 ANALISIS PROTEIN

 PENDAHULUAN

 Merupakan polimer yang tersusun atas asam amino

 Ikatan antar asam amino adalah ikatan peptida

 Protein tersusun atas atom C, H, O, N, dan pada protein tertentu mengandung unsur S. Jika
membentuk kompleks dengan senyawa lain dapat mengandung P

 Struktur protein: primer, sekunder, tersier, kuarterner

TUJUAN ANALISIS

 Menera jumlah protein dalam suatu bahan pangan

 Sifat protein yang diukur adalah kuantitas bukan kualitas

 Pengukuran kualitas protein biasanya diawali dengan pengukuran kuantitas

1.Uji kualitatif dengan ninhidrin

 Reaksi antara asam alfa amino dan ninhidrin akan terbentuk warna, melibatkan reaksi:

 Asam alfa amino + ninhidrin -- ninhidrin tereduksi + asam alfa amino + H2O

 Asam alfa amino + H2O - asam alfa keto + NH3

 Asam alfa keto + NH3 - aldehid + CO2

 Reaksi lengkap :

 Asam alfa amino + 2 ninhidrin - CO2 + aldehid + kompleks warna biru + 3 H2O

 Reaksi kimia

 Ninhidrin mengalami deaminasi oksidatif dan asam amino dekarboksilasi menjadi CO2, NH3 dan
aldehid.

 Ninhidrin yang tereduksi akan bereaksi dengan amonia dan dengan molekul ninhidrin lain
sehingga terbentuk senyawa kompleks berwarna ungu ( ungu Ruhemann).

 Ninhidrin hanya akan bereaksi dengan asam alfa amino bebas NH2-C-COOH, gugus ini terdapat
pada semua asam amino, peptida dan protein.

 Dekarboksilasi hanya terjadi pada asam amino bebas saja tidak terjadi pada peptida dan
protein.
 Hanya asam amino bebas saja yang akan membentuk kompleks warna biru.

Catatan!

 Warna ungu menunjukkan sampel mengandung asam amino (uji +) .

 Jika terbentuk warna lain seperti (kuning, orange dan merah) maka uji negatif.

 Sampel yang mengandung prolin, hydroxyproline, dan 2-, 3-, dan 4-asam aminobenzoat hasil
uji yang positif tidak akan memberikan biru tapi kuning.

 Garam amonium memberikan hasil positif.

 Beberapa amina seperti anilin dengan uji ninhidrin memberikan warna orange hingga merah (uji
negatif).

2. METODE KJEDAHL

 Dikembangkan oleh Kjedahl

 Peneraan empiris (tidak langsung)

 Yang diukur: kadar N

 Umumnya kadar N dalam protein adalah 16% sehingga kadar protein dalam suatu bahan=kadar
NX100/16

 Nilai 100/16=6.25 adalah faktor konversi yang umum digunakan

FAKTOR KONVERSI

 Faktor konversi bisa berbeda tergantung jenis protein dan kadar N dalam protein tsb

 Misal:

 Protein gandum : 5.70

 Protein susu : 6.38

 Gelatin : 5.55
 TAHAPAN METODE KJEDAHL

 Destruksi

 Destilasi

 Titrasi

TAHAP TITRASI

 Jika larutan asam penampung yang digunakan HCl, sisa asam klorida yang tidak bereaksi dengan
amonia (membentuk NH4Cl) dititrasi dengan NaOH

 Jika digunakan indikator PP akhir titrasi adalah perubahan larutan menjadi merah mudah
permanen (dari asam ke basa) atau jika digunakan MR larutan berubah menjadi kuning

 Buat titrasi untuk blanko (tanpa sampel)

Perhitungan :

%N= ml NaOH (blanko-sampel) X N NaOH X 14.008 X 100%

berat sampel (g) X 1000

 Jika larutan penampung adalah asam borat/HBO3 (asam lemah), banyaknya asam borat yang
bereaksi dengan amonia dapat diketahui dengan titrasi dengan HCl 0.1N dengan indikator
MR+BCG

 HCl akan mentitrasi amonium-borat menjadi amonium klorida sehingga pada akhir titrasi terjadi
kelebihan HCl/asam kuat

