Analisa Vitamin larut air

dalam makanan
Dosen pengampu : Nurul Hekmah, S.Pd, M.Pd.
Kelompok 5

Alyaa Syavirna Gina Nur Inayah

1 Islamyati
Nim : 19S10290
2 Nim : 19S10298

Jamil Mubarak Lailan Nadjad

3 Nim : 19S10302
4 Nim : 19S10304
 1
Pengantar teori
kimia vitamin larut
air
 
Vitamin dan Koenzim Yang Larut Dalam Air
Sebagian besar vitamin larut dalam air merupakan komponen sistem enzim yang
banyak terlibat dalam membantu metabolisme energi. Vitamin larut air biasanya
tidak disimpan di dalam tubuh dan dikeluarkan melalui urine dalam jumlah kecil.
Oleh karena itu vitamin larut air perlu dikonsumsi tiap hari untuk mencegah
kekurangan yang dapat mengganggu fungsi tubuh normal.
 
Vitamin larut air terdiri dari : Vitamin C & B- Kompleks (B1/Tiamin, B2/ Riboflafin,
Niasin, Biotin, Asam Pantotenat, B6, Folat, B12)
 
(Rahayu, Atikah.,dkk.2019.Dasar Dasar Gizi.Fakultas Kedokteran.Universitas Lambung Mangkurat.hal : 66)
 Struktur kimia dari vitamin yang larut air
 
Struktur kimia dari vitamin yang larut dalam air sangat beraneka ragam, tetapi mereka
mempunyai sifat molekul polar, sehingga larut dalam air. Semua vitamin yang larut
dalam air, dapat disintesis oleh tumbuh-tumbuhan (kacang-kacangan, bijibijian,
sayuran berdaun hijau dan ragi) kecuali vitamin B12. vitamin B komplek dan vitamin C
karena ke larutannya dalam air, tidak dapat disimpan lama dalam bentuk stabil, harus
disediakan terus menerus dalam makanan, kecuali vitamin B12, pada hati manusia
dapat disimpan untuk persediaan beberapa tahun. Semua vitamin yang larut dalam air,
kecuali vitamin C, berfungsi sebagai koenzim atau kofaktor dalam reaksi enzimatik.
 
(Aswata,I Putu Ari.2015.Struktur Vitamin Dan Koenzim Yang Larut Dalam Air.Buku Ajar Biokimia.Fakultas Pertenakan. Universitas Udayana)
Vitamin yang larut dalam air memiliki sifat-sifat umum, antara lain :

(1) tidak hanyatersusun atas unsur-unsur karbon, hidrogen dan oksigen;

(2) tidak memiliki provitamin;
(3) terdapat di semua saringan;
(4) sebagai prekusor enzim-enzim;
(5) diserap dengan proses difusi biasa;
(6) tidak disimpan secara khusus dalam tubuh;
(7) diekskresi melalui urin;
(8) relatif lebih stabil, namun pada temperatur berlebihan menimbulkan
kelabilan.
 2
Vitamin C
Prinsip dan cara analisis vitamin c :

Terdapat beberapa metode untuk mengetahui kadar vitamin C pada

suatu bahan pangan. Diantaranya adalah metode titrasi, metode
spektrofotometri, metode titrasi iodium dan metode DPPH. Analisis
vitamin C dapat dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Analisis
kualitatif dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya vitamin C dalam
sampel sedangkan analisis kuantitatif dilakukan untuk mengetahui
kadar vitamin C dalam sampel.
ANALISIS KUALITATIF
Metode pereaksi Benedict
Prinsip :
Ekstrak buah dan filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi menggunakan
pipet sebanyak 5 tetes. Kemudian ditambah 15 tetes pereaksi benedict dan
dipanaskan di atas api kecil sampai mendidih selama 2 menit
Analisisnya :
Adanya perubahan warna hijau kekuningan menandakan adanya vitamin C
pada sampel
ANALISIS KUANTITATIF
Metode Titrasi Asam Basa
Prinsip :
Prinsip analisis kadar vitamin C metode titrasi 2,6-diklorofenol yaitu menetapkan kadar vitamin
C pada bahan pangan berdasarkan titrasi dengan 2,6- diklorofenol indofenol dimana terjadinya
reaksi reduksi 2,6-diklorofenol indofenol dengan adanya vitamin C dalam larutan asam. Asam
askorbat mereduksi 2,6- diklorofenol indofenol dalam suatu larutan yang tidak berwarna. Titik
akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna menjadi merah muda dalam kondisi asam
(Bintang, 2010)
Cara analisis :
Analisis Vitamin C juga dilakukan dengan metode titrasi 2,6 D (Dichloroindophenol). Pada
titrasi ini, persiapan sampel ditambahkan asam oksalat atau asam metafosfat, sehingga
mencegah logam katalis lain mengoksidasi vitamin C.
Metode Spektrometer
 
