Analisis Antioksidan

Secara In Vitro

Tegar Prasetya Budi

1800023047
1. DPPH Scavenging Activity
a. Prinsip :
Molekul 1, 1-difenil-2-pikrilhidrazil (A A-difenil-b- pikrilhidrazil; DPPH) merupakan radikal bebas yang stabil
berdasarkan delokalisasi elektron cadangan di atas molekul secara keseluruhan, sehingga molekul tidak
mengalami dimerisasi, seperti yang terjadi pada kebanyakan radikal bebas lainnya. Delokalisasi elektron juga
menimbulkan warna ungu tua, ditandai dengan pita serapan dalam larutan etanol yang berpusat pada sekitar
517 nm. Ketika larutan DPPH dicampur dengan substrat (AH) yang dapat menyumbangkan atom hidrogen,
maka menimbulkan bentuk tereduksi dengan hilangnya warna ungu ini. Untuk mengevaluasi potensi
antioksidan melalui pembersihan radikal bebas oleh sampel uji, perubahan kepadatan optik radikal DPPH
dipantau.

b. Cara Kerja :
Ekstrak sampel (0,2 mL) diencerkan dengan metanol dan 2 mL larutan DPPH (0,5 mM) ditambahkan. Setelah
30 menit, absorbansi diukur pada 517 nm.

c. Analisis :
Persentase penangkal radikal DPPH dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut:

Dimana, Abr adalah absorbansi sebelum reaksi dan Aar adalah absorbansi setelah reaksi berlangsung.
●
2. Metode Antioksidan Pereduksi Besi (FRAP)
a. Prinsip
Metode ini mengukur kemampuan antioksidan untuk mereduksi besi-
besi. Hal ini berdasar pada reduksi kompleks besi-besi dan 2,3,5-
trifenil-1,3,4-triaza-2-azoniacyclopenta-1,4-diena klorida (TPTZ)
menjadi bentuk besi pada pH rendah.
b. Cara Kerja
Dipantau dengan mengukur perubahan penyerapan pada 593 nm,
menggunakan spektrofotometer dioda-array. Tiga mililiter reagen
FRAP yang disiapkan dicampur dengan 100 lL sampel yang
diencerkan; absorbansi pada 593 nm dicatat setelah inkubasi 30
menit pada 37 C.
c. Analisis
Nilai FRAP dapat diperoleh dengan membandingkan perubahan
penyerapan dalam campuran uji dengan yang diperoleh dari
peningkatan konsentrasi Fe3+ dan dinyatakan sebagai mM setara
Fe2+ per kg (makanan padat) atau per L (minuman) sampel.
3. Metode Kapasitas Antioksidan setara Trolox (TEAC) / uji penghilangan warna
kation radikal ABTSTS
a. Prinsip :
Metode ini, menggunakan spektrofotometer dioda-array untuk mengukur hilangnya warna
ketika antioksidan ditambahkan ke ABTS kromofor biru-hijau. Antioksidan mengurangi ABTS+
untuk ABTS dan menghilangkan warna itu. ABTS+ adalah radikal stabil yang tidak ditemukan
dalam tubuh manusia.
b. Cara Kerja :
Kation radikal ABTS dibuat dengan menambahkan mangan dioksida padat (80 mg) ke dalam
larutan stok berair ABTS 5 mM (20 mL menggunakan buffer 75 mM Na/K pH 7). Trolox (asam
6- hidroksi-2,5,7,8tetrametilkroman-2-karboksilat), analog vitamin E yang larut dalam air, dapat
digunakan sebagai standar antioksidan. Kurva kalibrasi standar dibuat untuk Trolox pada 0, 50,
100, 150, 200, 250, 300, dan 350 konsentrasi M. Sampel diencerkan dengan tepat sesuai
dengan aktivitas antioksidan dalam pH buffer Na/K,Sampel yang diencerkan dicampur dengan
200akuL larutan kation radikal ABTS+ dalam pelat 96-sumur.
c. Analisis :
Absorbansi dibaca pada 750 nm setelah 5 menit dalam pembaca pelat mikro. Nilai TEAC
dapat dihitung dari kurva standar Trolox dan dinyatakan sebagai ekuivalen Trolox (dalam mM).
4. Metode Pengurangan Daya
a. Prinsip
Metode ini didasarkan pada prinsip peningkatan absorbansi campuran reaksi. Peningkatan absorbansi
menunjukkan peningkatan aktivitas antioksidan. Dalam metode ini, senyawa antioksidan membentuk
kompleks berwarna dengan kalium ferisianida, asam trikloro asetat dan besi klorida, yang diukur pada 700
nm. Peningkatan absorbansi campuran reaksi menunjukkan daya reduksi sampel (Jayaprakash et al., 2001).