 Akhir titrasi ditandai dengan perubahan larutan dari biru/hijau menjadi merah muda

Perhitungan

%N= ml HCl (sampel-blanko) X N HCl X 14.008 X 100%

berat sampel (g) X 1000

 PERHITUNGAN KADAR PROTEIN

Dengan mengalikan kadar N dengan faktor konversi (FK), yaitu

Kadar protein (%) = Kadar N X FK

 PENETAPAN SAMPEL

 Timbang 1 gram bahan yang telah dihaluskan dan masukkan ke dalam labu kjeldahl.
Kalau kandungan protein bahan tinggi, gunakan bahan kurang dari 1 gram. Kemudian
tambahkan 7.5 g K2S2O4 dan 0.35 g HgO (Awas: zat ini beracun) dan akhirnya tambahkan
15 ml H2SO4 pekat.

 Panaskan semua bahan dalam labu kjeldahl dalam almari asam sampai berhenti
berasap. Teruskan pemanasan dengan api besar sampai mendidih dan cairan menjadi
jernih. Teruskan pemanasan tambahan lebih kurang satu jam. Matikan api pemanas dan
biarkan bahan menjadi dingin.

 Kemudian tambahkan 100 ml aquades dalam labu kjeldahl yang didinginkan dalam air es
dan beberapa lempeng Zn, juga tambahkan 15 ml larutan K2SO4% (dalam air) dan
akhirnya tambahkan perlahan-lahan larutan NaOH 50% sebanyak 50 ml yang sudah
didinginkan dalam lemari es. Pasanglah labu kjeldahl dengan segera pada alat distilasi.

 Panaskan labu kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapisan cairan tercampur kemudian
panaskan dengan cepat sampai mendidih.

 Distilat ini ditampung dalam erlenmeyer yang telah diisi dengan 50 ml larutan standar
HCl (0.1 N) dan 5 tetes indikator metil merah. Lakukan distilasi sampai distilat yang
tertampung sebanyak 75 ml.

 Titrasilah distilat yang diperoleh dengan standar NaOH (0.1 N) sampai warna kuning.
Buatlah juga larutan blanko dengan mengganti bahan dengan aquades, lakukan
destruksi, distilasi dan titrasi seperti seperti pada bahan contoh.

Contoh

 Berapa kadar protein sampel kedelai, jika berat sampel kedelai yang digunakan 1.04 g dan
jumlah larutan NaOH 0.1019 N yang dibutuhkan untuk titrasi sampel adalah 0.32 ml dan untuk
blanko 46.29 ml?
 3. METODE BIURET

 Pengukuran jumlah ikatan peptida dalam protein

 Semakin tinggi kadar protein bahan, jumlah ikatan peptida semakin banyak

 Dasar analisis: bahan yang mengandung ikatan peptida dua atau lebih membentuk kompleks
berwarna ungu dengan ion Cu2+/kupri pada kondisi alkali

Preparasi sampel

 Sampel cair yang jernih: bisa langsung digunakan atau dilakukan pengenceran terlebih dahulu

 Sampel cair yang keruh atau mengandung senyawa pengganggu seperti glukosa:

 Protein diendapkan dengan TCA

 Endapan dicuci dengan eter dan eter dibuang

 Endapan dilarutkan dalam 4 ml air

 Sampel padat:

 Sampel dihancurkan

 Disaring

 Disentrifusa

 Supernatan dianalisis

 Protein yang tertera adalah protein larut air

 Cara analisis

 Pembuatan kurva standar

 Penetapan sampel

 Peneraan dengan spektrofotometri

 Perhitungan

 Prosedur analisis
Pembuatan kurva standar

 Buat larutan standar BSA atau kasein dalam air dengan konsentrasi 0.5 mg/ml.

 Masukkan ke dalam tabung reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8. dan 1.0 ml larutan protein
standar. Tambahkan air sampai volume total masing-masing 4 ml.

 Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret ke dalam masing-masing tabung reaksi. Campur rata.

 Simpan tabung pada suhu 37C selama 10 menit atau pada suhu kamar selama 30 menit sampai
terbentuk warna ungu yang sempurna.

 Ukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm.

 Persiapan sampel

 Timbang sampel padat. Hancurkan sampel padat dengan menggunakan waring blender.
Hancuran yang diperoleh disaring lalu disentrifugasi. Supernatan didekantasi untuk
dipergunakan selanjutnya (protein yang terdapat dalam supernatan adalah soluble protein).

 Sampel cair yang berupa protein konsentrat, isolat yang tidak keruh, maka persiapan sampel
cukup dengan pengenceran saja. Jika cairannya keruh atau mengandung bahan-bahan yang
menganggu seperti glukosa maka harus dilakukan perlakuan sebagai berikut:

 Timbang ekstrak. Ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi seperti pada waktu penetapan
standar, kemudian tambahkan air sampai volume total masing-masing 1 ml.

 Tambahkan 1 ml TCA (Tri Chloroacetic Acid) 10% pada masing-masing tabung reaksi sehingga
protein akan terdenaturasi.

 Sentrifusa pada 3000 rpm selama 10 menit sampai protein yang terdenaturasi mengendap,
supernatan dibuang dengan cara dekantasi.

 Ke dalam endapan tambahkan 2 ml etil eter, campur merata lalu sentrifusa kembali untuk
menghilangkan residu TCA. Biarkan mengering pada suhu kamar.

 Ke dalam endapan kering ditambahkan air 4 ml, campur merata.

 Tambahkan 6 ml pereaksi biuret, alkali dalam pereaksi ini akan melarutkan endapan yang
tersisa.

 Penetapan sampel

 0.1-1.0 ml sampel (dipipet tepat) dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diperlakukan
seperti penetapan standar

 Contoh 1
 1. Berapa kadar protein (mg/ml) dalam sampel susu cair jika sejumlah 2 ml susu diberi perlakuan
sesuai perlakuan sampel cair yang keruh. Endapan yang diperoleh diencerkan dengan akuades
sampai volume 50 ml. Sebanyak 1 ml sampel ditera dengan spektrofotometer dan diperoleh
absorbansi sampel sebesar 0.84 dengan blanko sebesar 0.02. Kurva standar yang diperoleh
adalah sebagai berikut:

 Kurva standar

 Contoh 2

2. Berapa kadar protein dalam putih telur cair jika berat putih telur yang digunakan adalah 1,06 g dan
sampel diencerkan menjadi 1000 ml. Sebanyak 1 ml sampel putih telur yang sudah diencerkan yang
digunakan. Absorbansi yang diperoleh adalah 0,65 dengan kurva standar seperti no. 1.

 Contoh 3

3. Konsentrat protein kedelai sebanyak 0,86 g dilarutkan dalam 10 ml akuades. Sebanyak 1 ml

larutan diencerkan menjadi 100 ml. Sebanyak 1 ml sampel digunakan untuk penetapan protein dengan
metode Biuret. Jika absorbansi adalah 1,24 dengan kurva standar seperti no.1, berapa kadar proten
dalam konsentrat kedelai tersebut (% b/b)?

4. KADAR N-AMINO
(METODE TITRASI FORMOL)

 Digunakan untu mengukur kadar n-amino

 Dapat digunakan untuk mengukur tingkat hidrolisis protein

 Reaksi antara formol dengan gugus amino tetapi tidak dapat membedakan antara gugus amino
dengan gugus amin yang lain
 Prinsip analisis

 Larutan protein dinetralkan dengan basa NaOH kemudian ditambah formalin

 Formalin akan bereaksi dengan gugus amino dari protein atau asam amino membentuk
dimethilol

 Gugus karboksil tetap bebas (COOH)

 Gugus karboksil bebas ditentukan jumlahnya dengan titrasi menggunakan larutan NaOH

Perhitungan

Titrasi formol

= (vol. titrasi kedua – vol. titrasi blanko)-titrasi pertama

ml titrasi formol
% N = _______________ x N NaOH x 14.008
g bahan x 10

Prosedur analisis

 Pindahkan 10 ml atau 10 g sampel ke dalam erlenmeyer 125 ml dan tambahkan 20 ml aquades

dan 0.4 ml larutan kalium oksalat jenuh (kalium oksalat : air = 1:3) dan 1 ml phenolphtalein 1%.
Diamkan selama 2 menit.