Prinsip :
Cara menentukan kadar vitamin C adalah dengan menimbang 2 g sampel vitamin
C yang telah dihaluskan. Larutkan sampel tersebut dalam 50 mL aquadest
kemudian menanda batas larutan dalam labu takar 250mL. Setelah itu larutan
diencerkan hingga 200 kali, kemudian absorbansi diukur pada panjang gelombang
maksimum (David, 2015)
analisis :
Cara analisisnya Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang
gelombang tertentu manakala fotometer pula adalah alat pengukur intensitas
cahaya yang diabsorbsi atau ditransmisikan. Spektrofotometer pula digunakan
untuk mengukur energi cahaya secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan,
diemisikan atau direfleksikan sebagai fungsi dari panjang gelombang (Skoog,
1996).
Metode Iodium
 Prinsip :
penetapan kadar vitamin C secara iodimetri yaitu Sekitar 400mg asam askorbat yang ditimbang seksama
dilarutkan dalam campuran yang terdiri atas 100mL air bebas oksigen dan 25mL asam sulfat encer.
Larutan dititrasi dengan iodium 0.1N menggunakan indikator kanji sampai terbentuk warna biru. Larutan
standar yang digunakan dalam kebanyakan proses iodometri adalah natrium tiosulfat. Garam ini biasanya
berbentuk sebagai pentahidrat Na2S2O3.5H2O. Larutan tidak boleh distandarisasi dengan penimbangan
secara langsung, tetapi harus distandarisasi dengan standar primer. Larutan natrium thiosulfat tidak stabil
untuk waktu yang lama (Day & Underwood, 1981) Tembaga murni dapat digunakan sebagai standar
primer untuk natrium thiosulfat dan dianjurkan apabila thiosulfat harus digunakan untuk penentuan
tembaga. (Day & Underwood, 1981).
Cara analisis :
Cara analisisnya suatu larutan vitamin C (asam askorbat) sebagai reduktor dioksidasi oleh Iodium,
sesudah vitamin C dalam sampel habis teroksidasi, kelebihan Iodium akan segera terdeteksi oleh
kelebihan amilum yang dalam suasana basa berwarna biru muda. Kadar vitamin C dapat diketahui
dengan perhitungan 1ml 0,01 N larutan Iodium = 0,88 mg asam askorbat.
Metode DPPH
Prinsip :
DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517nm dengan warna violet
gelap. Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang
kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron
yang diambil (Sunarni, dkk.,2007).
 
Cara analisis :
Hasil dapat diamati dengan perubahan larutan dari ungu menjadi kuning. hanya
membutuhkan senyawa DPPH yang bersifat stabil dan senyawa pembandingan seperti
vitamin A, vitamin C dan vitamin E. Selain itu, metode ini tidak memerlukan substrat
karena radikal bebas sudah tersedia secara langsung untuk menggati substrat (Packer,
2002). Perubahan warna menunjukkan bahwa DPPH telah tereduksi oleh proses donasi
hydrogen atau electron dari senyawa antioksidan sehingga warnanya berubah dari violet
ke kuning dan DPPH tidak memberikan serapan pada panjang.
 3
Vitamin B
Vitamin B1 (Thiamin)
• Berbentuk kristal putih bersifat
higroskopis
• Berbau ragi, titik leleh 246-250 C
• Mudah larut dalam air
• Membantu sel tubuh mengubah
karbohidrat menjadi energi
• Berperan penting bagi organ jantung,
otot dan sistem saraf agar berfungsi
dengan baik
Spektrofotometri UV

I. Cara Kerja
a. Pembuatan Larutan Stok Vitamin B1 500µg/ml Ditimbang 25 mg Vitamin B1,
dilarutkan dengan aquadest dalam labu takar 50 ml sampai tanda tera

b. Pembuatan Larutan Bromo Thymol Biru 0,05%

Ditimbang 50 mg, dilarutkan dengan etanol 95% dalam labu takar 100
ml sampai tanda tera

