Universitas

Airlangga

PENGGUNAAN PCR UNTUK

DETEKSI TRANSOVARIA DBD

Poltekes Makasar, 28-20 Januari 2015

0
 Kajian transmisi transovarial virus DBD ini
PENDAHULUAN semula dianggap tidak berperan bagi
epidemiologi penularan DBD.

Informasi terakhir menunjukkan bahwa transmisi

transovarial virus DBD pada nyamuk Ae.
Aegypti berperan dalam meningkatkan dan
mempertahankan epidemik DBD.

Belum adanya data mengenai transovarial

infection rate pada kajian trasmisi transovarial
(TIR) virus dengue maka diperlukan kajian
mengenai TIR virus DBD pada Ae. aegypti

0
 • Di Indonesia adanya
transmisi transovarial virus
dengue pada nyamuk Ae.
Aegypti di alam pertama
kali dilaporkan Umniyati
(2004), yaitu di Kelurahan
Klitren Yogyakarta dengan
Memuat…
menggunakan metoda
imunositokimia streptavidin
biotin peroxidase
complex(ISBPC) pada
sediaan pencet kepala
(head squash) nyamuk

0
• Kemampuan virus DBD
untuk mempertahankan
keberadaannya di alam
dilakukan melalui dua
mekanisme yaitu transmisi
horizontal dan dengan
transmisi vertikal
(transovarial) yaitu dari
nyamuk betina infektif ke
generasi berikutnya

0
 PCR
UNTUK DETEKSI TRANSOVARIA
Memuat…
DBD

0
APA ITU PCR

?
●suatu proses enzimatik
untuk mengamplifikasi
(menggandakan) secara
eksponensial suatu
sekuen DNA
(nukleotida) tertentu
secara invitro

● Ditemukan pertama
kali oleh Dr. Kary
Mullis pada tahun 1983
(the Nobel Prize in
Chemistry in 1993). 0
APA ARTI PCR? :
Kenapa Disebut “Polymerase”?

Disebut “polymerase”
karena pada reaksi
dengan metode ini
menggunakan enzim
yang disebut : Enzim
DNA polymerase.

0
APA ARTI PCR? :
Kenapa Disebut “Chain”?

Disebut “chain”
karena produk
yang dihasilkan
pada reaksi
pertama kali
akan menjadi
substrat bagi
reaksi berikutnya
0
Organisme RNA, seperti virus DBD

metode reverse transcription PCR (RT- PCR)

0
Centrifug
e

Centrifug
e

0
 Reagensia PCR

1. cDNA template (DNA cetakan)

Mengandung regio cDNA target yang akan diamplifikasi

2. Oligonucleotide primers (Primer)

Dua set primer (F= forward dan R= reverse)
Memuat…
Berisi sekuen oligonukleotida pendek (15 – 25 basa nukleotida)
dengan susunan GC 40 – 60 %

• Thermostable DNA polymerase (DNA polimerase)

Fungsi sebagai katalisator pada reaksi polimerisasi rantai DNA
Enzim yang stabil pada suhu tinggi (>94ºC) Thermus aquaticus
Aktivitasnya secara eksonuklease dari ujung 5’ ke 3’

0
1. Deoxynucleotides triphosphates (dNTPs)
● Nukleotida yang digunakan sebagai bahan untuk membuat rantai
● DNA baru oleh enzim DNA polymerase
● Campuran dari 4 nukleotida yaitu : dATP, dCTP, dGTP dan dTTP yang
sama banyak

2. PCR buffer
● Fungsi memberikan lingkungan yang optimum bagi aktivitas enzim
DNA polymerase
Mempertahankan pH optimal saat reaksi
● Bufer standar untuk PCR mengandung KCl 50 mM, Tris-HCl pH 8,3 10
mM dan MgCl2 1,5 mM

0
 Checking the Quality of your DNA

• The product of your DNA extraction will be used in

subsequent experiments
• Poor quality DNA will not perform well in PCR
• You will want to assess the quality of your DNA
extraction using the following simple protocol:
• Mix 10 µL of DNA with 10 µL of loading buffer
• Load this mixture into a 1% agarose gel
• Analyze results (the following slides provide guidance)

0
 Expected Results in a Research Lab
Below is an agarose gel that has 5 genomic DNA samples from various plants.
Note that the DNA runs at a very high molecular weight and as a clear, thick band.
This DNA was extracted in a research lab under optimal conditions

