Metode pemeriksaan

viral load
Cytomegalovirus
Diana Intan Gabriella Lusiana
PENDAHULUAN
• Ada beberapa persyaratan untuk pengujian optimal pemantauan viral
load CMV Karakteristik yang paling penting adalah:

• Sensitivitas tinggi yang memungkinkan deteksi dini pada individu dengan

risiko tinggi terhadap penyakit,
• Potensi untuk mengukur hasil untuk meningkatkan nilai prediksi positif dan
untuk mengukur beban virus selama pengobatan antivirus,
• Kecepatan untuk memungkinkan inisiasi dini atau perubahan perawatan,
• Tingkat reproduksi yang tinggi.
Antigenemia assay
• Untuk mendeteksi dan menghitung jumlah lekosit pada darah tepi
terutama polymorphonuclear (PMN) yang positif mengandung matriks
phosphoprotein (pp65) CMV
• Prinsip pemeriksaan :
• PMN diwarnai dan diikat oleh Ab monoclonal terhadap matriks pp65
• Hasil  rasio jumlah sel yang positif mengandung Ag terhadap jumlah sel
yang dipakai untuk membuat slide
• Digunakan untuk monitoring infeksi CMV dan terapi
Quantitative pp65 Antigenemia
Assay
• Uji antigenemia terdiri dari langkah-langkah i:
• Isolasi PMN dengan pemisahan dekstran dan
persiapan slide,
• Fiksasi,
• Imunostaining,
• Membaca dan kuantifikasi.
Metode
• Isolasi dan persiapan slide
Heparin, EDTA, dan sitrat yang setara dengan antikoagulan dalam sampel
darah kemudian diserahkan ke laboratorium untuk pengujian antigenemia.
Untuk hasil yang optimal, slide harus disiapkan pada hari yang sama, dalam
waktu 6 jam dari pengumpulan darah.
Slide dapat diwarnai.
Dekstran adalah yang paling sering digunakan untuk memisahkan leukosit
dalam uji antigenemia.
Karena antigenemia pp65 ditemukan terutama dalam granulosit, metode
yang dipilih untuk fraksi mononuclear leukocytes(MN) seperti Ficoll gradient
separation tidak boleh digunakan, ada variabilitas yang tinggi antara slide
dalam sampel dengan viral load yang rendah sehingga penggunaan hanya
satu slide cenderung membahayakan sensitivitas uji.
• Fiksasi
Meskipun fiksasi aseton memberikan sinyal pewarnaan yang kuat, sel-sel yang terwarnai memiliki
morfologi dan artefak yang buruk terjadi dengan pewarnaan imunoperoksidase karena enzim peroksidase
endogen. Peroksidase endogen dapat diblokir, tetapi ini menambah langkah tambahan pada prosedur.
Beberapa alternative metode fiksasi yaitu menggunakan formaldehyde–Nonidet P-40 (NP-40 )
menghasilkan sinyal yang jelas, sedikit artefak dan sensitivitas yang tinggi dengan pewarnaan
immunofluorescence.
• Immunostaining
Antibodi monoklonal (MAb) diarahkan terhadap protein matriks lebih rendah, sehingga pp65 digunakan
dalam pengujian. Protokol asli menggunakan fiksasi aseton dalam hubungannya dengan pewarnaan
imunoperoksidase untuk visualisasi namun memiliki hasil artefak yang relatif tinggi . metode pewarnaan
alternatif seperti imunofluoresensi dan alkali fosfatase anti alkali fosfat (APAAP). Tingkat artefak yang
lebih rendah, waktu pemrosesan yang lebih pendek, dan sensitivitas yang lebih tinggi dengan pewarnaan
imunofluoresensi interpretasi slide lebih mudah dan lebih tidak memakan waktu karena rasio signal-to-
noise yang tinggi dari teknik ini memungkinkan pembacaan slide di perbesaran rendah.
• Kuantifikasi
Dua metode saat ini digunakan untuk mengukur hasil antigenemia. Metoda yang lebih umum digunakan
adalah melaporkan jumlah sel positif per slide atau jumlah sel yang digunakan untuk preparasi slide.
Adapun Metode lain yaitu mengukur hasil per 50.000 sel dengan memperkirakan jumlah sel, pada setiap
pemeriksaan dengan Dengan flow cytometry.
Nonmolekular quantitative CMV
assay
Aplikasi polymerase Chain
Reaction(PCR) Deteksi Infeksi
Cytomegalovirus (CMV)
• Deteksi adanya infeksi Cytomegalovirus (CMV)dapat dilakukan dengan PCR dengan
menggunakan sampel plasma penderita.
• Target yang digunakan adalah gen DNA polymerase CMV yang spesifik dan tidak menunjukkan
homologi terhadap family herpesvirus lainnya.
• Metode PCR ini akan menghasilkan fragmen DNA berukuran 362 bp.
• Monitoring terapi terhadap CMV dapat dilakukan dengan PCR kuantitatif dengan menggunakan
primer yang membawa biotin.
• Produk PCR didenaturasi untuk menghasilkan untai tunggal kemudian dihibridisasi dengan
pelacak yang terikat pada wadah.
• Setelah hibridisasi konyugat avidin-peroksidase akan menempel pada biotin. Larutan substrat
yang mengandung H2O2 dan 3,3, 5,5’-tetrametil-benzidin (TMB) ditambahkan.
• Peroksidase yang terikat akan mengkatalisis H2O2 dan reaksi oksidasi TMB membentuk
kompleks berwarna yang diukur secara kolorimetri.
Prosedur
• Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, enzim DNA polimerase
yangthermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, dan thermal cycler.
• Cara Kerja: PCR mix solution, untuk keperluan 10 μL pereaksi, maka campurkan:
Aquadest steril = 2 μL ; PCR mix = 5 μL ; Primer 1(10p mole) = 1 μL ; Primer 2
(10pmole) = 1 μL dan Sampel DNA = 1 μL.
Contoh PCR Program:
1. Hot start (denaturasi awal) 94 0C selama 2 menit
2. Siklus amplifikasi diulang 31 kali terdiri dari a) Denaturasi 94 0C selama 60
detik b) Annealing 58oC selama 45 detikc) Ekstensi 72 0C selama 60 detik
3. Periode ekstensi pada suhu 72 0C selama 5 menit
Catatan: bila primer diganti program PCR menyesuaikan susunan primer dan panjang DNA
produk amplifikasiyang diinginkan.(Fatchiyah dkk., 2012).
Analisis Asam Nukleat Secara
Kuantitatif
• Setelah proses isolasi asam nukleat (DNA atau RNA) selesai atau setelah proses hasil amplifikasi
selesai Anda lakukan, pemeriksaan dilanjutkan dengan analisis hasil isolasi (isolat) atau hasil
amplifikasi DNA atau RNA tersebut. Untuk menguji isolat DNA dan RNA dapat dilakukan secara
kuantitatif
• Cara termudah dan akurat untuk menentukan konsentrasi DNA adalah melalui analisis
spektrofotometri karena basa nitrogen dapat menyerap sinar UV, semakin tinggi konsentrasi DNA
atau RNA dalam larutan, maka sinar UV akan semakin menyerap.
• Pembacaan absorbansi dilakukan pada 260 nm yang mana DNA menyerap cahaya yang paling
kuat, dan nilai yang dihasilkan memungkinkan seseorang untuk memperkirakan konsentrasi
larutan.
• Untuk memastikan bahwa jumlahnya cukup berguna, maka membaca pada 260 nm harus berada
dalam jangkauan linier instrumen (umumnya nilai absorban antara 0,1 sampai 1,0).
• DNA untai tunggal mempunyai koefisien absorbsi 0,027; DNA untai ganda 0,02 dan RNA 0,025 μg
per mL per cm pada panjang gelombang 260 nm.
• Pengujian sampel (isolat) DNA atau RNA secara kuantitatif dilakukan
dengan langkah sebagai berikut:

