Praktikum XI

ANALISIS TOTAL TOKOFEROL

Tujuan Praktikum
Memahami prinsip analisis total tokoferol dengan metode spektrofotometri

Teori
Tokoferol merupakan sumber vitamin E yang sangat aktif terhadap oksidasi. Terdapat
empat jenis tokoferol, yaitu -, -, -, dan -tokoferol (Gambar 1). Tokoferol juga dapat
berperan sebagai antioksidan alami. Tokoferol tahan terhadap suhu tinggi dan asam, namun
mudah teroksidasi dengan adanya lemak tengik, timah dan garam besi, serta mudah rusak
oleh sinar UV.tokoferol banyak terdapat pada minyak nabati, hati, kuning telur, salad
dressings, mayonnaise, margarin, kacang-kacangan, dan biji-bijian.
Tokoferol dapat dianalisis sebagai total tokoferol. Salah satu metode analisis total
tokoferol dalam lemak/minyak adalah dengan metode spektrofotometri berdasarkan pronsip
oksidasi reduksi. Pada metode ini, minyak akan direaksikan dengan FeCl3.6H2O dan 2,2-
bipiridin yang akan membentuk warna merah. Intensitas warna yang terbentuk selanjutnya
diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520nm. Konsentrasi total tokoferol
dapat ditentukan dengan menggunakan kurva standar.

Gambar 1. Struktur molekul tokoferol

Metodologi
Alat
- UV-Vis sepktrofotometer - Labu takar
- Neraca analitik - pipet volumetrik

Bahan
- Minyak sawit, minyak zaitun, minyak jagung, minyak kelapa
- Pelarut toluen
- Larutan FeCl3.6H2O 0,2% (b/v) dalam etanol 95%
- Larutan 2,2-bipiridin 0,7% (b/v) dalam etanol 95%
- Larutan standar tokoferol
Cara Kerja
Pembuatan kurva standar tokoferol
- Larutan 50 mg standar tokoferol ke hingga tepat 50ml dengan toluene pada labu ukur.
Pipet 2 ml larutan tersebut ke dalam labu ukur 50 ml, lalu tepatkan dengan toluene
hingga tanda tera. Konsentrasi larutan standar tokoferol ini adalah 40 g/ml.
- Pipet 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, dan 4.0 ml larutan tokoferol standar 40 g/ml ke dalam labu
takar 10ml.
- Tambahkan 3.5ml larutan 2,2-bipiridin 0,7% dan 0.5ml larutan FeCl3.6H2O 0,2%
(b/v) ke dalam masing-masing labu takar. Tepatkan dengan etanol 95% sampai
volume total 10ml. goyangkan hingga homogen.
- Ukur absorbansi masing-masing konsentrasi dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 520nm.
- Plot kurva standar dan tentukan persamaan regresi liniernya.

Analisis larutan sampel

- Timbang sebanyak 20010 mg contoh, masukkan ke dalam labu ukur 10 ml,
tambahkan 5ml toluene untuk melarutkan contoh
- Tambahkan 3.5ml larutan 2,2-bipiridin 0,7% dan 0.5ml larutan FeCl3.6H2O 0,2%
(b/v) ke dalam masing-masing labu takar. Tepatkan dengan etanol 95% sampai
volume total 10ml. goyangkan hingga homogen.
- Setelah didiamkan selama 1 menit dalam ruang gelap, ukur absorbansinya dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 520nm.
- Buat larutan blanko (prosedur sama seperti di atas tetapi tanpa sampel), ukur ukur
absorbansinya pada panjang gelombang yang sama.

Analisis Data
Tentukan kadar tokoferol pada sampel dengan menggunkan kurva standar tokoferol. Total
tokoferol dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:

[C]
Total tokoferol (g/g) =
W

Dimana [C] = konsentrasi tokoferol dari kurva standar (g)

W = berat sampel (g)

Daftar Pustaka
Nielsen SS. (ed). 2017. Food Analysis. 5th ed. Springer.
Nielsen SS. (ed). 2017. Food Analysis Laboratory Manual. 3th ed. Springer.

