PRAKTIKUM VI

UJI PEROKSIDA LIPID DALAM CAIRAN BIOLOGIS

A. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk menentukan besar kadar peroksida lipid (MDA) pada
larutan uji menggunakan larutan asam tiobarbiturat (TBA) dengan pengukuran serapan
cahaya oleh larutan pada panjang gelombang (λ) sebesar 532 nm.

B. Landasan Teori
Peroksida lipid merupakan reaksi berantai yang terus menghasilkan pasokan radikal
bebas sehingga terjadi reaksi-reaksi peroksidasi berikutnya. Keseluruhan proses tersebut
dapat diganbarkan sebagai berikut:
1. Inisiasi
Xo+ RH → Ro + XH
Pada tahap ini dengan adanya oksigen bebas akan terjadi pengambilan atom H dari
PolyUnsaturated Fatty Acid (PUFA) yang terdapat pada membran sel sehingga
menyebabkan kerusakan pada sel.
2. Propagasi
Ro+ O2→ROOo
ROOo + RH →ROOH + Ro ,danseterusnya
Hasildarireaksiiniakanmenjadiinisiatorbaruuntukbereaksidengan PUFA yang lain
sehinggamenghasilkanprodukradikalbaru.
3. Terminasi
ROOo + ROOo → ROOR + O2
ROOo + Ro→ ROOR
Ro + Ro → RR
Tahapinimengkombinasikanduaradikalmenjadisuatuproduk non radikal (Murray
dkk., 2000).
Parameter yang digunakan untuk mengevaluasi nilai biologis lemak, antara lain:
1. Bilangan peroksida
2. Bilangan TBA
3. Bilangan iod

1
 4. Kadar asam lemak trans dan asam lemak esensial
5. Profillipid darah (total kolesterol, trigliserida, HDL, LDL)
6. Kadar TBARS menunjukkan tingkat oksidasi lemak
7. Pengujian daya hipokolesterolemik in vitro
8. Pengujian kapasitas pengikatan asam empedu atau kolesterol in vitro
9. Kadar asam empedu sekum

Kadar Malondialdehid (MDA) Sebagai Indikator Peroksidasi Lipid

MDA terbentuk dari peroksidasi lipid (lipid peroxidation) pada membran sel yaitu
reaksi radikal bebas (radikal hidroksi) dengan Poly Unsaturated Fatty Acid (PUFA). Reaksi
tersebut terjadi secara berantai, akibat akhir dari reaksi rantai tersebut akan terbentuk
hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida tersebut dapat menyebabkan dekomposisi beberapa
produkal dehid yang bersifat toksik terhadap sel dan berbeda panjang rantainya, antara lain
MDA, yang merupakan salah satu aldehid utama yang terbentuk (Edyson, 2003).
Pengukuran kinetika peroksidasi lipid secara in vitro dapat dilakukan dengan
mengukur berapa banyak oksigen yang dibutuhkan. Ada beberapa metode yang dapat
digunakan, salah satunya TBA (Thiobarbituric Acid) reactivity test, yang dapat dilakukan
baik secara in vivo maupun in vitro. Tes ini didasarkan pada reaksi kondensasi antara satu
molekul MDA dengan dua molekul TBA pada kondisi asam. Hasilnya adalah pigmen
berwarna merah yang dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm. Jumlah MDA yang
terdeteksi menggambarkan banyaknya peroksidasi lipid yang terjadi (Janero, 1990).
MDA merupakan suatu produk akhir peroksidasi lipid, yang biasanya digunakan
sebagai biomarker biologis peroksidasi lipid dan menggambarkan derajat stres oksidatif.
Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki sebuah elektron yang tidak
berpasangan di orbit luarnya (unpaired electron). Zat ini sangat reaktif, dan struktur yang
demikian membuat radikal bebas cenderung “mencuri” atau mengekstraksi satu elektron dari
molekul lain di dekatnya untuk melengkapi dan selanjutnya mencetuskan reaksi berantai
yang dapat mengakibatkan cedera sel.
Oksidan adalah senyawa penerima elektron (electron acceptor), yaitu senyawa yang
dapat menarik elektron. Sering dibaurkan pengertian antara radikal bebas dan oksidan, karena
keduanya memiliki sifat-sifat yang sama yaitu kecenderungan untuk menarik elektron
(penerima elektron). Aktivitas keduanya menghasilkan akibat yang sama walaupun prosesnya
berbeda, oleh karena itu radikal bebas digolongkan dalam oksidan, namun tidak setiap

