Asam Amino dan

Protein
Dika Betaditya, S.Gz., M.P.H.
http://www.free-powerpoint-templates-design.com
Pendahuluan
Insert the Subtitle of Your Presentation
 Pendahuluan
• Protein berfungsi sebagai zat pembangun dan juga menghasilkan kalori sebagai zat tenaga.
• Bila karbohidrat dan lemak tidak mencukupi kebutuhan kalori tubuh, maka protein dioksidasi untuk
menambahkan kalori tersebut.
• Protein terdiri dari unsur-unsur oksigen, karbon, hidrogen dan nitrogen. Nilai mutu protein tergantung
pada asam amino yang dikandungnya, yang merupakan bagian terkecil dari protein.
• Kandungan energi protein rata-rata 4 kilokalori/g atau setara dengan kandungan energi karbohidrat.
• Asam amino dibedakan atas asam amino esensial yaitu asam amino yang dibutuhkan oleh tubuh
tetapi tidak dapat disintesa oleh tubuh, sehingga harus terdapat dalam makanan sehari-hari.
• Asam amino non- esensial adalah asam amino yang dapat dibentuk di dalam tubuh, jadi tidak
mutlak harus terdapat dalam makanan.
• Asam amino esensial, antara lain: lisin, triptofan, fenilalanin, leusin, isoleusin, methionin, threonin
dan valin. Asam amino nonesensial, antara lain: arginin, histidin, glisin, serin, tirosin, dan sistin.
• Kesitimewaan protein adalah adanya atom nitrogen (N), dengan demikian penentuan secara kuantitatif
kandungan protein dengan menentukan kandungan N yang ada dalam bahan makanan.
 Analisis Protein

A. Macam Analisis Kualitatif

1. Reaksi Ninhidrin
2. Reaksi Biuret (Bisa digunakan untuk kuantitatif)
B. Macam Analisis Kuantitatif
1. Metode Volumetri (Metode Kjeldahl, Titrasi Formol)
2. Metode Gasometri
3. Metode Spektrofotometri (Biuret, Metofe Folli-ciocalteau, metode
lowry)
4. Metode Spektrofluorometri
5. Metode turbidimetri
6. Metode Pengikatan zat warna (dye binding methode)
7. Metode Kromatografi
Analisa
Kualitatif
 1. Reaksi Ninhidrin

• Uji Ninhidrin dilakukan dengan menambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin yang kemudian
dipanaskan. Reaksi ini terjadi dengan senyawa amin primer dan ammonia tanpa pembebasan CO.
Adanya protein atau asam amino ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu pada bahan uji.
• Ninhidrin adalah suatu senyawa oksidator kuat yang apabila bereaksi dengan asam α amino akan
menghasilkan warna ungu. Reaksi ini terjadi dengan senyawa amin primer dan ammonia tanpa
pembebasan CO. Reaksi ninhidrin digunakan untuk mengetahui adanya kandungan asam α-amino.
• Asam amino bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehida dengan satu atom C lebih rendah dan
melepaskan molekul NH3 dan CO2. Ninhidrin yang telah bereaksi akan membentuk hidrindantin. Hasil
positif ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna biru/keunguan yang disebabkan oleh molekul
ninhidrin dan hidrindantin yang yang bereaksi dengan NH3 setelah asam amino tersebut dioksidasi.
 Prosedur Uji Ninhidrin
• Masukkan 2 ml yang yang akan diuji dalam tabung reaksi.
• Tambahkan 5 tetes ninhidrin 0.1%.
• Panaskan dalam penangas air selama 10 menit.
• Amati munculnya warna biru/keunguan
 2. Reaksi Biuret
• Uji biuret merupakan uji umum untuk mengetahui ikatan peptida dalam suatu protein. Larutan protein
dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini memberikan reaksi
positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.
• Prosedur uji biuret : Sampel sebanyak 1 gram dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah 5
mL etanol kemudian diaduk menggunakan vortex. Setelah itu, ditambah 1 mL NaOH 40% dan diaduk
kembali. Campuran tersebut ditambah 2 tetes CuSO4 0,5% dan kocok. Amati perubahan yang
terjadi.
• Dalam uji biuret ini, sampel harus dalam suasana basa agar polipeptida sampel dapat bereaksi dengan
Cu2+ dari biuret. Uji ini sendiri didasarkan pada reaksi pembentukan kompleks Cu2+ yang dihasilkan
oleh CuSO4, dengan gugus –CO dan –Na pada ikatan peptida dalam larutan bersuasana basa dan
menghasilkan senyawa kompleks berwarna biru hingga ungu. Setelah direaksikan dengan sampel,
warna yang terbentuk mudah pudar, hal ini dikarenakan ion Cu2+ mengikat 2 ikatan peptida dan jika
lama dibiarkan ikatan tersebut semakin lemah (tidak stabil) sehingga itu yang menyebabkan warnanya
jika dibiarkan lama akan memudar
 3. Reaksi Millon