Pertanyaan untuk Diskusi

- Apakah fungsi penambahan larutan FeCl3.6H2O 0,2%?
- Apakah fungsi penambahan larutan 2,2-bipiridin 0,7%?
 Praktikum XII
PENGUJIAN KESADAHAN AIR

Tujuan Praktikum
- Memahami prinsip titrasi kompleksometri
- Menentukan kesadahan total pada sampel air

Teori
Air dengan konsentrasi mineral Kalsium (Ca) dan Magnesium (Mg) yang tinggi
disebut dengan air sadah. Gejala kesadahan air yang tinggi dapat diamati dari sabun yang
sulit berbusa. Air dengan tingkat kesadahan tinggi akan mengganggu daya kerja sabun, hal
ini dikarenakan salah satu bagian sabun akan diikat oleh unsur Ca atau Mg membentuk
endapan dan mencegah terjadinya busa dalam air. Selain itu, masalah lain yang ditimbulkan
oleh air dengan tingkat kesadahan yang tinggi adalah terdapat kerak di sekitar wadah
pemanas air, mengakibatkan penghantaran panas menjadi berkurang. Hal ini dikarenakan
tersumbatnya katup-katup pada wadah pemanas sehingga membutuhkan waktu yang lama
dalam proses pemanasan dan penggunaan bahan bakar yang berlebih.
Unsur Ca dan Mg di dalam air dapat dihilangkan atau dikurangi kandungannya
dengan beberapa proses, seperti pemanasan, pengendapan dan pertukaran ion tergantung dari
jenis kesadahan yang terdapat di dalam air tersebut. Terdapat dua jenis kesadahan air, yakni
kesadahan sementara dan kesadahan tetap. Kesadahan sementara disebabkan oleh ion Ca 2+
dan Mg2+ yang berikatan dengan ion karbonat (CO32-) dan bikarbonat (HCO3-), yang mana
dapat dihilangkan melalui proses pemanasan. Adanya proses pemanasan dapat menyebabkan
senyawa-senyawa bikarbonat akan terurai menjadi karbon dioksida (CO 2) dan air (H2O)
sehingga air tersebut terbebas dari ion Ca2+ dan Mg2+, dan biasanya senyawa-senyawa
bikarbonat tersebut akan mengendap pada dasar wadah pemanas air. Adapun kesadahan tetap
disebabkan oleh ion Ca2+ dan Mg2+ yang berikatan dengan ion sulfat (SO 42-) dan klorida (Cl-).
Kesadahan tetap tidak dapat dihilangkan dengan pemanasan, melainkan dengan proses
pertukaran ion.
Hal ini menyebabkan perlu dilakukannya penentuan kesadahan air untuk memastikan
kualitas air yang berkaitan dengan kandungan mineral (khususnya kalsium dan magnesium)
dalam air tersebut. Oleh karena itu, pada percobaan ini dilakukan penentuan kesadahan pada
sampel air keran menggunakan metode kompleksometri EDTA (Ethylene Diamine
Tetraacetic Acid). Metode titrasi kompleksometri EDTA didasarkan pada reaksi zat-zat
kompleks organik, yaitu EDTA dengan ion-ion logam bervalensi dua dan tiga, sehingga
menyebabkan pembentukan kompleks berwarna. Metode ini menggunakan indikator,
umumnya indikator calmagite atau eriochrome black T, yang akan mempermudah penentuan
titik akhir titrasi dengan adanya perubahan warna larutan.

Metodologi
Alat
- Erlenmeyer 250 ml - Buret
- Labu ukur 100, 250, 1000ml - Neraca analitik

Bahan
- Air keran - Air sumur
 - Akuades - Buffer ammonia-ammonim klorida
- Calmagite - Etilen Diamin Tetra Asetat (EDTA) 0,01 M.
- CaCO3

Cara Kerja
Pembuatan larutan baku CaCO3 0,01M
- Timbang 1 gram CaCO3 murni kering ke dalam gelas kimia 250 mL
- Larutkan CaCO3 dengan sedikit akuades dan 2-3 tetes HCl pekat
- Pindahkan ke dalam labu ukur 1000ml (jangan lupa membilas gelas kimia)
- Tambahkan akuades hingga tanda tera.

Pembuatan larutan EDTA 0,01M

- Timbang sebanyak 3,273 gram disodium EDTA
- Larutkan dengan sedikit akuades pada beaker glass, lalu pindahkan ke dalam labu
ukur 1000 ml (jangan lupa bilas beaker, lalu pindahkan kembali ke dalam labu ukur)
- Tambahkan akuades hingga tanda tera

Pembuatan buffer ammonia-ammonim klorida pH 10

- Larutkan 16,9 gram ammonium klorida ke dalam 143ml larutan ammonia
- Pindahkan ke dalam labu ukur 250 ml (jangan lupa bilas sisa larutan dalam beaker
glass), lalu tepatkan dengan akuades hingga tanda tera.
- Atur pH buffer menjadi 10. Gunakan larutan HCl (1:1) untuk mengatur pH.

