Analisa Vitamin C

Metode Instrumen
1. Spektrofluorometri
Suatu metode spektrofluorometri untuk menentukan kadar vitamin C yang mendasar
pada reaksi yang dikatalisis oleh hemoglobin telah dikembangkan.
Metode spektrofluorometri lain untuk analisis kuantitatif vitamin adalah berdasarkan
pada reaksi antara asam askorbat (AA) dengan metilen biru (MB).

2. Spektofotometri
Asam askorbat dalam larutan air netral menunjukkan absorbansi maksimum pada 264
nm dengan nilai E1%= 579. Panjang gelombang maksimum ini akan bergeser oleh
adanya asam mineral.

Metode Non Instrumen

1. Iodimetri
Dasar metode ini adalah sifat mereduksi asam askorbat. Metode iodimetri (titrasi
langsung dengan larutan baku ioodium 0,1 N) dapat digunakan terhadapa asam
askorbat murni atau larutannya.
Prinsip
Yodium sebagai oksidator mengoksidasi vitamin C, kelebihan yodium akan
segera terdeteksi dengan indicator amilum yang dalam suasana basa berwarna biru
muda.
Prosedur
• Timbang 100-300 gram sampel padat
• Hancurkan dalam blender sampai diperoleh slurry
• Timbang 10-30 g slurry masukkan ke dalam labu takar 100 ml
• Tambahkan aquades sampai tanda
• Saring dengan kertas saring atau disentrifuse untuk memisahkan filtratnya
• Ambil 5-25 ml filtrate dengan pipet
• Masukkan ke dalam erlenmeter 125 ml
• Tambahkan 2 ml larutan amilum 1% (soluble starch) dan tambahkan 20 ml aquades
• Kemudian titrasi dengan 0,01 N standar yodium
• T.A.T ditandai dengan terbentuknya warna biru muda
Perhitungan:
 • 1 ml 0,01 N yodium= 0,88 mg asam askorbat

2. 2,6-dikllorofenolindofel (DCIP)
Metode 2,6-diklorofenolindofenol (DICP) ini berdasarkan atas sifat mereduksi asam
askorbat terhadap zat warna 2,6-dilorofenolindofenol. Asam askorbat akan mereduksi
indicator warna 2,6-diklorofenol-indofenol membentuk larutan yang tidak berwarna.
Pada titik akhir titrasi, kelebihan zat warna yang tidak mereduksi akan berwarna
merah muda dalam larutan asam.

Analisis Vitamin B
Metode Analisa Vitamin B
I. Metode spektrofluorometri
a) Fluorometri langsung
• Prosedur manual. AOAC Official Method 970.65 merupakan metode utama yang
digunakan untuk analisis kandungan riboflavin dalam bahan makanan.
• Metode ini mengukur riboflavin total setelah hidrolisis asam FMN dan FAD menjadi
riboflavin bebas
• Hidrolisis disempurnakan dengan autoklav menggunakan HCL 0,1 N selam 30 menit
• Protein dipisahkan dengan mengatur pH 4,5 dan menyaring atau mensentrifusnya
untuk menjernihkan ekstrak
• pH selanjutnya ditingkan kan secara bertahap sampai pH 6,8 untuk mengecek bahwa
tidak ada pengendapan lanjut yang terjadi
• Prosedur AOAC mencatata bahwa penambahaan natrium hidrosulfit lebih dari 20 mg
tiap tabung dapat mengurangi bahan-bahan berfluoresensi yang mengganggu,yang
dapat menimbulkan ketidakakuratan hasil uji
Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang bebas dari
senyawa bewarna yang menggunakan atau senyawa penganggu lain dan mengandung
riboflavin lebih besar dari 0,1%. Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap
campuran yang tidak mengandung senyawa berfluoresensi atau senyawa harus
dilakukan secepat mungkin karena riboflavin terurai oleh sinar ultraviolet. Beberapa
senyawa pengganggu dapat dioksidasi dengan penambahan kalium permanganat,
kemudian kelebihan pemanganat dapat dihilangkan dengan penambahan hydrogen
peroksida.
 Prosedur penetapan kadar vitamin B1 secara Spektrofluorometri :
1. Penyiapan kolom kromatografi
2. Penyiapan larutan baku Tiamin HCL
3. Penyiapan sampel (ekstraksi)
4. Hidrolisis dengan enzim
5. Pemurnian
6. Oksidasi Tiamin menjadi Tiokrom
II. Metode kolorimetri
Penentuan thiamin dengan Kolorimetri :
Prinsip :
Thiamin + garam reinecke  endapan
Endapan + aseton  larut  diukur kadarnya pada λ 525 nm *diperlukan standar thiamin