b. Cara Kerja
Dalam metode yang dijelaskan oleh Oyaizu (1986) 2,5 mL buffer fosfat 0,2 M (pH 6,6) dan 2,5 mL K3Fe (CN)6
(1% b/v) ditambahkan ke 1,0 mL sampel yang dilarutkan dalam air suling. Campuran yang dihasilkan
diinkubasi pada suhu 50 C selama 20 menit, diikuti dengan penambahan 2,5 mL asam trikloro asetat (10%
b/v). Campuran disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit untuk mengumpulkan lapisan atas larutan
(2,5 mL), dicampur dengan air suling (2,5 mL) dan 0,5 mL FeCl3 (0,1%, b/v).

c.Analisis
Absorbansi kemudian diukur pada 700 nm, dibandingkan terhadap sampel kosong.
5. Metode Fosfomolibdenum
a. Prinsip
Pengujian didasarkan pada reduksi Mo (VI) menjadi Mo (V) oleh sampel analit dan pembentukan kompleks
fosfat hijau Mo (V) selanjutnya pada pH asam

b. Cara Kerja
Kapasitas antioksidan total dapat dihitung dengan metode yang dijelaskan oleh Prieto et al. (1999). 0,1 mL
larutan sampel (100 lg) digabungkan dengan 1 mL reagen (asam sulfat 0,6 M, natrium 28 mM fosfat dan 4 mM
amonium molibdat). Tabung ditutup dan diinkubasi dalam penangas air mendidih pada suhu 95 C selama 90
menit. Setelah sampel didinginkan hingga suhu kamar, absorbansi larutan berair diukur pada 695 nm terhadap
blanko dalam spektrofotometer UV. Larutan blanko tipikal mengandung 1 mL larutan reagen dan volume yang
sesuai dari pelarut yang sama yang digunakan untuk sampel dan diinkubasi dalam kondisi yang sama seperti
sampel lainnya.

c. Analisis

Uji kapasitas antioksidan total adalah metode spektroskopi untuk penentuan kuantitatif kapasitas antioksidan,
melalui pembentukan kompleks fosfomolibdenum. Untuk sampel dengan komposisi yang tidak diketahui,
kapasitas antioksidan dapat dinyatakan sebagai ekuivalen a-tokoferol.
6. Metode DMPD (N,N-dimetil-p-fenilen diamina dihidroklorida)
a. Prinsip :
Metode penghilangan warna kation radikal DMPD telah dikembangkan untuk pengukuran
aktivitas antioksidan dalam sampel makanan dan biologi. Pengujian ini didasarkan pada
reduksi larutan buffer DMPD berwarna dalam buffer asetat dan besi klorida. Prosedur ini
melibatkan pengukuran penurunan absorbansi DMPD dengan adanya scavenger pada
serapannya maksimum 505 nm. Aktivitas tersebut dinyatakan sebagai persentase
pengurangan DMPD. Fogliano dkk. (1999)
b. Cara Kerja :
Campurkan 1 mL larutan DMPD (200 mM), 0,4 mL besi klorida (III) (0,05 M), dan 100 mL
larutan buffer natrium asetat pada 0,1 M, mengubah pH menjadi 5,25. Campuran reaktif harus
disimpan dalam kegelapan, di bawah pendingin, dan pada suhu rendah (4–5 C). Reaksi
berlangsung ketika 50 akuL sampel (pengenceran 1:10 dalam air) ditambahkan ke 950 akuL
dari DMPD + larutan.
c. Analisis :
Absorbansi diukur setelah 10 menit pengadukan terus menerus untuk mencapai nilai
penghilangan warna yang konstan.Hasilnya dikuantifikasi dalam mM Trolox pada kurva
kalibrasi yang relevan.
 Terimaksih

CREDITS: This presentation template was created by Slidesgo, including icons

by Flaticon, infographics & images by Freepik and illustrations by Stories