Pembuatan larutan indikator Calmagite

- Timbang calmagite sebanyak 0,1 gram secara tepat pada kaca arloji
- Siapkan 50 ml akuades pada beaker glass, lalu masukkan calmagite ke dalamnya,
aduk hingga homogen menggunakan batang pengaduk
- Pindahkan campuran ke dalam labu ukur 100 ml, tepatkan hingga tanda tera dengan
akuades (jangan lupa membilas beaker glass dengan akuades)

Standardidasi Larutan EDTA

- Pipet 20 ml larutan baku CaCO3 ke dalam erlenmeyer.
- Tambahkan 5 ml larutan buffer
- Tambahkan calmagite sebanyak 1 ml
- Titrasi dengan larutan baku Dinatrium Etilen Diamin Tetra Asetat (EDTA)
- Titik akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari merah keunguan
menjadi biru. Sebelum warna biru terbentuk, akan terbentuk warna ungu terlebih
dahulu yang kemudian berubah menjadi warna biru.
- Selesaikan titrasi dalam waktu 5 menit setelah penambahan buffer.
- Catat jumlah EDTA yang dibutuhkan.

Penentuan Kesadahan Total

- Ambil sampel air sebanyak 50 mL lalu masukkan ke dalam labu erlenmeyer 250 mL
(Apabila kesadahan air diperkirakan tinggi, maka ambil 25ml sampel air dan
dilarutkan dengan 25 ml akuades)
- Tambahkan larutan buffer sebanyak 5 ml, lalu tambahkan indikator calmagite
sebanyak 1 ml.
 - Titrasi campuran sampel menggunakan larutan baku Dinatrium Etilen Diamin Tetra
Asetat (EDTA).
- Titik akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari merah keunguan
menjadi biru
- Catat jumlah EDTA yang dibutuhkan.

Analisis Data
1000
Kesadahan Total (mg CaCO3 /liter) = 𝑥 𝑉𝐸𝐷𝑇𝐴 𝑥 𝑀𝐸𝐷𝑇𝐴 𝑥 100
V

Keterangan:
V = Volume larutan sampel (mL)
V EDTA = Volume rata-rata larutan baku EDTA untuk titrasi (mL)
M EDTA = Molaritas larutan baku EDTA untuk titrasi (mmol/mL)

Daftar Pustaka
Nielsen SS. (ed). 2017. Food Analysis. 5th ed. Springer.
Nielsen SS. (ed). 2017. Food Analysis Laboratory Manual. 3th ed. Springer.

Pertanyaan untuk Diskusi

- Apa yang dimaksuda dengan kesadahan total?
- Bagaimana cara mengetahui kandungan kalsium dan magnesium masing-masing di
dalam sampel air sadah?
 Praktikum XIII
KROMATOGRAFI KOLOM

Tujuan Praktikum
- Memahami prinsip kromatografi kolom
- Identifikasi antosianin pada bayam merah

Teori
Kromatografi merupakan teknik yang dapat digunakan untuk melakukan pemisahan dan
identifikasi suatu komponen dari campurannya. Prinsip pemisahan komponen pada
kromatografi memanfaatkan interaksi antara sampel dengan fase gerak dan fase diam. Fase
diam (stationary phase) merupakan tempat terjadinya pemisahakan komponen, sedangkan
fase gerak (mobile phase) merupakan pelarut yang bertugas untuk membawa sampel. Apabila
suatu komponen dapat bergerak lebih cepat, maka dapat dikatakan memiliki afinitas (ikatan)
yang lebih kuat dengan pelarutnya. Sebaliknya, apabila suatu komponen bergerak lebih
lambat, maka memiliki afinitas (ikatan) yang lebih kuat dengan fase diamnya.
Kromatografi kolom adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan senyawa kimia
tunggal dari campuran terlarut dalam suatu cairan. Metode ini dapat disebut sebagai
kromatografi adsorpsi karena dapat memisahkan zat berdasarkan adsorpsi diferensial
senyawa ke dalam adsorben ketika senyawa bergerak melalui kolom dengan laju yang
berbeda, sehingga memungkinkan terjadinya pemisahan campuran ke dalam beberapa fraksi.
Komponen dengan adsorpsi dan afinitas yang lebih rendah terhadap fase diam akan bergerak
dan meninggalkan kolom lebih cepat bila dibandingkan dengan komponen yang memiliki
adsorpsi dan afinitas yang lebih besar dengan fase diam.
Alumina dan silika merupakan fase diam yang popular untuk kromatografi kolom.
Keduanya bersifat polar, sehingga akan menahan komponen polar lebih lama. Akibatnya,
komponen yang bersifat paling tidak polar akan terelusi paling cepat. Pada umumnya,
pemisahan akan diawali dengan menggunakan pelarut non polar atau dengan kepolaran
rendah guna membiarkan komponen polar teradsorbspsi terlebih dahulu pada fase diam, lalu
pelarut akan diganti dengan kepolaran yang lebih tinggi, untuk melepaskan komponen yang
teradsorpsi pada fase diam dan bisa terelusi bersama fase gerak. Ilustrasi pemisahan
komponen dengan kromatografi kolom dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Ilustrasi kromatografi kolom