III. Metode alkalimetri

IV. Metode argentomeri
Adanya klorida dalam tiamin hidroksida dapat ditetapkan secara argentometric
dengan menggunakan metode Volhard. Pada penetapan dengan metode Volhard
suasananya harus asam sebab jika suasananya basa akan terjadi reaksi antara perak
nitrat dengan basa membentuk Ag(OH) yang pada tahap selanjutnya akan membentuk
endapan Ag2O, akibatnya perak nitrat tidak hanya bereaksi dengan sampel tetapi juga
bereaksi dengan basa.
V. Metode gravimetric
Tiamin dalam tablet vitamin B1 dan dalam injeksi dapat ditetapkan secara gravimetric
dengan cara mengendapkan larutan tiamin menggunakan asam silikowolframat.
Prinsip :
Thiamin + garam reinecke  endapan  dikeringkan  ditimbang
*hanya dapat dilakukan jika sampel mengandung banyak thiamin (>50 mg)
*jika kurang, lebih baik menggunakan fluorometer atau kolorimeter
VI. Kromatografi
Kromatografi dengan deteksi UV-Vis dan fluoresensi merupakan metode yang paling
umum digunakan untuk analisis vitamin B1 dalam bahan makanan.
tiamin tidak bersifat fluoresen,akan tetapi vitamin ini dan ester fosfatnya dapat
direaksikan dengan kalium heksasianoferat atau disebut juga dengan kalium
 ferisianida,untuk menghasilkan senyawa tiokrom yang bersesuaian yang menunjukan
fluoresensi biru yang kuat
penggunaan tiokrom sebagai produk oksidasi tiamin yang spesifik dan sangat
berfluorosensi telah digunaka secara rutin
Prosedur ekstraksi untuk analisis tiamin dengan kromatografi :
• Untuk pengujian vitamin total, ekstraksi harus membebaskan tiamin dari matrik
sampel yang kompleks dan menghidrolisis esternya. Ekstraksi semacam ini
melibatkan hidrolisis asam dan enzim mengikuti AOAC
• The European Union Measurement and Testing Program Telah mempublikasikan
prosedur ekstraksi yang optimal dengan cara :
1. autoklav-kan sejumlah 0,2 – 5,0 g sampel dalam HCL 0,1 N selama 30 menit pada
suhu 121 °C
2. Atur pH alikuot 4,0 dengan bufer natrium asetat4,0 M (Ph 6,1)
3. Tambahkan 100 mg takadiastase tiap g sampel
4. Inkubasikan pada suhu 37 °C sampai 45 °C
5. Didinginkan, disaring dan sentrifus
Penentuan thiamin dengan fluorometer :
Prinsip :
• oksidasi thiamin menjadi thiokrom (turunan thiamin yang dapat berpendar dengan
sinar UV)
• Bila senyawa yg dapat berfluoresen lain dapat dipisahkan, maka tingkat fluoresensi
thiamin akan proporsional dng kadarnya
• REAGENSIA : kalium ferrisianida 1% baru
Metode analisis vitamin B1, engan fluoremetri melibatkan tahapan-tahapan sebagai berikut :
1. Hidrolisis asam
2. Hidrolisis enzimatis
3. Pembersihan (clean up) ekstrak
4. Pembentukan tiokrom