Reny Juniar

1307618013

PCR DALAM VIRTUAL

1. Bagaimana pengertian PCR?

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik sintesis enzimatik untuk
mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode ini digunakan untuk meningkatkan jumlah
urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Setiap urutan basa nukleotida yang
diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali
banyaknya DNA target. Teknik PCR dapat mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan
kali hanya dalam waktu yang singkat. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik,
infeksi oleh virus, diagnosis dini penyakit,dll.

2. Bagaimana proses PCR? 

Proses PCR merupakan siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi
oleh enzim DNA polymerase.

1.Denaturasi

Denaturasi DNA tamplate adalah proses terputusnya ikatan hidrogen antar basa yang terdapat
dalam pasangan untai DNA tamplate. Untai ganda DNA template (unamplified DNA) dipisahkan
dengan denaturasi termal (suhu 95°C). Proses ini menyebabkan DNA yang semula untai ganda,
kini terpecah menjadi untai tunggal.

2.Annealing

Masing-masing untai tunggal DNA template akan mengalami proses ‘pendinginan’ hingga

mencapai suhu tertentu. Hal ini dimaksudkan untuk memberi jeda bagi penempelan primer.
Setiap untai tunggal DNA template akan ditempeli pasangan primer. Setiap pasangan primer
tersebut telah dipilih sedemikian rupa agar satu primer bersifat komplementer terhadap salah satu
ujung gen yang diinginkan pada salah satu rantai. Pasangan primer ini akan membentuk ikatan
hidrogen dengan sekuen komplementernya. Dengan demikian maka akan terbentuk molekul
untai ganda yang stabil.

3.Pemanjangan Primer

DNA Polimerase digunakan untuk proses memperpanjang primer (extend primers) dengan

adanya bantuan dari dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang
sesuai. DNA Polimerase yang paling sering digunakan dalam PCR berasal dari strain
bakteri Thermus aquaticus .
 3. Rangkuman kerja PCR berdasarkan video

PCR merupakan siklus berulang dalam melakukan penggandaan DNA. PCR digunakan sala
satunya untuk mendiagnosis infeksi yang disebabkan oleh virus. Sampel darah dari orang yang
terinfeksi virus diambil lalu DNA dari virus tersebut diperbesar agar dapat diketahui jenis virus
dan sifat-sifat virus tersebut. Untuk melakukan PCR dibutuhkan mesin PCR. Di dalam mesin ini
terdapat tabung yang berfungsi sebagai wadah untuk menampung bahan kimia. Komponen yang
dibutuhkan pada proses PCR adalah template DNA, nukleotida, primers, dan TAQ polymerase.

PCR memiliki 3 tahap yaitu denaturasi, annealing, dan ekstensi.

Pada denaturasi suhu dinaikkan menjadi 96 derajat celcius untuk memisahkan 2 strand DNA.
Proses ini menyebabkan DNA yang semula untai ganda, kini terpecah menjadi untai tunggal.
Kemudian dilanjutkan dengan proses annealing dimana dilakukan pemanasan kemudian
pendinginan . Awalnya suhu dinaikkan sampai 72 derajat celcius kemudian diturunkan
suhunya/didinginkan sampai suhu 55 derajat celcius agar primer DNA dapat mengikat strand
tunggal DNA dari hasil denaturasi. Setiap pasangan primer tersebut telah dipilih sedemikian rupa
agar satu primer bersifat komplementer terhadap salah satu ujung gen yang diinginkan pada
salah satu rantai. Pasangan primer ini akan membentuk ikatan hidrogen dengan sekuen
komplementernya. Dengan demikian maka akan terbentuk molekul untai ganda yang stabil.

Selanjutnya adalah proses pemanjangan, suhu dinaikkan lagi menjadi 72 derajat celcius sehingga
TAQ polymerase dapat memperbesar primer DNA, membentuk strand baru dari DNA. Dalam
satu siklus, dari satu potongan DNA dihasilkan 2 strand DNA ganda. Langkah ini akan terus
berulang. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Teknik PCR
dapat mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam waktu yang singkat

Umumnya jumlah siklus yang digunakan pada proses PCR adalah 30 siklus. Penggunaan jumlah
siklus lebih dari 30 siklus memungkinkan peningkatan jumlah produk yang non-target.

4.Bagaimana terapan terhadap uji COVID-19

Untuk memulai tes, pertama dilakukan pengambilan sampel. Sampel dapat dikumpulkan dari
swab nasopharyngeal atau oropharyngeal pasien yang terinfeksi virus.Untuk pengambilan
nasopharyngeal specimen swab dimasukkan ke dalam lubang hidung dan dengan lembut
dipindahkan ke depan nasofaring kemudian diputar beberapa saat untuk mengumpulkan lendir
yang mengandung virus. Kemudian swab ditempatkan ke dalam tabung steril yang mengandung
media transpor virus. Metode standar pengujian coronavirus adalah PCR yang digunakan untuk
menghasilkan milyaran salinan fragmen DNA yang spesifik. Metode ini dilakukan dengan
mengekstrak RNA virus. Sampel dimasukkan ke dalam tabung mikro centrifuge lalu
ditambahkan dengan lysis buffer yang mengandung phenol dan guanidine isothiocyanate.
Kemudian dicampur/diaduk dengan pulse vortexing dan diinkubasi pada suhu kamar hingga lisis.
Setelah sampel dilisiskan prosedur pemurnian dilakukan dengan menggunakan putaran. Sampel
dimasukkan ke dalam spin column kemudian sentrifugasi untuk mengekstraksinya lalu
dimasukkan wash buffer dan elution buffer umtuk membersihkan sampel sehingga tersisa viral
RNA saja. Selanjutnya untuk amplifikasi ditambahkan RT, Taqman, dNTPs, primer dan DNA
polymerase. Lalu dimasukkan ke mesin PCR lalu di reverse transkripsi melalui langkah
denaturasi , annealing, dan extension. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan
dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk
memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA.
Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Dihasilkan banyak salinan RNA
sehingga sampel tersebut dapat dianalisis. Dengan menggunakan halogen lamp, excitation filter,
mirror, emission filter dan camera tes PCR dapat dilihat melalui computer dan dapat diamati
adanya positif terinfeksi covid-19 atau tidak.