Pemeriksaan DNA Human papillomavirus (HPV)

Kelompok 2
Anggota :
Anggun Nissa F 412118045
Lia Fitria 412118050
Resty Aprillia 412118051
Aicsah Rollis 412118053
Kharisa Fasya L 412118061
Rizqia Lifti G 412118062
Dede Angga 412118076
Andini Nur Khoirunnisa 412118080
 Virus Human papillomavirus (HPV) merupakan bentuk
01 keganasan virus kanker serviks pada leher rahim (serviks) yang
disebabkan oleh adanya pertumbuhan yang abnormal dari
jaringan epitel serviks .

Klasifikasi HPV berdasarkan tingkat keganasannya ada tiga

02 kelompok HPV yaitu Low Risk-HPV (LR-HPV), potential High
Karakteristik Risk-HPV (pHR-HPV), dan High Risk-HPV (HR-HPV).

Human Berdasarkan pada tingkat homogenitas DNA, International

Committee on the Taxonomy of Viruses (ICTV)
papillomavirus mengelompokkan Papillomavirus ke dalam keluarga
Papillomaviridae (awalnya Papillomavirus bersama
(HPV) Poliomavirus masuk dalam family yang sama). Hanya 5 genus
Papillomaviridae yang berhubungan dengan infeksi pada
manusia yaitu Alphapapilloma virus, Betapapi lloma virus,
Gammapapillomavirus, Mupapillomavirus dan
Nupapillomavirus. Namun yang paling sering ditemukan pada
pasien adalah genus Alphapapillomavirus.
 Persiapan Sampel
Stabilitas sampel
- Cervical biopsi pada suhu -20˚C
- Cervical brushes (HC Cervical sampler) 2 -
30˚C stabil selama 2 minggu atau suhu
-20˚C stabil selama 3 bulan
- Cervical sampel (LC prep atau thin prep)
pada suhu 2 – 30˚C stabil selama 3 minggu

Hal yang mempengaruhi

- Menstruasi atau perdarahan
Jenis Sampel
- Infeksi Vagina
- Cervical Biopsi
- Berhubungan seksual dalam 24 jam
- Cervical Brush
terakhir
- Atrofi genital
- Kehamilan dan masa nifas
- Pemeriksaan fisik
- Penggunaan zat kimia
 Hibridisasi asam nukleat secara langsung
Southen Blot
Metode ini digunakan untuk menguji keberadaan dari suatu
sekuens DNA. Metode ini mengkombinasikan proses
elektroforesis jel agaros untuk memisahkan DNA
berdasarkan ukuran dengan fragmen DNA hasil
elektroforesis yang ditransfer ke membrane filter, kemudian
membrane dihibridisasi dengan probe spesifik.
Hybrid capture II assay (HC-II)
Teknik HC II adalah antibody capture/solution
hybridization/signal amplification assay yang
memakai deteksi kualitatif chemiluminescence
terhadap DNA HPV. DNA yang sudah terdenaturasi
dihibridisasi dengan probe RNA, lalu hubrid DNA-
RNA berikatan dengan antibody spesifik. Ikatan
antibody dengan Hybrid DNA-RNA akan bereaksi
dengan alkali phosphatase, reaksi ini menghasilkan
sinyal chemiluminescence, sinyal amplifikasi dalam
bentuk emisi.
 Polimerase Chain Reaction(PCR)

Denaturasi
Denaturasi

PCR merupakan suatu metode Anneling

enzimatis untuk memperbanyak atau Anneling
menggandakan DNA tertentu secara
invitro.
Elongasi
Elongasi