• Uji millon terdiri dari larutan sampel 2% dalam aquadest. Ambil 1 ml sampel tambahkan 5 tetes
larutan Hg(NO3)2 0,1 N, kemudian panaskan sampai mendidih. Reaksi positif terbentuknya endapan
merah.
• Adanya warna merah ini disebabkan oleh oksidasi asam nitrat pada asam amino yang mempunyai
gugus OH seperti tirosin.
Analisa
Kuantitatif
 Metode Kjeldahl
• Metode ini merupakan metode sederhana untuk penetapan nitrogen total pada
asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen.
• Metode kjeldahl cocok untuk menetapkan kadar protein yang tidak terlarut atau
protein yang sudah mengalami koagulasi akibat proses pemanasanmaupun
proses pengolahan lain yang biasa dilakukan pada makanan.
• Metode ini cocok digunakan secara mikro, sebab hanya memerlukan jumlah
sampel dan pereaksi yang sedikit serta waktu analisis yang pendek.
• Sampel di destruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang
sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah ditambah alkali
kuat, amonia terbentuk di destilasi uap secara kuantitatif ke dalam larutan
penyerap dan selanjutnya ditetapkan secara titrasi.
 Metode Kjeldahl
• Prinsip metode kjeldahl: Bahan destruksi dengan H2SO4 sehingga Nitrogen dengan H2SO4 akan
membentuk (NH4)2SO4. Amonium sulfat dalam proses destilasi akan melepaskan NH3 yang akan
ditampung dan diikat oleh larutan asam borat menjadi ammonium borat. Ammonium berat dititrasi dengan
standar asam.
• Secara umum pada metode kjeldahl terdapat 3 tahap yaitu tahap destruksi, destilasi dan titrasi.
• Bahan/Reagen yang digunakan:
a. H2SO4 pekat
b. Hg O
c. K2 SO4
d. NaOH – Na thiosulfat; larutkan 30 gr Na0H dan 5 gr Na2S203 5H2O dalam 100 H2O atau 5 ml
Na2S203 25% dalam 100 ml NaOH 50%
e. Asam borat jenuh.
f. Indikator : Methyl red – methylene mixture; campur 2 bagian 0,2% MR dan 1 bagian methylene blue.
g. HC1 0,02 N
 Tahap Destruksi
Prinsip
❑ Protein dan berbagai komponen lain yang ada dalam bahan pangan didestruksi atau
dipecah dengan bantuan asam sulfat dan katalis untuk menghasilkan Nitrogen bebas
❑ Dengan penambahan potassium permanganat akan terbentuk reaksi oksidasi yang
sempurna
❑ Pada tahap ini semua total Nitrogen bebas akan tertangkap dan terkonversi
membentuk Amonium Sulfat
 Tahap Destilasi
❑ Merupakan tahap netralisasi
❑ Produk hasil destruksi (tahap 1) kemudian dibasakan
dengan penambahan larutan basa, dalam hal ini NaOH

❑ Pada tahap ini terjadi perubahan amonium sulfat

menjadi gas amonium yang kemudian ditangkap oleh
asam borat berlebih (4%), membentuk ion amoniumdan
ion borat
 Tahap Titrasi
• Ion amonium borat yang tidak stabil kemudian dititrasi dengan menggunakan larutan asam
hidroklorida (HCl) standar

• Banyaknya ion amonium borat yang berikatan dengan asam diasumsikan sebagai
kandungan N pada bahan makanan
• Kadar ion hidrogen (dalam mol) yang dibutuhkan untuk mencapai titik akhir titrasi setara
dengan kadar nitrogen dalam sampel makanan
• Persamaan berikut dapat digunakan untuk menentukan kadar nitrogen dalam mg sampel
menggunakan larutan HCl dengan normalitas tertentu untuk titrasi.
 Prosedur Metode Kjeldahl
1. Timbang kurang lebih 50 mg bahan kering, masukkan ke dalam labu Kjaldahl (kira-kira
membutuhkan titrasi 3-10 ml HC1 0,02 N).
2. Timbang 40 mg + 10 mg Hg O dan pipet 2,0 ml H2SO4 pekat. Masukkan ke dalam labu
Kjeldahl.
3. Destruksi sampai tidak terdapat partikel karbon (jernih).
4. Encerkan campuran hasil destruksi dengan + 2 ml H2O, dinginkan.
5. Olesi dinding labu dengan vaselin, masukkan cairan destroat ke dalam alat destilasi.
6. Bilas labu Kjeldahl tersebut dengan 3 x, 5 ml H2O, masukkan semua kedalam destilator. (Tiap
kali penambahan H2O larutan dimasukkan ke dalam destilator).
7. Isi erlenmayer 125 m dengan 5 ml asam borat 4% tambahkan 2-3 tetes indikator
mixture. Rendam ujung alat destilas ke dalam larutan asam borat.
8. Masukkan 8-10 ml larutan Na0H – thiosulfat ke dalam destilator, tutup dan panaskan alas
pemanas destilator. Perhatian : pada saat destilasi air dalam pendingin balik harus mengalir.
9. Destilasi destroat sampai didapat destilat ± 15 ml.
10. Tambahkan destilat dengan HC1 0,02 N sampai warna abu-abu atau pertama kali timbul warna
violet.
11. Buatlah blanko.
 Perhitungan