 Titrasilah larutan contoh dengan 0.1 N NaOH sampai mencapai warna seperti warna standar
atau sampai warna merah jambu.

 Warna standar : 10 ml susu + 10 ml aquades + 0.4 ml K-oksalat jenuh + 1 tetes 0.01% indikator
rosanilin-chlorida.

 Setelah warna tercapai, tambahkan 2 ml larutan formaldehid 40% dan titrasilah kembali dengan
larutan NaOH sampai warna seperti warna standar tercapai lagi. Catatlah titrasi kedua ini.

 Buatlah titrasi blanko yang terdiri dari : 20 ml aquades + 0,4 ml larutan K-oksalat jenuh + 1 ml
indikator phenolphtalein + 2 ml larutan formaldehid dan titrasi dengan larutan NaOH.
 Contoh

 Berapa %N protein yoghurt jika hasil titrasi formol menunjukkan kadar NaOH 0,1102 N yang
dibutuhkan untuk titrasi pertama adalah 2,03 ml dan titrasi kedua adalah 24,08 ml. Berat
sampel adalah 1,04 g. Volume NaOH yang dibutuhkan untuk titrasi blanko adalah 0,87 ml.

5. Uji aktivitas enzim proteolitik

 Enzim proteolitik menghidrolisis ikatan peptida pada protein

 Termasuk reaksi hidrolitik

 Enzim bersifat spesifik

 Mempunyai spesifitas terhadap substrat

 Reaksi hidrolisis protein

 Spesifitas substrat

 Gugus R (alfa khimotripsin: tirosin, fenilalanin, triptofan)

 Konfigurasi asam amino (L atau D)

 Ukuran molekul protein

 Sebagian enzim proteolitik dapat menghidrolisis ikatan lain selain ikatan peptida

 Endopeptida atau eksopeptid

Uji aktivitas

 Buat larutan susu skim 5%.

 Buat larutan enzim konsentrasi 20, 30 dan 40%

 Siapkan 4 erlenmeyer, isi masing-masing dengan 40 ml larutan susu skim, masukkan 3

erlenmeyer dalam waterbath suhu 37 C(kira-kira 10 menit). Erlenmeyer yang satu tidak perlu
dimasukkan dalam water bath (untuk perlakuan kontrol/blangko)

 Masukkan masing masing ke dalam erlenmeyer 10 ml larutan enzim dengan konsentrasi yang
berbeda. Untuk perlakuan kontrol/blangko tidak ditambah enzim tetapi di tambah 10 ml
akuades ( dan tidak perlu di inkubasi).
 Ketiga erlenmeyer diinkubasi pada suhu 37 C selama 1 jam.

 Sesudah itu ambil 10 ml sampel tambah dengan 2 ml formaldehid , tambah indikator pp 3

tetes, lalu titrasi dengan 0,1 N NaOH

PERHITUNGAN

 ts = titrasi sampel

 tb = titrasi blanko

 berat sampel = berat susu skim dalam gram

 FP = Faktor pengenceran , jika sesuai dengan prosedur maka FP = 50/10= 5

% N = (ts-tb) ml x N NaOH x 14,008 x FP x100%

berat sampel (g) x 1000

 BIOLOGI MOLEKULER
 Material genetika

Informasi genetika dari organisme dibawa dalam bentuk molekul DNA yang pada beberapa
makhluk / organisme dalam bentuk RNA yang kemudian akan dipindahkan dalam bentuk
protein.

Untuk mendapatkan informasi genetik maka utas DNA tersebut harus dipotong terlebih dahulu
menggunakan enzim restriksi tertentu sesuai dengan utas DNA yang dikenalinya.

 Material Genetika

Kromosom (Protein + Asam Nukleat)

Ekstra Kromosom: -. Plasmid( Pada Prokaryot)

Ekstra Kromosom: -. Mitokondria

-. Kloroplas (organ yang berklorofil)

(Pada Eukaryot ): -.Sitoplasma

Protein

 Penyusun gen

 Merupakan rangkaian dari beberapa peptida

 Bagian yang penting di dalam plasma

 Cadangan makanan

 Sebagai bahan enzim (dasar penyusun enzim )

 Macam-macam protein

 Fungsional → Berbagai macam enzim (katalis)

 Cadangan → Disimpan sebagai protein cadangan

Lanjutan protein

 Pada dasarnya protein adalah polipeptida, setiap sel mampu mensintesis protein tertentu
sesusai dengan keperluan.