• Disiapkan sampel DNA atau RNA hasil isolasi sebanyak 5 μL dan diteteskan
pada spektrofotometer UV-Vis nanodrop 2000.
• Dibaca grafik kemurnian dan konsentrasi DNA atau RNA.
• DNA dan RNA murni dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan
basa-basa purin dan pirimidin Untuk mengukur konsentrasi asam nukleat
digunakan rumus sebagai berikut:
Branched DNA Detection
• Sekuens asam nukleat target tidak direplikasi melalui amplifikasi enzimatik.
• Sensitivitas deteksi disediakan oleh amplifikasi sinyal dari probe.
• Menggunakan "capture probes," "probe bDNA" dan "probe bDNA amplifier."
bDNA ASSAYS
• Sistem amplifikasi sinyal fase padat
• Beberapa set probe oligonukleotida sintetis
• Menangkap probe terikat dengan baik
• Targetkan probe spesifik
• Molekul amplifier dengan 15 cabang identik, yang masing-masing dapat
mengikat 3 probe berlabel
Branched DNA Detection
Hybridize
bDNA Probe
Target: Capture Probe
Hybrid

Hybridize
bDNA Amplifier

Addition of
Alkaline Phosphatase
Molecules
bDNA ASSAYS
HYBRID CAPTURE ASSAY
• Larutan hibridisasi, uji penangkapan antibodi
• Deteksi kemiluminesensi molekul hibrid (DNA / RNA)
• DNA didenaturasi
• Hibridisasi ke probe RNA
• Ditangkap oleh antibodi anti DNA / RNA terikat
Hybrid Capture Assay
• Pelepasan asam nukleat
• Spesimen klinis dikombinasikan dengan
larutan basa yang mengganggu virus
atau bakteri dan melepaskan DNA
target.
• Hybridize RNA Probe with Target
DNA
• DNA target digabungkan dengan probe
RNA spesifik yang menciptakan RNA:
hibrida DNA.
Hybrid Capture Assay
• Capture Hybrids
• RNA: DNA Hibrida ditangkap pada
mikrotiter yang dilapisi dengan antibodi
khusus untuk hibrida RNA: DNA.
• Label for Detection
• RNA yang ditangkap: Hibrida DNA
terdeteksi dengan beberapa antibodi
yang terkonjugasi menjadi alkali
fosfatase
Molekuler quantitative CMV assay
Daftar Pustaka
• Castagnola, Elio, et al. "Quantitation of cytomegalovirus: methodologic
aspects and clinical application." Blood, The Journal of the American
Society of Hematology 98.5 (2001): 1627-1630.
• Santoso, Lucyana Alim, Mulya Rahma Karyanti, and Nina Dwi Putri.
"Tata laksana Infeksi Sitomegalovirus pada Pasien Transplantasi Organ
Padat." Sari Pediatri 19.3 (2018): 172-82.
• http://www.genscript.com/custom_service.html?
&gs_cust=391826&gs_camp=316
• http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html
Thankyou