x N NaOHx 14,008 x 100% x fk

• Kadar protein = kadar N x 1

• f adalah = faktor konfersi N menjadi protein.
• Catatan :
• Nilai f bervariasi tergantung jenis bahan makanan, misalnya :
Bahan Faktor Konversi
Beras 5,95
Susu 6,38
Kacang Tanah 5,46
Kedele 5,75
Kenari 5,18
Bir, sirup, biji-bijian, makanan ternak, buah-buahan, the,
anggur 6,25
Roti, gandum, makaroni, bakmi 5,7
Susu Kental Manis 6,38
 Titrasi Formol

• Pada titrasi formol menggunakan formaldehid, untuk menutup gugus amin dan membentuk metilol.
• Metode ini digunakan untuk penetapan kadar protein dalam susu secara cepat. Oleh karena protein
mempunyai gugus karbosilat dan gugus amina maka protein bersifat netral. Bila gugus NH2
dinonaktifkan oleh formaldehid maka menjadi bentuk dimetilol, gugus karboksilat akan bereaksi sebagai
asam yang selanjutnya dapat dititrasi secara alkalimetri dengan larutan baku NaOH. Reaksi yang terjadi
pada penetapan protein secara titrasi formal adalah sbb:
 Prosedur Titrasi Formol

1. Langkah awal yaitu menimbang sebanyak 10 gram sampel yang telah dihaluskan dengan cawan
porselen dan dilarutkan dalam 100 ml aquades dan distirer selama 15 menit kemudian disaring.
2. Filtrat diencerkan dengan aquades dalam labu ukur 100 ml hingga batas tera, kemudian diambil 10
ml larutan sampel ditambahkan 20 ml aquades , 0,4 ml Kalium oksalat dan 1 ml indikator, dan
dititrasi dengan NaOH 0,1 N hingga berwarna merah muda.
3. Sampel yang sudah dititrasi ditambahkan 2 ml Formaldehida 40 % dan ditambahkan indikator PP kemudian
dititrasi kembali dengan NaOH 0,1 N dan catat volume NaOH. Volume titrasi dicatat dan disebut sebagai
volume titrasi sampel.
4. Dilakukan juga titrasi blanko yang terdiri atas 20 ml aquades; 0,4 ml larutan kalium oksalat jenuh; 1 ml
indikator fenolftalein 1%; dan 2 ml larutan formaldehid 40% lalu dititrasi dengan larutan baku NaOH. Titrasi
ini disebut sebagai titrasi blanko.
5. Titran formol merupakan volume titrasi sampel dikurangi dengan volume titrasi blanko.
Perhitungan
 Metode Gasometri