1 kbp and 100 bp Genomic DNA of 5

ladders species of cereals 0
 Analyzing DNA samples
in a Classroom Lab

Ladder
Analysis of samples: A B C D E

Barley (A): This sample is fine

Corn (B): This sample is fine

Oat (C) : This sample is fine

Rice (D) : This sample is fine

Wheat (E): This sample has severe

degradation, can work for PCR
but should re-extract

0
1. Denaturation (denaturasi)
● Double stranded DNA single stranded DNA
● Suhu denaturasi yang tinggi putusnya ikatan
hidrogen diantara basa yang komplementer
● Bila fragmen DNA memiliki jumlah G + C > A + T
dipertimbangkan untuk menaikkan suhu denaturasi

0
1. Annealing
“Pengenalan/penempelan primer pada DNA template”
• Merupakan langkah yang sangat kritis
• Suhu annealing ditentukan oleh susunan primer
• Ikatan hidrogen akan terbentuk DNA polymerase akan berikatan ikatan
hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat

• Melting point dihitung (meeting point temperature) dengan persamaan

4°C X (jumlah G dan C) + 2°C X (jumlah A dan T) dari sekuen primer
yang telah dirancang
• Temperatur annealing biasanya 5°C di bawah Tm

0
1. Extension (reaksi polimerisasi)

● Reaksi polimerisasi/perpanjangan rantai

● Waktu yang dibutuhkan tergantung pada
panjang dan konsentrasi DNA target

0
0
ELEKTROFORESIS

0
 Keuntungan
PCR
1. Spesifisitas dan sensitifitas tinggi deteksi cDNA dalam
jumlah yang sangat sedikit.
2. Waktu pengujian singkat
3. Dapat mendeteksi suatu mikroorganisme sampai dengan

subtipe.
4. Mendeteksi lebih awal adanya agen penyebab.
5. Jumlah sampel template sedikit.
6. Dikerjakan secara in vitro.

0
 Kelemahan PCR
1. Mahal dan kurang mobil
2. Perlu kesabaran dan ketelitian
3. Kesalahan dalam proses pengerjaan, diketahui setelah
selesai

4. Harus ada primer yang spesifik dengan segmen cDNA yang

akan diamplifikasi

0
Tahapan Pelaksanaan
a.Koleksi Sampel
Pengoleksian sampel nyamuk dilakukan di rumah pasien yang
terdiagnosa positif DBD dan dirawat di RS. Koleksi nyamuk
dilakukan untuk mendapatkan nyamuk dewasa, larva dan pupa
dikoleksi dari habitatnya. Telur didapatkan dengan memasang
perangkap telur (ovitrap), sedangkan nyamuk dewasa ditangkap
dengan aspirator dan jala serangga. Larva dan pupa dikoleksi
dari habitatnya dengan menggunakan larva dipper dan pipet
hisap

0
b. Pemeliharaan dan Identifikasi nyamuk.
Nyamuk yang didapat dari koleksi dilapangan baik stadium telur maupun
stadium larva serta stadium pupa selanjutnya dipelihara di Insektarium
laboratorium hingga menjadi stadium dewasa dengan cara sebagai berikut :
Larva ,pupa maupun telur diletakan dalam mangkuk yang berisi air sumur
dan diletakan dalam kandang berukuran 80 x 80 x 80 cm yang ditutupi kain
kasa. Larva nyamuk yang dikoleksi dipisahkan berdasarkan waktu
pengoleksian dan tempat koleksi. Larva nyamuk diberi makan dengan pelet
ayam yang ditambah hati ayam yang dihaluskan, larva dipelihara hingga
menjadi dewasa. Air pemeliharaan diganti setiap hari.Setelah dewasa

nyamuk diberi makan dengan larutan glukosa 10% sampai berumur 7 – 14

hari. Setelah itu nyamuk di Identifikasi menggunakan pedoman Kunci
Identifikasi Aedes, Jentik dan Dewasa di Jawa (DepKes,1989). Nyamuk
dipisahkan berdasarkan daerah pengkoleksian,spesies dan jenis
kelamin.Dari satu kelompok (30 ekor) dimasukan kedalam tabung mikro
(ependorf) dan langsung dilakukan isolasi virus dengue,jika ada yang
belum dilakukan isolasi virusnya ,tabung yang berisi nyamuk disimpan di
freezer -20ºC atau di -70ºC.
0
c. Isolasi virus
Nyamuk dewasa yang telah dikelompokan
(♂, ♀ dan campuran ♂ dan♀ ) dilakukan
isolasi RNA virus DBD. Untuk Isolasi RNA
virus DBD dilakukan dengan
menggunakan kit Isolasi RNA Viral Qiagen
(QiAmp Viral RNA mini Kit).