 Protein merupakan gabungan asam amino dengan gugus karboksil dari asam amino lain secara
berurutan,
Misal :

 Bila 2 asam amino yang bergabung maka terbentuk DIPEPTIDA

 Bila 3 asam amino yang bergabung maka terbentuk TRIPEPTIDA

 Bila terjadi penggabungan yang lebih besar maka akan dibentuk POLIPEPTIDA

 ASAM AMINO

Adalah suatu Molekul yang terdiri dari :

 Satu Gugus Karboksil

 Satu gugus amin (NH2)

 Asam amino yang paling sederhana adalah glisin

 Asam amino yang terdapat di dalam tumbuhan ada ± 20 macam

 Jenis asam amino dapat dilihat dari gugus R nya :

 Glisin, Alanin, Serin, Treonin, Valin, Leusin, Isoleusin, Norleusin, Asam Aspartam, Asam
Glutamat, Lisin, Arginin, Sistin, Sistein, Metionin,Fenilalanin, Tirosin, Histidin, Triptofan, Prolin

 Didalam Penggabungan 2 molekul asam amino akan melepaskan 1 molekul air

 Sandi genetik

 Sandi ( kode ) genetik

 Adalah merupakan triplet kodon ( triplet code )

 Merupakan gabungan dari 3 nukleotida yang menyandikan asam amino

 Basa nukleotida terdiri dari A,G,C,T tetapi dalam proses alaminya triplet kodon dalam
bentuk RNA ( sekuen basa mRNA → A,G,C,U)

 Basa tunggal mRNA tidak mengkode satu asam aminopun.

 Basa duplet (2 basa) : 42 → 16 asam amino < 20 asam amino

 Basa triplet (3 basa) : 43 → 64 asam amino >> 20 asam amino sehingga satu asam
amino dapat disandikan lebih dari satu triplet kodon

 Triplet kodon diawali / ditentukan menggunakan pendekatan sama dengan percobaan

Nirenberg
  Dari 64 kodon → 61 menyandikan 20 asam amino

 3 kodon yang tidak menyandikan asam amino adalah

UAA stop codon

UAG (nonsense codon)

UGA

 Asam amino pertama adalah : AUG = Metionin → startcodon

 Kode genetik selain degenerated ( universal ) : Seperangkat kodon yang sama dipakai
oleh semua organisme dan tipe sel.

 Sintesa/ Sumber Asam Amino

 Makanan

 Dari makanan dalam sel

 Hidrolisis Protein

 Protein didalam sel dicerna menjadi asam amino

 Peristiwa Aminasi

 Berasal dari karbohidrat melalui proses transaminasi, sebaliknya asam amino dapat
mensintesis karbohidrat melalui proses deaminasi
 • Tabel m RNA

BASA KEDUA

 Struktur Asam nukleat

Asam nukleat adalah suatu senyawa yang merupaka asam inti yang terdiri dari DNA dan
RNA
Merupakan rantai POLINUKLEOTIDA

yaitu : Makromolekul yang tersusun oleh molekul yang lebih sederhana yang disebut
Nukleotida

 Nukleotida merupakan molekul yang tersusun atas

 satu gula,

 satu basa, dan

 satu fosfat.

 Nukleosida adalah kombinasi suatu gula pentosa yang dihubungkan dengan basa purin atau
pirimidin melalui ikatan C – N
  Nukleotida

Protein yang bergabung dengan asam nukleat .

Nukleotida dalam sitoplasma dan dalam inti adalah sama tetapi jenis asam nukleatnya berbeda.