2
oksidan adalah radikal bebas. Radikal bebas lebih berbahaya dibandingkan dengan oksidan
yang bukan radikal bebas, dikarenakan sifat radikal bebas memiliki reaktivitas tinggi dan
kecenderungan membentuk radikal yang baru sehingga terjadi reaksi rantai (chain reaction)
dan akan berhenti apabila dapat diredam oleh antioksidan.
Strategi yang digunakan anti-oksidan dalam meredam oksidan adalah strategi 2 tahap,
yaitu:
1. Mencegah terhimpunnya senyawa-senyawa oksidan secara berlebihan
2. Mencegah reaksi rantai berlanjut
Asam lemak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi
peroksida lipid yang kemudian mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA).
MDA akan membentuk senyawa berwarna merah muda bila direaksikan dengan
asamtiobarbiturat (TBA). Jumlah MDA yang terbentuk dapat diketahui berdasarkan
kemampuan penyerapan cahaya pada A532 nm. Jumlah MDA yang terbentuk dapat
menggambarkan proses peroksidasi lipid.

(Gambar 1. Mekanisme Peroksidasi PUFA)

MDA sebagai salah satu produk lipid peroksidasi yang bersifat toksik terhadap sel
merupakan senyawa dialdehid yang memiliki tiga rantai karbon serta memiliki berat molekul
(BM) rendah dan dapat diproduksi oleh mekanisme yang berbeda-beda.

Beberapa studi menyatakan bahwa jumlah MDA dapat dihasilkan oleh beberapa
sumber, diantaranya berasal dari asam lemak yang setidaknya memiliki 3 ikatan rangkap,
radikal bebas melalui reaksi ionisasi dalam tubuh dan produk samping biosintesis

3
prostaglandin yang merupakan produk akhir oksidasi lipid membran, hasil dekomposisi dari
asam amino, karbohidrat kompleks, pentosa, dan heksosa serta berasal dari produk radikal
bebas yang dihasilkan oleh iridasi gamma.

C. Bahan dan Alat

1. Alat :
a. Sentrifugator
b. Penangas air
c. Vortex
d. Spektrofotometer
e. Tabung reaksi
f. Pipet mikro 1000 µL
g. Pipet volume
2. Bahan :
a. Serum
b. Larutan Asam trikloroasetat (TCA 10 %)
c. Larutan TBA 0,67 %
d. Akuades

D. Cara Kerja
Tabel 1. Urutan Langkah Kerja Uji Peroksidasi Lipid (MDA)
Uji
Urutan Larutan Blanko
U1 U2
1 Serum 1 mL 1 mL -
2 Akuades - - 1 mL
3 TCA 10% 2 mL 2 mL 2 mL
4 Divortex → disentrifugasi, 10 menit → diambil supernatan
5 TBA 0.67% 3 mL 3 mL 3 mL
Dimasukan ke dalam penangas mendidih, 10 menit →
6
didinginkan
7 Dibaca serapan pada panjang gelombang 532 nm

4
E. Analisis Data

Larutan Absorbansi (duplo) Absorbansi

Uji I II rata-rata
U1 0.044 0.034 0.039
U2 0.196 0.209 0.203
Blanko 0.012 0.012

Tabel 2. Data Hasil Pembacaan Absorbansi Larutan Uji pada

Panjang Gelombang 532 nm

Perhitungan Kadar MDA Larutan Uji dengan menggunakan rumus :

Kadar MDA=

Keterangan :
ε = Konstanta 153000 M-1 cm-1
A = Absorbansi larutan Uji dikurangi Absorbansi larutan Blanko

Perhitungan konsentrasi Lipid (MDA) pada Larutan Uji :

1. Larutan Uji 1 (A = 0.039 – 0.012 = 0.027)

Kadar MDA U1 =

0.027
= M
= 0.00000018 M
= 1.8 x 10-6 μM

5
 2. Larutan Uji 2 (A = 0.203 – 0.012 = 0.191)