• Metode Gasometri dari Van Slyke lebih selektif daripada metode kjeldahl karena metode ini digunakan untuk
amin alifatik primer.
• Analisis Gasometri, ialah analisis kimia kuantitatif dengan mengukur volume gas yang dibebaskan dan/atau
pengurangan volume campuran gas bila dipakai pereaksi yang sesuai untuk menghilangkan salah satu gas
yang ada.
• Metode ini didasarkan pada reaksi antara amin alifatik primer dengan asam nitrit menghasilkan gas N2.
• Gugus alfa amino primer dari asam amino bereaksi dengan asam nitrit menghasilkan gas nitrogen.
• Asam nitrit ini dibuat dengan mereaksikan natrium nitrit dengan asam asetat.
• Gas nitrogrn yang terjadi dimurnikan dengan mengalirkannya pada kalium permanganat, lalu dikumpulkan
dan diukur volumenya.
• Gas nitrogen yang terbentuk sesuai dengan jumlah asam amino yang ada.
 Metode Spektrofotometri
• Metode ini hanya dapat digunakan untuk protein terlarut.
• Pada penetapan kadar protein secara spektrofotometri, digunakan bovin serum albumin
(BSA) sebagai pembanding.
• Metode pengukuran protein dengan cara spektrofotometri bisa meggunakan reaksi biuret,
metode follin-ciocalteau, metode lowry.
 Metode Follin Ciocalteau
• Prinsip metode Folin-Ciocalteu adalah reaksi oksidasi dan reduksi kolorimetrik untuk mengukur semua
senyawa fenolik dalam sampel uji.
• Pereaksi Folin-Ciocalteu merupakan larutan kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam
fosfomolibdat dan asam heteropolifosfotungstat.
• Pereaksi ini terbuat dari air, natrium tungstat, natrium molibdat, asam fosfat, asam klorida, litium
sulfat, dan bromin.
• Prinsip metode Folin-Ciocalteu adalah oksidasi gugus fenolik hidroksil.
• Pereaksi ini mengoksidasi fenolat (garam alkali), mereduksi asam heteropoli menjadi suatu kompleks
molibdenum-tungsten (Mo-W).
• Fenolat hanya terdapat pada larutan basa, tetapi pereaksi Folin-Ciocalteu dan produknya tidak stabil
pada kondisi basa.
• Gugus fenolik-hidroksil bereaksi dengan pereaksi Folin-Ciocalteu, membentuk kompleks
fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru dengan struktur yang belum diketahui dan dapat dideteksi
dengan spektrofotometer.
• Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat setara dengan konsentrasi ion fenolat yang terbentuk,
artinya semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang akan
mereduksi asam heteropoli sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat
 Metode Lowry
Prinsip dasar
• Menggabungkan metode biuret (mereaksikan ion Cu dengan ikatan peptida) dengan reagen
Folin-Ciacalteu yang kemudian bereaksi dengan residu tyrosin dan tryptofan yang terkandung
dalam protein produk pangan membentuk warna biru.
• Metode Lowry tidak umum digunkan dalam analisa protein pada produk pangan, tetapi digunkana
pada reaksi biokimia protein (protein yang telah dipurifikasi/ isolasi)
 Metode Lowry
Keunggulan
• Sangat sensitif (50-100 kali lebih sensitif dibanding biuret)
• Tidak terpengaruh adanya kekeruhan sampel
• Sangat spesifik
• Sederhana dan cepat (1-1,5 jam)
Kelemahan
• Variasi warna yang lebih beragam dibanding biuret pada protein yang berbeda
• Intensitas warna tidak selalu sebanding dengan kadar protein
• Reaksi dapat dipengaruhi oleh sukrosa, lemak, monosakarida, buffer fosfat, amonium sulfat, komponen
sulfihidril.
 Metode Spektrofluorometri

• Asam amino tirosin dan triptofan dapat berfluoresensi dengan panjang

gelombang eksitasi 280 nm dan panjang gelombang emisi 348 nm.
• Keuntungan metode ini adalah lebih sensitif dibanding metode spektrofotometer
UV karena pada metode ini kadar yang kecil mampu memberikan respon
absorbsi lebih tajam, selain itu metode ini lebih selektif karena tidak semua
senyawa bisa berfluoresensi.
 Metode Turbidimetri

• Protein dapat diendapkan dengan pereaksi ttt sehingga timbul kekeruhan.

• Untuk bisa dianalisis menggunakan metode ini, protein harus dalam bentuk larutan.
• Protein harus diendapkan terlebih dahulu dengan ditambah pengendap protein seperti: asam
trikloroasetat (CCI3COOH), kalium feri sianida (K3Fe(CN6), asam sulfosalisilat atau pereaksi
Nessler (K2HgI4 yang bila bereaksi dengan protein akan membentuk OHgHgNH2I yang keruh dan
berwarna coklat)
• Kurva baku dibuat dengan menghubungkan antara kekeruhan dengan kadar protein. Kekeruhan
sampel dibandingkan dengan kurva beku.
• Makin keruh sampel berarti makin tinggi kadar protein.
Metode Pengikatan Zat Warna (dye binding method)
• Prinsip dasar
• Perubahan warna yang terjadi pada Cromassine Brillian Blue yang membentuk kompleks dengan protein
dari warna kemerahan (reddish) menjadi kebiruan (bluish) yang kemudian dibaca pada panjang
gelombang 465 –595 nm
• Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi protein pada produk pangan
• Biasanya digunakan untuk mengukur konsentrasi dalam jumlah kecil dari proses purifikasi enzym.
 Metode Kromatografi

• Asam-asam amino yang menyusun suatu protein dapat ditetapkan kadarnya

dengan kromatografi, baik dengan menggunakan KLT-densinometri (bersifat
semi kuantitatif) ataupun dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan
dengan kromatografi gas.
• Sebelum asam amino dianalisis, protein harus terlebih dahulu dihidrolisis
sehingga menghasilkan asam amino bebas.
• Masalah yang harus diperhatikan adalah rusaknya asam amino selama
hidrolisis, oleh karena itu selama hidrolisis harus dilakukan secara hati-hati
sehingga asam aminonya tidak rusak.
THANK YOU