Nukleotida tersusun atas :

1 Basa DNA

1 Gula Komponen yang essential

1 Fosfat RNA

 Gula → Ribosa & Deoksiribosa

 Basa → Adenin, Guanin, Timin, Sitosin

Polinukleotida

adalah→ Ikatan antara 2 nukleotida dari 2 gugus fosfat yang terikat pada 2 pentosa →
ikatan Fosfodiester

 Tiap struktur DNA / RNA merupakan suatu polinukleotida yang ujung-ujungnya C 3 & C5

Nukleotida & Nukleosida

 STRUKTUR MOLEKUL DNA DAN RNA

 Bahan dasar penyusun molekul asam nukleat

 DNA (Double)

 2 rantai DNA yang membentuk helix saling berikatan antara hydrogen dengan basa nitrogen dari
utas DNA yang berhadapan

 Backbone fosfat terletak dibagian luar helix

 Basa nitrogen menghadap ke dalam

 Ke-2 utas DNA berlawanan arah

 5’→3’ \ A-T

 3’→5’ / G-C

 Ke-2 rantai double helix DNA →komplementer

 Informasi yang disandikan DNA menentukan sifat dan organisme

 Model Molekul DNA

1. Berdasarkan gagasan W.T Atsbury (1940)

 DNA memiliki struktur 3 dimensi berdasarkan hasil kristalografi sinar X. DNA sangat
padat maka nukleotida yang menyusun poli nukleotida berbentuk pipih yang masing-masing
tegak lurus terhadap sumbu memanjang dan tiap-tiap nukleoti da mempunyai jarak 3.4 Å

2. Wilkins

 Melanjutkan penelitian W.T Atsbury dan diperoleh serabut-

serabut DNA yang kemudian oleh Rosalind franklin berhasil

membuat foto melalui difraksi sinar X dan molekul DNA mem

punyai struktur spiral.

. Model Watson dan Crick

Kesimpulan Watson dan Crick

1. Deretan Polinukleotida DNA mempunyai bentuk sebagai spiral teratur

2. Spiral mempunyai diameter kira-kira 20 Å dan lebar spiral tetap

3. Spiral mempunyai satu putaran lengkap (10 X putaran ) jarak antara nukleotida 3.4 Å.
Jadi 1 putaran lengkap 34 Å.

4. Molekul DNA sangat padat , maka spiralnya Duplex.

5. Molekul DNA berbentuk 2 pita spiral yang saling berpilin (Double Helix) bagian luar
deretan gula fosfat (tulang punggung double helix/ backbone fosfat berada dibagian
luar)

6. Pada bagian dalam terdapat basa purin dan pirimidin

7. 2 Polinukleotida yang berhadapan dihubungkan oleh H+

 Model Double Heliks ( Watson & Crick)

 2 jenis struktur DNA : Struktur a dan b

 Setiap molekul tersusun oleh 2 rantai polinukleotida

 Ke 2 rantai nukleotida bersifat komplementer & antipararel

 Komplementer : Basa purin - Basa pirimidin

A T

G C

 Antipararel : 5! P 3! OH

3! OH 5! P

 Ke 2 rantai polinukleotida berputar membentuk pilinan mengelilingi satu sumbu perputaran

kearah kanan

 Ikatan Hidrogen : antara pasangan basa

 Ikatan fosfodiester : antara 2 nukleotida

 Gugus fosfat : Hidrofilik Gugus basa-basa :
Hidrofobik

 Struktur DNA

 RANTAI INFORMASI GENETIK

 BAGAN PROSES TRANSFER INFORMASI

DNA

( Replikasi) RNA Protein (Transkripsi)

 Hubungan gen dengan Protein

1. Gen mengendalikan sifat morfologi / sifat fisiologi melalui pembentukan enzim atau
protein

2. Penyakit yang diwariskan menunjukkan adanya perubahan struktur protein, misalnya :

Alkaptonuria,Anemia

3. Mutasi pada suatu gen menyebabkan terjadinya perubahan pada struktur enzim atau
protein

4. RNA merupakan perantara gen dengan protein

 Keparalelan Protein dengan Gen

1. Gen merupakan rangkaian nukleotida

2. Protein merupakan rangkaian asam amino

 3. Rangkaian nukleotida gen menentukan rangkaian asam

4. amino protein

Bukti : Perubahan Nukleotida gen menyebabkan perubahan asam

amino protein.