0
Secara ringkas prosedur nya adalah :
Sampel nyamuk dewasa yang segar atau yang telah disimpan di freezer -20C
atau – 70C sebanyak 20 sampai 30 ekor dimasukan kedalam tabung mikro
(eppendorf),direndam dengan 50 ul buffer PBS (Posfat Buffer Salin) dan
digerus dengan pistil plastik. Setelah digerus ditambahkan 560 µl buffer
AVL yang disiapkan telah mengandung RNA carrier. Vortex selama 45
detik. Inkubasi 10 menit pada suhu kamar. Sentrifus tabung secara singkat
untuk membuang tetesan pada tutup tabung. Kedalam sampel tambahkan
560 µl etanol (96-100%) di vortex selama 15 detik dan sentrifus singkat.
Pipet 630 µl larutan masukan kedalam tabung pengumpul, sentrifus 8000
rpm selama 1 menit. Ulangi sampai semua lisat habis. Buang tabung yang
berisi filtrat, ganti tabung pengumpul yang baru, tambahkan 500 µl buffer
AW1 sentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Buang tabung yang berisi filtrat
dan ganti dengan tabung baru. Tambahkan 500 µl buffer AW2 sentrifus
14.000 rpm selama 3 menit. Buang tabung yang berisi filtrat dan ganti
dengan tabung yang baru. Tambahkan 60 µl buffer AVE, inkubasi pada
suhu kamar selama 1 menit. Sentrifus 8000 rpm selama 1 menit. RNA virus
hasil isolasi disimpan di freezer -20°C.
0
d. Amplifikasi dan Sequensing RNA virus
DBD.
Sebelum dilakukan amplifikasi RNA hasil
Isolasi dicek dengan gel agarosa 1% dalam
TBE . Amplifikasi RNA virus DBD dilakukan
dengan teknik RT-PCR ( Harris et al. 1998 ;
Johnson et al. 2005) yaitu menggunakan
primer spesifik serotype. Untuk ini adalah
dengan menggunakan kit Qiagen RT PCR
(One Step RT-PCR) dengan komposisi mix
seperti pada Tabel 1.
0
Tabel 1: Komponen reaksi untuk one step RTPCR

Komponen Volume/Raksi

Rnase free water 7,5 µl

5x Qiagen 1 step RT PCR buffer 10,0 µl

D NTP Mix 2,0 µl

5x q solution 10,0 µl
Primer DF 3,0 µl

Primer DR1 3,0 µl

Primer DR 2 1,5 µl

Primer DR 3 1,5 µl

Primer DR 4 1,5 µl
Qiagen one step RT PCR enzyme 2,0 µl

RNA (Template) 8,0 µl

Total 50,0 µl

0
 Tabel 2 :Program Reverse Transkriptase dan amplifikasi adalah:

Reaksi Suhu(ºC ) Waktu (menit) Jumlah siklus

Reverse Transcriptase (RT) 50 30

Initial PCR 95 15

Denaturation Memuat… 94 1
40 x
Annealing 55 1

Extension 72 1
Final extension 72 10

0
e.Elektroforesis
Fragmen DNA hasil amplifikasi
dielektroforesis pada gel agarosa 2% yang
diberi pewarnaan dengan ethidium bromid
dalam buffer 0,5x TBE (Tris-Borate EDTA)
dengan tegangan 60 Volt ( Sambrook et
al.1989,dan diamati dengan UV.

0
 f. Analisis Data
➢ Untuk penentuan keberadaan virus DBD pada nyamuk
menggunakan teknik RT-PCR didasarkan pada gambaran fragmen
(band) pada pasangan basa (bp) yang sesuai setelah dilakukan
elektroforesis .Ukuran pita yang diharapkan dari hasil amplifikasi
adalah 486 bp (DEN1), 119 bp DEN 2 , 290 bp DEN 3, dan 389 bp
DEN 4.

➢ Sepuluh mikroliter dari total 50 ul ul PCR mix di elektroforesis

pada agarose gel2% dalam 1 x TBE (89 mM Tris Borate,2 mM
EDTA pH 8,3) dengan marker DNA standar sebagai patokan untuk
melihat ukuran bp sampel. Ukuran pita yang diharapkan dari hasil
amplifikasi yang diharapkan adalah 486 bp (DEN1), 119 bp (DEN
2) , 290 bp (DEN 3), dan 389 bp (DEN 4). Pita yang jelas dengan
ukuran yang sesuai dengan pita marker yang dipakai dianggap hasil
positif dan didokumentasikan. 0
Gambar 1: Elektroferogram RNA virus dengue pada nyamuk Ae.aegypti
0
Gambar 2: Elektrofotogram pemeriksaan virus DBD dengan RT PCR pada nyamuk
0
 Sumber Pustaka
Hasmiwati dkk. 2009. Deteksi Virus Dengue dari Nyamuk Vektor
Aedes aegypti di Daerah Endemik Demam Berdarah Dengue (DBD)
di Kota Padang dengan Metode Reverse Transcriptase Polymerase
Chain Reaction (RT-PCR). Artikel Ilmiah.