Kadar MDA U2 =

0.191
= M
= 0.00000125 M
= 1.25 x 10-6 μM

F. Pembahasan
Perbedaan perlakuan pada larutan uji dengan blanko yaitu dengan penambahan serum
pada larutan uji 1 dan 2, sedangkan pada blanko ditambahkan akuades. Blanko bertujuan
untuk meminimalisasi pembacaan serapantanpa terganggu oleh serapan zat asing selain
pereaksi. Masing-masing larutan uji dibuat duplo bertujuan untuk meminimalisasi kesalahan
pembacaan serapan dari larutan uji.
Penambahan TCA 10% pada masing-masing larutan uji maupun larutan blanko
bertujuan agar protein yang terkandung dalam darah pada larutan uji 1 dan 2 mengalami
pengendapan setelah sentrifugasi. Pengendapan protein dilakukan karena kandungan protein
yang terkandung dalam darah dapat mengganggu penetapan kadar peroksida lipid.
Mekanisme TCA 10 % sebagai agen pengendap yaitu ion negatif dari TCA akan bergabung
dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebagai kation (pH larutan dalam kondisi
asam hingga pH isoelektrik protein) hingga membentuk garam protein.Selain sebagai
pengendap darah, TCA juga digunakan untuk menginduksi reaksi peroksidasi supaya
terbentuk monodialdehid (MDA).
Sampel darah kemudian disentrifugasi dan diambil bagian supernatan yang
mengandung MDA dan direaksikan dengan larutan TBA 0,67% yang telah dipanaskan.
Tujuan pemanasan adalah agar TBA segera bereaksi dengan MDA dalam supernatan dan
memberikan warna merah. Selanjutnya diletakkan dalam penangas air yang mendidih selama
10 menit. Setelah dingin dibaca serapannya pada panjang gelombang 532 nm. Perubahan
warna menjadi merah muda pada larutan uji hampir tidak kasat mata, namun spektofotometer
dapat membaca nilai serapan dari larutan tersebut dengan sensitivitas tinggi.
Konsentrasi dari MDA dapat dihitung dalam percobaan ini melalui konversi nilai
serapan yang terbaca pada spektrofotometer terhadap nilai ɛ dari MDA yang sudah diketahui.

6
Dari hasil perhitungan, berhasil didapatkan bahwa nilai kadar MDA masing-masing sebesar
1.8 x 10-6 μM pada larutan uji U1 dan sebesar 1.25 x 10-6 μM pada larutan uji U2. Nilai
tersebut mencerminkan jumlah MDA yang berikatan dengan TBA. MDA sendiri merupakan
hasil dekomposisi asam lemak tidak jenuh (PUFA= poly unsaturated fatty acid), sehingga
konsentrasi dari MDA yang didapatkan dari perhitungan di atas mencerminkan aktivitas
peroksidasi dari PUFA menjadi peroksida lipid. Semakin tinggi konsentrasi MDA, semakin
tinggi proses peroksidasi lipid.

G. Kesimpulan
Hasil pengamatan absorbansi kedua sampel yang diujikan dengan metode TBARS
menunjukkan konsentrasi MDA pada larutan uji 1 lebih kecil daripada pada larutan uji 2.
Nilai MDA yang diperoleh dari pembacaan konjugat TBARS pada sampel ekivalen dengan
konsentrasi MDA, sehingga dapat disimpulkan bahwa hasil uji yang diperoleh dari metode
TBARS cukup representatif dalam menunjukkan konsentrasi MDA sampel plasma.

Daftar Pustaka
Edyson, 2003. Pengaruh Pemberian Kombinasi Vitamin C dan E Terhadap Aktifitas
Superoxide Dismutase (SOD) Dan Kadar Malondialdehyde (MDA) Pada Eritrosit
Rttus Norvegiacus Galur Wistar Yang Diinduksi L/tiroksin. J Biosains. 5(3): 40-48
Janero DR. 1990. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of
lipid peroxidation and peroxidative tissue injury. USA.
Murray, R.K., Bender, D.A., Botham, K.M., Kennelly, P.J., Rodwell, V.W., Weil, P.A. 2009.
Biokimia Harper. The McGraw-Hill Companies, Inc, New York.