Metodologi
Bahan
- Daun bayam merah - n-heksana
- Aseton - Metanol
- Silica gel 60 (0.063-0.200 nm) - Na2SO4 anhidrat
- Kapas - pasir silika
- Aluminium foil

Alat
- Statif dan klem - Kolom
- Corong - Vial
- Beaker glass - Pipet volumetrik
- Mortar - Corong pemisah
- Kertas saring - Pipet tetes

Cara Kerja
Pembuatan Ekstrak Daun Bayam
- Cuci beberapa lembar daun bayam merah lalu keringkan. Hilangkan bagian tulang
daun, lalu dipotong kecil-kecil.
- Timbang potongan daun seberat 2 gram, haluskan dengan haluskan dengan alu,
kemudian tambahkan dengan dengan 5 ml aseton
- Siapkan corong pemisah yang telah dilapisi kertas saring, basahi kertas saring dengan
sedikit aseton, lalu tambahkan Na2SO4 anhidrat di atasnya
- Saring ekstrak bayam merah, lalu simpan pada wadah tertutup

Pembuatan Fase Diam

- Pembuatan fase diam dilakukan dengan metode basah.
- Kolom yang digunakan harus kering dan bersih. Sebelumnya, dinding kolom secara
berturut-turut dibilas dengan etil asetat, aseton, methanol, dan n-heksana.
- Tutup ujung keran pada kolom, lalu isi dengan kapas dan dipadatkan. Tambahkan
sedikit eluen n-heksana, buka keran, lalu padatkan kembali kapas hingga aliran eluen
sekitar 3 tetes/detik.
- Tutup keran, lalu tambahkan sedikit pasir silika di atas kapas, lalu tambahkan lagi n-
heksana hinga kira-kira 1/3 tinggi kolom.
- Timbang 6,5 gram silica gel, kemudian dilarutkan dalam 30 ml n-heksana, aduk
hingga terbentuk suspensi
- Buka tutup keran, masukkan suspensi secara perlahan dan bertahap melalui dinding
kolom, pastikan tinggi n-heksana selalu di atas silika gel. Dinding kolom dapat
diketuk secara perlahan meggunakan gegep kayu agar rapat dan padat, serta
menghindari terbentuknya gelembung udara.
- Alirkan n-heksana yang berlebih higga tinggi n-heksana kurang lebih 1 cm di atas
silika, lalu tutup kembali keran. Kolom dibiarkan memadat selama semalam, tutup
ujung atas kolom dengan alumunium foil agar fase diam tidak mongering dan pecah.

Persiapan Eluen
- Siapkan lima jenis eluen atau fase gerak yang berurutan dari non polar ke polar,
sebagai berikut. Setelah eluen siap, tutup rapat untuk menghindari penguapan.
 1. n-heksana
2. n-heksana:aseton (7:3)
3. aseton
4. aseton:methanol (8:2)
5. metanol

Pemisahan Pigmen Ekstrak Daun Bayam Merah

- Sebelum ekstrak dimasukkan ke dalam kolom, Buka tutup keran hingga meniscus
bawah eluen sejajar dengan permukaan silika, lalu keran ditutup kembali.
- Masukkan sekitar 0,5ml ekstrak daun bayam merah menggunakan pipet tetes secara
perlahan di atas silika, hindari percikan ekstrak ke dinding kolom, lalu tambahkan 2
ml n-heksana.
- Buka kembali keran, lalu kolom dielusi sesuai urutan pelarut di atas.
- Tamping eluat ke dalam vial

Identifikasi Antosianin
- Ukur absorbansi masing-masing eluat menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 530 nm.
- Adanya serapan pada panjang gelombang tersebut menunjukkan keberadaan
antosianin pada eluat.
- Semakin tinggi absorbansi berkorelasi positif dengan kandungan antosianin pada
eluat.

Daftar Pustaka
Nielsen SS. (ed). 2017. Food Analysis. 5th ed. Springer.
Nielsen SS. (ed). 2017. Food Analysis Laboratory Manual. 3th ed. Springer.

Pertanyaan untuk Diskusi

- Bagaimanakah konfigurasi kromatografi kolom yang digunakan? Apakah normal
phase atau reverse phase?
- Bagaimanakah polaritas antosianin?