Disonifikasi dengan sonikator

Apabila masih ada partikel yang belum terlarut,

disaring dengan kertas saring
c. Pemilihan panjang gelombang serapan maksimum
Dipipet 4 ml dari larutan induk, dimasukkan dalam labu
takar 25 ml

Ditambahkan 2 ml dapar amonia, ditambah 3,3 ml Bromo Thymol Blue 0,05%

Ditambah aquadest sampai tanda tera

Ditentukan λmax dengan scanning pada daerah 400-800nm

b. Pembuatan kurva baku

Dipipet larutan induk sebanyak 2; 2,5 ; 3; 3,5 ; 4 ml, masing-masing

dimasukkan dalam labu takar 25 ml

Ditambahkan 1,2 ml dapar amonia

 Ditambahkan 2,7 ml BTB 0,05%

Diencerkan dengan aquadest sampai tanda tera

Dibaca absorbansi pada λ max hasil scanning

Dibuat kurva baku

e. Penyiapan sampel

Ditimbang 10 tablet Neuralgin, ditimbang satu-persatu

Digerus sampai halus 10 tablet Neuralgin, ditimbang

1500 mg serbuk Neuralgin

ilarutkan dengan NaOH 0,1 N 20 ml dalam labu Erlenmeyer

 Disari dengan kloroform 3 kali @ 10 ml

Diambil sari kloroform, diuapkan sampai kering

Dilarutkan dengan HCl 0,1 N dalam labu takar

50 ml sampai tanda tera
f. Pengukuran kadar sampel

Dipipet 5 ml larutan sampel, dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml

Ditambahkan 1,5 ml dapar ammonia dan 3 ml BTB

0,05%

Ditambahkan aquadest hingga tanda tera

Diukur absorbansi pada λ max hasil scanning

Diplotkan pada kurva baku

Kromatografi
• Kromatografi dengan deteksi UV-Vis dan fluoresensi
merupakan metode yang paling umum digunakan untuk
analisis vitamin B1 dalam bahan makanan.
• tiamin tidak bersifat fluoresen,akan tetapi vitamin ini dan ester
fosfatnya dapat direaksikan dengan kalium heksasianoferat
atau disebut juga dengan kalium ferisianida,untuk
menghasilkan senyawa tiokrom yang bersesuaian yang
menunjukan fluoresensi biru yang kuat
• penggunaan tiokrom sebagai produk oksidasi tiamin yang
spesifik dan sangat berfluorosensi telah digunaka secara rutin
Prosedur ekstraksi untuk analisis tiamin
dengan kromatografi
• Untuk pengujian vitamin total, ekstraksi harus membebaskan tiamin dari
matrik sampel yang kompleks dan menghidrolisis esternya. Ekstraksi
semacam ini melibatkan hidrolisis asam dan enzim mengikuti AOAC
• The European Union Measurement and Testing Program Telah
mempublikasikan prosedur ekstraksi yang optimal dengan cara :
1) autoklav-kan sejumlah 0,2 – 5,0 g sampel dalam HCL 0,1 N selama 30
menit pada suhu 121 °C
2) Atur pH alikuot 4,0 dengan bufer natrium asetat4,0 M (Ph 6,1)
3) Tambahkan 100 mg takadiastase tiap g sampel
4) Inkubasikan pada suhu 37 °C sampai 45 °C
5) Didinginkan, disaring dan sentrifus
Metode Argentometri
Adanya klorida dalam tiamin hidroksida dapat ditetapkan secara
argentometric dengan menggunakan metode Volhard. Pada penetapan
dengan metode Volhard suasananya harus asam sebab jika suasananya
basa akan terjadi reaksi antara perak nitrat dengan basa membentuk
Ag(OH) yang pada tahap selanjutnya akan membentuk endapan Ag2O,
akibatnya perak nitrat tidak hanya bereaksi dengan sampel tetapi juga
bereaksi dengan basa.
VITAMIN B2 (RIBOFLAVIN)
• Bentuk kristal jarum oranye-kuning
• Kurang larut dalam air (11 mg/100 ml)
• Dalam bentuk kristal bersifat stabil
• Dalam bentuk larutan, mudah rusak, terutama dalam
suasana alkalis dan oleh cahaya nampak maupun sinar
UV  analisa dilakukan di ruang gelap
• Riboflavin relatif stabil terhadap panas
Metode Spektrofluorometri
1. Fluorometri langsung
• Prosedur manual. AOAC Official Method 970.65 merupakan metode utama yang
digunakan untuk analisis kandungan riboflavin dalam bahan makanan.
• Metode ini mengukur riboflavin total setelah hidrolisis asam FMN dan FAD menjadi
riboflavin bebas
• Hidrolisis disempurnakan dengan autoklav menggunakan HCL 0,1 N selam 30
menit
• Protein dipisahkan dengan mengatur pH 4,5 dan menyaring atau mensentrifusnya
untuk menjernihkan ekstrak
• pH selanjutnya ditingkan kan secara bertahap sampai pH 6,8 untuk mengecek
bahwa tidak ada pengendapan lanjut yang terjadi
• Prosedur AOAC mencatata bahwa penambahaan natrium hidrosulfit lebih dari 20
mg tiap tabung dapat mengurangi bahan-bahan berfluoresensi yang
mengganggu,yang dapat menimbulkan ketidakakuratan hasil uji
• Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang bebas dari
senyawa bewarna yang menggunakan atau senyawa penganggu lain dan
mengandung riboflavin lebih besar dari 0,1%.

• Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang tidak

mengandung senyawa berfluoresensi atau senyawa harus dilakukan secepat mungkin
karena riboflavin terurai oleh sinar ultraviolet. Beberapa senyawa pengganggu dapat
dioksidasi dengan penambahan kalium permanganat, kemudian kelebihan
pemanganat dapat dihilangkan dengan penambahan hydrogen peroksida.
• Riboflavin dapat diperoleh dng penyerapan menggunakan fuller’s earth dari
extrak hati segar atau extrak lain yg mengandung laktoflavin dlm larutan netral
atau asam kuat.
• Adsorpsi umumnya selesai dalam 10 menit.
• Selanjutnya dilakukan elusi dengan larutan dietilamina 10-15% atau lart NaOH
0.2% .
• Kadar vit. B2 dapat dianalisis secara fluorimetrik.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
• Teknik ekstraksi standar yang sesuai untuk kromatografi dan dapat diaplikasikan untuk
semu jenis bahan makanan apapun adalah dengan mengubah flavin terikat menjadi
riboflavin dengan cara melakukan autoklav sampel dengan asam mineral encer , diikuti
dengan digesti enzimatis pada pH optimum

• Kromatografi mampu memisahkan FMN dan riboflavin, oleh karena itu estimasi total
vitamin B2 dengan teknik ini tergantung pada perubahan FMN menjadi riboflavin.

Metoda Cepat Analisis Riboflavin dalam Susu

• 10ml susu dlm 125ml erlenmeyer ditambah 25ml 0.1N HCl. Gojog dan panaskan
dlm autoclave 120oC selama 30 menit
• Dinginkan dan atur pH dng 1N NaOH menjadi pH 6.0 (jangan lebih karena akan
tidak stabil)
• Asamkan kembali dng 1N HCl sampai pH 4.5 kmd pindahkan kedlm labu ukur
100ml, encerkan sampai tanda dng aquades, dan saring dng kertas Whatman no.42
• Ambil filtrat jernihnya, baca transmitannya pada 440-400nm (riboflavin
berfluoresensi pd λ tsb)
• Buat kurva standar transmitansi lart standar riboflavin murni dng kadar 0.1 – 0.5
g/ml dg perlakuan sama dng di atas.
VITAMIN B6 (PIRIDOKSIN)
• Piridoksin berupa bubuk tak berwarna dan berasa pahit
• Piridoksin mudah larut dalam air, alkohol, dan aseton; bersifat
stabil dalam asam, basa, dan panas, namun terpengaruh oleh
cahaya
• Dengan asam-asam mineral (misal HCl) akan membentuk garam
• Piridoksin-HCl berbentuk bubuk putih, bersifat larut dalam air
dan alkohol, serta berasa asin

• Pyridoxin dapat diestimasi dng metoda kimiawi,

mikrobiologi dan bioassay.
• Pyridoxin memiliki gugus fungsional fenolat,
sehingga dapat membentuk reaksi warna yang
dapat dimanfaatkan dalam tehnik analisis .
Fluorometri

