buffer Transfer
5. Reagen Pewarna
6. Larutan Blocking
7. Larutan Antibodi Primer dan Sekunder
8. Larutan Substrat

III. Langkah Kerja

1. Siapkan sampel, lalu ekstraksi protein dari sampel biologis , seperti sel atau jaringan. Ini
melibatkan pemecahan sel dan pemurnian protein.
2. Ukur konsentrasi protein dalam sampel menggunakan metode seperti Bradford atau
metode Lowry.
3. Siapkan gel elektroforesis ( gel poliakrilamida) dan pilih konsentrasi gel yang sesuai
berdasarkan ukuran protein target. Buat lubang di atas gel untuk memuat sampel.
4. Muat sampel protein ke dalam lubang-lubang pada gel elektroforesis. Selain sampel
protein, muat juga marker molekuler atau ladder protein sebagai patokan ukuran. Lalu
Jalankan elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran molekulnya.
Selama elektroforesis, protein bergerak melalui gel menuju elektroda positif.
5. Potong membran (biasanya nitroselulosa atau PVDF) sesuai dengan ukuran gel dan
aktifkan membran dengan melembabkan dalam buffer transfer. Lalu Transfer protein
dari gel ke membran dengan menggunakan unit blotting elektroforesis. Biasanya, ini
melibatkan transfer dengan arus listrik selama beberapa jam hingga semalam.
6. Blokir membran untuk mencegah interaksi nonspesifik dengan menggunakan larutan
blokir yang mengandung protein (misalnya, albumin serum manusia atau kasein). Dan
 Inkubasikan membran dengan antibodi primer yang spesifik untuk protein target.
Antibodi primer ini akan berikatan dengan protein target jika ada dalam sampel.
7. Cuci membran untuk menghilangkan antibodi primer yang tidak terikat.
8. Inkubasikan Kembali membran dengan antibodi sekunder yang memiliki label
(misalnya, enzim peroksidase atau fluoresen) yang memungkinkan deteksi. Lalu Cuci
membran lagi untuk menghilangkan antibodi sekunder yang tidak terikat.
9. Deteksi substrat enzim peroksidase, jika menggunakan metode dengan fluoresen,
gunakan alat seperti scanner fluoresen untuk mengambil gambar membran dan
mendeteksi sinyal fluoresen.
10. Interpretasikan hasil dalam konteks eksperimen dan tujuan penelitian. Tentukan apakah
protein target ada dalam sampel.

IV. Interpretasi Hasil

Hasil pemeriksaan molekuler Western blotting positif ditandai oleh kemunculan sinyal atau pita
pada membran yang sesuai dengan protein target yang Anda cari. Cara penandaan hasil positif
dalam Western blotting akan bervariasi tergantung pada metode deteksi yang digunakan

1. Hibridisasi dengan Enzim Peroksidase Hasil positif seringkali ditandai oleh kemunculan
pita atau band yang muncul pada lokasi protein target.
2. Hibridisasi dengan Fluoresen hasil positif ditandai oleh kemunculan fluoresensi pada
membran pada lokasi protein target.

V. Daftar Pustaka
Begum, H., Murugesan, P., & Tangutur, A. D. (2022). Western blotting: a powerful staple in scientific and
biomedical research | BioTechniques. https://www.future-science.com/doi/10.2144/btn-2022-
0003

Kartheek Gavini, & Kodeeswaran Parameshwaran. (2023, April 14). Western Blot. Nih.gov; StatPearls
Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK542290/

Gholam Hossein Meftahi, Zahra Bahari, Ali Zarei Mahmoudabadi, Iman, M., & Zohreh Jangravi. (2021).
Applications of western blot technique: From bench to bedside. Biochemistry and Molecular
Biology Education, 49(4), 509–517. https://doi.org/10.1002/bmb.21516