4.

1 METODOLOGI

Pengukuran kadar MDA serum dapat dilakukan melalui beberapa cara,

yaitu sebagai berikut:

1. Tes thiobarbituric acid-reactive substance (TBARS)

Dasar pemeriksaan adalah reaksi spektrofotometrik sederhana, dimana satu

molekul MDA akan terpecah menjadi 2 molekul 2-asam thiobarbiturat. Reaksi ini

berjalan pada pH 2-3. TBA akan memberikan warna pink-chromogen yang dapat

diperiksa secara spektrofotometrik.

Tes TBA selain mengukur kadar MDA yang terbentuk karena proses peroksidasi

lipid juga mengukur produk aldehid lainnya termasuk produk non-volatil yang

terjadi akibat panas yang ditimbulkan pada saat pengukuran kadar MDA serum

yang sebenarnya. Kadar MDA dapat diperiksa baik di plasma, jaringan maupun

urin.

Pengukuran reaksi TBA dengan metode kolorimetri dengan spektrofotometer

merupakan kadar MDA yang paling sering dilakukan. Metode yang digunakan

adalah metode Yagi. Metode ini mudah dilakukan akan tetapi bersifat tidak

spesifik oleh karena mengukur produk aldehid lainnya Pengukuran MDA

dilakukan dengan pereaksi thiobarbituric acid (TBA) dengan mekanisme reaksi

penambahan nukleofilik membentuk senyawa MDA-TBA. Senyawa ini berwarna

merah jambu yang dapat diukur intensitasnya dengan menggunakan

spektrofotometer. Metode ini mempunyai kepekaan yang cukup tinggi, mudah

diaplikasikan untuk berbagai sampel pada berbagai tahap oksidasi lipid.

 Gambar 2 Reaksi MDA-TBA.18

TBA akan bereaksi dengan gugus karbonil dari MDA, yaitu satu molekul MDA

akan berikatan dengan dua molekul TBA sehingga membentuk senyawa

kompleks berwarna merah. Terbentuknya warna merah tersebut akan diukur

serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm yang

sebanding dengan tingkat oksidasi lipid. Pada reaksi ini ada sejumlah senyawa

lain yang juga bereaksi dengan TBA, namun karena jumlahnya kecil maka bisa

diabaikan. Senyawa-senyawa itu diantaranya adalah glukosa <0.4 mg (2.2 μmol)

dan sukrosa <8.56 mg (25.0 μmol) (Ohkawa et al. 1979).

Nilai normal MDA tergantung metode yang digunakan, 4 μmol/l dengan

mengukur TBAR dengan metode kolorimetri, kadar normal hingga 2,5 μmol/l

dengan metode fluorometri, dan kadar 0,60 - 1μmol/l dengan metode HPLC
2. Pengukuran reaksi TBA dengan metode fluorosens

Metode ini memiliki keunggulan dibanding metode kolorimetri oleh karena tidak

terganggu oleh beberapa substansi produk reaksi TBA yang larut air. Pemeriksaan

dilakukan dengan metode spektrofluorometri.

3. Pengukuran MDA-TBA dengan HPLC (High Performance Liqiud

Chromatography)

Metode ini secara spesifik dapat mengukur kompleks MDA-TBA, sehingga

pengukuran kadar MDA lebih akurat. Merupakan metode pengukuran kadar

MDA serum yang paling sensitif dan spesifik. MDA bukan produk yang spesifik

dari proses peroksidasi lipid sehingga dapat menimbulkan positif palsu yang

berakibat nilai duga positif yang rendah, dan telah dilaporkan dapat

meningkatkan spesifisitas pada pemeriksaan kadar MDA serum. Namun demikian

metode ini membutuhkan kondisi asam dengan suhu tinggi sehingga tetap ada

kemungkinan terbentuknya MDA yang bukan karena peroksidasi lipid.

Prosedur Pemeriksaan:

Reagen
Reagen stok TCA-TBA-HCl (15% w/v trichloric acid; 0,37% w/v thiobarbituric

acid; 0,25 N hydrochloric acid). Reagen dicampur dan dihangatkan untuk

melarutkan asam thiobarbituric

Bahan :

1. 1,0 mL of biological sample (serum)

Alat :

Tabung vacutainer, 3cc syringe, sentrifuge, micropipette,

spectrophotometer, cuvette, hot plate, beaker glass, penjepit tabung, rak tabung,

tabung reaksi, vorteks

Langkah kerja :

1.pengambilan sampel darah vena mediana cubiti menggunakan spuit 5 ml yang

steril

2.Masukkan darah spuit ke dalam tabung EDTA/vacutainer, sentrifugasi untuk

mendapatkan plasma

3.masukkan plasma ke dalam tabung reaksi menggunakan mikropipet sebanyak 1

mL

4.Campurkan 2,0 mL larutan stok TCA-TBA-HCl, vorteks

5.masukkan tabung reaksi ke dalam penangas mendidih selama 15 menit

6.Ambil tabung reaksi dan tunggu hingga dingin.

7. Sentrifuse 3000 rpm selama 10 menit, ambil supernatan dengan menggunakan

mikropipet.

8.Baca asorbansi supernatannya dengan panjang gelombang 535 nm

9.Analisis dan catat hasil bacaan Spektrofotometer. Hitung konsentrasi MDA

dengan rumus & koefisien 1,56 x 105 M –1 cm–1