• Metode fluometri melibatkan hidrolisi asam terhadap sampel-sampel bahan makana,

pemurnian secara kromatografi,serta perubahan vitamin-vitamin yang terelusi
menjadi asam 4-piridoksat, dan perlakuan asam pada zat antara untuk membentuk
turunan lakton
• Metode fluorometri telah digunakan untuk analisis vitamin b6 pada kedelai .
• Ekstraksi sampel melibatkan :
• - sampel diautoklav dengan adanya asam sulfat
• - dibufer sampai pH 4,5 lalu didigesti dengan Claradiastase,
• - diencerkan ,dan disaring
Metode Spektofotometri

• Pada daerah ultraviolet, piridoksin, piridokamin, dan piridoksal

menunjukan daerah penyerapan yang karakteristik walaupun tidak ada
maksimum untuk ketiganya. Kadar vitamin B6 jumlah dalam larutan
buffer pH 6,75 dapat ditetapkan pada panjang gelombang 325 nm. Pada
panjang gelombang ini, piridoksin dan piridoksal menunjukkan
absorbansi maksimum pada 316 nm. Kurva absorbsi piridoksin sendiri
berubah dengan berubahnya pH larutan. Larutan piridoksin dalam asam
klorida 0,1 N menunjukkan absorbansi maksimum pada 291 nm.
Metode Kromatografi
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan detektor fluorometri
telah digunakan secara luas untuk analisis kuantitatif vitamin B6 dalam
ayam dan bahan lainnya.

Metode Titrasi Bebas Air

Piridoksin hidroklorida dapat ditetapkan secara titrasi bebas air
setelah ditambah raksa (II) asetat.
ANALISIS VITAMIN B12
(KOBALAMIN) SECARA MIKROBIOLOGIS
Prinsip analisa (Apriyantono, 1989)
• Vitamin B12 dipisahkan dari makanan memakai
larutan buffer asetat pH 4,5
• Kobalamin (tidak stabil) ditambah Na-sianida 
terbentuk sianokobalamin yang stabil
• Kadar vitamin ditetapkan dengan menumbuh-kan
Lactobacillus leichmanii (bakteri tersebut
membutuhkan vitamin B12 untuk pertumbuhannya
sehingga pada kondisi terkontrol pertumbuhannya
spesifik)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
• Pengembangan metode kromatograf ini untuk analisis vitamin B12 dibatasi oleh
sensitifitas dan selektifitasnya yang rendah. Oleh karena itu, kebanyakan prosedur
melibatkan tahapan clean up dan pemekatan untuk menguji vitamin ini dalam
konsentrasi rendah
• Detektor spektrometer massa mampu menawarkan sensitifitas dan selektifitas yang
lebih baik dibandingkan detektor UV
Contoh analisis vitamin B12 dengan KCKT
Sampel: produk-produk makanan
Penyiapan sampel:
vitamin B12 bebas menjadi digesti dengan α-amilase
vitamin B12 total menjadi digesti dengan α-amilase,pepsin
Clean up: kolom imunifitas
Kolom: C18
Fase gerak: gradien. Asam trifluoroasetat 0.025% dalam air ph(2.6)-
asetonitril. Kecepatan alir=0.25 ml/menit
Deteksi: UV 361 nm
Vitamin B9 (Asam Folat)
Asam folat merupakan sekelompok senyawa yg bersumber pada
dedaunan hijau, memiliki karakter seperti vitamin, yg memiliki
aktivitas antianemia
ANALISIS FOLAT
SECARA MIKROBIOLOGIS
• Folat merupakan nama umum, termasuk asam folat. Folat bersifat labil
terhadap oksidasi, sinar, panas, dan leaching saat makanan diolah
• Analisa dilakukan secara mikrobiologis
• Prinsip analisa
o Folat sampel diekstrak dalam buffer pada 100oC
o Ekstrak diperlakukan dengan -amilase, protease, dan conjugase
o Respons pertumbuhan L. rhamnosus diukur dengan % transmitansi

Critical Point
• Perlu kehati-hatian tingkat tinggi untuk mencegah folat teroksidasi dan
mengalami degradasi fotokimia.
• Agen pereduksi (asam askorbat, -mercapto ethanol, and dithiothreitol) efektif
untuk mencegah oksidasi.
ANALISIS BIOTIN (vitamin H / B7)

• Biotin dianggap sebagai kelompok vitamin B kompleks

• Merupakan kristal yang larut dalam air dan alkohol
• Bersifat stabil dalam suasana asam, alkalis, oleh cahaya
dan suhu normal
• Tidak stabil pada suhu tinggi maupun oleh senyawa
oksidator
• Analisa kadar biotin : metoda mikrobio-logis dan bioassay
Terima kasih
Alternative Resources