1.

Metode Pengujian Antioksidan

a. TBARS (Thiobarbituric Acid Reactive Subtances)

Uji TBARS ini adalah uji untuk mendeteksi peroksida lipid.

Prinsip kerja nya yaitu malondialdehid yang terbentuk sebagai hasil
dari peroksidasi lipid bereaksi dengan asam tiobarbiturat untuk
membentuk pigmen merah muda yang memiliki serapan maksimum
pada 532 nm. Reaksi TBARS ini sebetulnya bukan reaksi spesifik
karena banyak zat lain, termasuk alkana lain, protein, sukrosa, dan urea
yang bias bereaksi dengan asam tiobarbiturat membentuk spesies
berwarna yang dapat mengganggu pengujian ini. Untuk pemisahan
lebih lanjut spesifisitasnya dilakukan pemisahan kromatografi cair
kinerja tinggi kompleks sebelum pengukuran. Untuk dilakukan
pengukuran produk reaksi TBARS utama menggunakan LC-MS.
Asam linoleat digunakan sebagai model lipid, dan oksidasi diinduksi
oleh ion Cu (II). Pigmen merah muda dianggap sebagai produk
kondensasi asam tiobarbiturat dan malondialdehida dalam
perbandingan molar 2: 1 (Jardine, Antolovich, Prenzler, & Robards,
2002).

Cara pengujiannya yaitu sebanyak sampel yang sudah dipreparasi

diambil beberapa µL ditambahkan dengan TCA 20%, NaThio TBA
1%, akuades, dan HCl 1N pada setiap penambahan reagen larutan
dihomogenkan dengan vortex. Diinkubasi pada incubator dengan suhu
95°C selama 30 menit. Setelah itu perlakuan diletakkan pada suhu
ruang hingga dingin untuk disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm
selama 10 menit. Sampel kemudian diukur absorbansinya pada
panjang gelombang 532 nm dan diplotkan pada kurva standar yang
telah dibuat untuk menghitung konsentrasi sampel (Soyadesita,
Lukiati, & Nugrahaningsih, 2013).

b. Metode oksidasi LDL (Low Density Lipoprotein)

Oksidasi LDL adalah proses peroksidasi lipid di mana asam lemak

tak jenuh ganda LDL berturut-turut terdegradasi ke berbagai produk.
Pengukuran Laju nya dapat diukur secara terus menerus dengan
memonitor perubahan absorbansi diena 234 nm, yang berkembang
dalam LDL selama oksidasi melalui pembentukan hidroperoksida asam
lemak terkonjugasi. korelasi die dengan peningkatannya sangat
berkaitran erat dengan peningkatan MDA atau lipid hidroperoksida
karena durasi fase lag ditentukan oleh antioksidan endogen yang
terkandung dalam LDL. Uji oksidasi LDL dengan perantara Cu2 + ini
pertama kali dikembangkan oleh Esterbauer et al. (1989) dan memiliki
 banyak keuntungan dibandingkan dengan metode lain yang menentukan
oksidasi LDL.

Mekanisme Referensi
Reaksi lipoksigenasi
Tembaga dan oksidasi yang
dimediasi oleh seruloplasmin
Oksidasi-media zat besi
Oksidasi yang dimediasi
peroksidase termasuk
mieloperoksidase dan heme
Oksidasi yang dimediasi
peroksinitrit

Cara pengujian LDL oksidasi dengan ELISA yaitu sampel diukur

dengan menggunakan enzyme-linked immunosorbent assay (Mercodia
Oxidized LDL ELISA kit). Mikroplat dicoating dengan mouse
monoclonal anti-oxidized LDL, Mikroplate diisi dengan kalibrator dan
plasma. sebanyak 25 µl kemudian ditambahkan asaay buffer sebanyak
100 µl, inkubasi 2 jam sambil di shaker pada suhu ruang (18-25º C).
Dicuci 6 kali dengan wash buffer sebanyak 350 µl dan ditambahkan
enzim konjugat (Monoclonal anti- apoB) 100 µl masing masing strip,
setelah itu di inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang (18-25º C)
selanjutnya dilakukan pencucian yang kedua sebanyak 6 kali dengan
wash buffer. Ditambahkan substrat TM 200 µl, Inkubasi 15 menit pada
suhu ruang tanpa dishaker dan ditambahkan stop solution 50 µl,
dinkubasi 30 menit dan Hasilnya dibaca pada panjang gelombang 450

2. Metode Uji Antikanker secara in vitro

a. Clonogenic assay