Elektroforesis teknik memisahkan molekul-

molekul berdasarkan berat molekulnya dalam Hasil amplifikasi dilanjutkan dengan teknik
sebuah medan listrik pada suatu media. elektroforesis jel agarosa
 Cara kerja
Southern Blot
• Pendigestian DNA dengan enzim restriksi endonuklease sehingga terbentuk
fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil. Metode Southern Blot mempunyai
• Kemudian DNA dipisahkan sesuai ukuran dengan elekktroforesis  agarosa. sensitivitas yang rendah untuk
Setelah DNA terpisah, dilakukan pemindahan DNA ke membran nitroselulosa, mendeteksi HPV pada spesimen
tahap ini disebut dengan tahap blotting. klinik maupun mengidentifikasi tipe
• Membran nitroselulosa diletakkan pada bagian atas dari gel agarosa. HPV.
• Pada teknik blotting dengan menggunakan vakum, membran diletakkan pada
bagian bawah gel.Tekanan diberikan secara merata pada gel untuk memastikan
terjadi kontak antara gel dengan membran.Proses transfer berlangsung dengan Metode Southern Blot
memanfaatkan daya kapilaritas.
membutuhkan waktu yang lama,
• setalah DNA ditransfer ke gel, membran nitroselulosa dipanaskan dengan suhu
tinggi (60oC-100oC) kemudian membran diberi radiasi UV agar terbentuk
memerlukan DNA dalam jumlah
ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita DNA dengan membran.
banyak, dan membutuhkan tenaga
• Lalu, membran dicampur dengan probe (pelacak) yang telah dilabel radioaktif, teknisi yang terlatih
tetapi dapat juga digunakan label nonradioaktif yang dapat berpendar.
• Probe yang digunakan adalah DNA utas tunggal yang memiliki sekuen yang
akan dideteksi. Probe diinkubasi dengan membran agar dapat berhibridisasi
dengan DNA yang ada pada membran.Setelah proses hibridisasi, probe yang
Metode Southern Blot tidak dapat
tidak terikat dicuci dari membran sehingga yang tinggal hanya probe yang dilakukan pada jaringan yang
hibrid dengan DNA di membran.Pola hibridisasi kemudian dideteksi difiksasi dengan formalin
dengan visualisasi pada film X-ray melalui autoradiografi. dikarenakan DNA akan terdegradasi.
 Cara kerja
Hybrid capture II assay (HC-II)
Prinsip kerja HC-II yaitu menghancurkan protein kapsid virus HPV • HC-II memiliki keakuratan yang tinggi
dalam sampel yang telah dimasukkan ke dalam botol sampel yang
dalam mendeteksi infeksi HPV karena
telah disediakan. Setelah kapsid dirusak, tahap berikutnya adalah mampu mendeteksi keberadaan DNA
mendenaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal dengan HPV dalam jumlah sangat kecil
menambahkan larutan denaturasi. Denaturasi merupakan langkah
awal prosedur untuk mengeluarkan DNA (release DNA)t arget dari
sel. Kemudian hibridisasi antara DNA virus dengan probe RNA
menghasilkan DNA-RNA hybrid yang ditangkap oleh antibodi yang • Metode HC II mempunyai akurasi
kemudian akan bereaksi dengan antibodi kedua. Antibodi kedua ini sebesar 92 – 94% terhadap teknik
bertindak sebagai sinyal amplifikasi, makin banyak hibrid DNA-RNA pemeriksaan sitologi/histologi,
yang tertangkap pada dinding capture plate maka makin banyak pula memerlukan waktu pemeriksaan
antibodi kedua yang dapat mengenali hibrid DNA-RNA. Kuantitas yang lebih singkat, tidak terdapat atau
antibodi yang terikat pada hibrid DNA-RNA diukur dengan hanya sedikit kontaminasi dan dapat
menambahkan zat chemiluminescent sehingga menghasilkan sinyal memperkirakan kuantitatif jumlah virus
tanpa mengetahui genotipe HPV.
chemiluminescent. Sinyal ini akan ditangkap oleh alat luminometer
yang dihubungkan dengan komputer (Novel dkk., 2009b).
 Cara Kerja
Metode Amplifikasi Target (PCR)
Mengamplifikasi DNA hasil isolasi dengan 3 tahapan, yaitu :
1. Denaturasi (linearisasi DNA terjadi pada suhu 95ºC)
2. Annealing (penempelan primer pada DNA target yang
akan diperbanyak)
3. Elongasi (polimerisasi)

Hasil amplifikasi selanjutnya dapat dideteksi dengan teknik

elektroforesis menggunakan alat elektroforesis gel agarosa.

Metode PCR dapat diterapkan dengan sampel dan

komponen dalam jumlah sedikit, PCR merupakan metode
yang sensitif dan dapat mendeteksi tipe HPV khususnya HPV
resiko tinggi. Metode genotyping PCR memerlukan waktu
yang lama, mahal, dan memerlukan teknik laboratorium
yang tinggi.
 Cara Kerja

PCR - Reverse Line Hybridization (Contoh: Linear Array HPV Genotyping test)

Cara kerja PCR - RLB adalah sebagai berikut:

o Probe oligonukleotida dengan tipe HPV spesifik diimmobilisasi pada membran
nitroselulosa
o Kemudian dihibridisasi dengan produk PCR berlabel biotin yang sebelumnya
telah didenaturasi dalam kondisi basa
o Setelah proses hibridisasi, membran kemudian dicuci
o Hasil hibrid dapat dideteksi dengan penambahan streptavidin ± peroksidase dan
substrat yang akan menghasilkan warna pada garis-garis probe dan diinterpretasi
secara visual
 Interpretasi Hasil
Hasil hybrid akan membentuk warna pada garis-garis probe saat diberi streptavidin-peroksidase dan substrat sehingga
saat diinterpretasi secara visual hasil dari proses hibridisasi ( hibrid) dapat dideteksi.
Terima Kasih