Laporan Praktikum Hari,Tanggal: Jumat, 24 April 2020

Biokimia Klinis Waktu : 08.00 - 11.00 WIB

PJP : dr. Husnawati, MSi.
Asisten : Elgiani Yassifa YN

ANALISIS LIPID PEROKSIDA

(UJI ANTIOKSIDAN IN VIVO)

Kelompok 23

Alifiya Nurzannah G84170022

Uswatun Khasanah G84170041
M Rizki Athari N G84170065

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MAT EMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2020
 PEMBAHASAN

Stres oksidatif dapat didefinisikan sebagai tres suatu keadaan saat terjadi
ketidakseimbangan antara oksidan dan antioksidan dengan kadar oksidan yang
lebih dominan. Oksidan ini merupakan senyawa reaktif yang dapat memindahkan
elektron dari molekul lain dan menghasilkan oksidasi pada molekul tersebut
(Anggraeni et al. 2017). Zaetun et al. (2018) mengatakan bahwa stres oksidatif
berpotensi menimbulkan kerusakan hati dengan memengaruhi peningkatan
peroksidasi lipid yang akan mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid
(MDA). MDA ini termasuk senyawa dialdehida atau berkarbon tiga yang reaktif
sebagai produk final peroksidasi lipid di dalam membran sel yang biasanya
digunakan sebagai biomarker biologis peroksidasi lipid dan menggambarkan
derajat stres oksidatif. MDA pada material hayati terdapat dalam bentuk bebas
atau membentuk ikatan kompleks dengan unsur lainnya di dalam jaringan (Sutari
et al. 2013).
Beberapa faktor yang dapat menyebabkan kondisi stres oksidatif
diantaranya seperti puasa, olah raga, stres psikis, dan inflamasi. Kondisi stres
oksidatif yang meningkatkan produksi radikal bebas di dalam tubuh akan
menurunkan enzim-enzim antioksidan intrasel dan menyebabkan kerusakan sel.
Oleh karena itu, asupan antioksidan eksogen sangat diperlukan untuk membantu
kerja enzim antioksidan intrasel dalam mencegah kerusakan sel (Suarsana et al.
2013).
Menurut Jamilah et al. (2011), kulit buah naga merah (Hylocereus
polyhizus) mengandung beta karoten dan betasianin yang memiliki aktivitas
antioksidan. Ekstrak metanol kulit H. polyhizus juga memiliki aktivitas
antioksidan yang lebih tinggi dari ekstrak metanol kulit H. undatus dan ekstrak
metanol daging H. polyhizus yang diuji menggunakan metode DPPH dan radical
scavenging activity. Pengujian aktivitas antioksidan tersebut baru dilakukan secara
in vitro, oleh karena itu Wahdaningsih dan Utari (2016), melakukan penelitian
mengenai aktivitas antioksidan secara in vivo melalui pengukuran kadar MDA
pada tikus wistar jantan yang mengalami stres oksidatif setelah diberi fraksi
metanol kulit H. polyhizus.
Pengukuran kadar MDA dilakukan pada 28 tikus yang dibagi ke dalam 7
kelompok secara acak. Hewan coba diadaptasikan terhadap lingkungan kandang
percobaan selama 5 hari, dengan memberikan perlakuan stres oksidatif berupa
puasa pakan tetapi diberi air minum ad libitum serta perenangan selama 10
menit/hari. Pemberian vitamin E, kuersetin, dan fraksi metanol H. polyhizus
dilakukan secara oral. Pembagian perlakuan pada kelompok hewan uji dilihat
pada tabel 1.

Tabel 1 Pembagian kelompok hewan uji

Kelompok Hewan Uji
Normal
Kontrol negatif
Kontrol positif vitamin E
Kontrol positif kuersitin
Perlakuan Hewan Uji
Tanpa perlakuan
Puasa dan perenangan
Puasa dan perenangan + vitamin E 18
mg/ kg BB
Puasa dan perenangan + kuersitin 4 mg/
200 g BB
 Lanjutan Tabel 1 Pembagian kelompok hewan uji
Dosis I Puasa dan perenangan + fraksi metanol
5 mg/ 200 g BB
Dosis II Puasa dan perenangan + fraksi metanol
10 mg/ 200 g BB
Dosis III Puasa dan perenangan + fraksi metanol
20 mg/ 200 g BB

Tikus yang telah diberi perlakuan selama 5 hari diterminasi dengan cara
cervical dislocatio yang dilakukan dengan steril dan cepat. Organ hati kemudian
diambil dan dilakukan pencucian dengan buffer fosfat salin (PBS), kemudian
dtimbang beratnya. Sebanyak 1.25 g hati dicacah dalam kondisi dingin di larutan
PBS yang mengandung 11.5 g/L KCl dan disentrifus pada 4000 rpm selama 10
menit untuk memperoleh supernatan sebagai homogenat yang akan dianalisis
kadar MDA. Penggunaan KCl dalam proses pembuatan homogenat bertujuan
untuk memfasilitasi pelepasan molekul yang terkait dengan membran sehingga
memudahkan proses analisis (Mishra dan Mishra 2015).
Analisis kadar malondialdehid dilakukan menggunakan metode TBA-
MDA. Menurut Sutari et al. (2013), prinsip metode TBA-MDA berdasarkan
kepada kemampuan pembentukan komplek berwarna merah jambu antara MDA
dan asam tiobarbiturat (TBA). Reaksi pembentukan kompleks TBA-MDA
ditunjukankan pada gambar 1.

Gambar 1 Reaksi pembentukan kompleks MDA-TBA ( Nawar 1985 dalam

Wahdaningsih dan Utari 2016)

Metode ini dilakukan dengan penambahan 2.0 ml HCL 0.25 N dingin

yang mengandung 15% TCA, 0,38% TBA dan 0,5% BHT ke dalam homogenat
hati. Menurut Lina (2008), penampahan TCA berfungsi untuk memberikan
suasana asam sehingga mengkatalisis reaksi pembentukan kompleks MDA-TBA,
sedangkan BHT sebagai stabilisator radikal bebas. Campuran TCA, TBA, dan
BHT dipanaskan pada suhu 80°C selama 1 jam. Pemanasan dilakukan agar
pembentukan kompleks berwarna merah muda lebih cepat terbentuk (Lina 2008).
Campuran tersebut selanjutnya disentrifus pada 3500 rpm selama 10 menit, dan
supernatan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada λ 532 nm.
Standar yang digunakan dalam penelitian Wahdaningsih dan Utari (2016)
untuk perhitungan kadar MDA adalah tetrametoksipropana (TMP). Standar TMP
dalam keadaan asam dapat terhidrolisis menghasilkan hemiasetal dan metanol,
hemiasetal ini akan terdekomposisi menjadi metanol dan aldehid yang dapat
bereaksi dengan TBA. Persamaan regresi linier yang dihasilkan dari perhitungan
kurva standar yaitu y = 8.17993x – 0.09969, dengan nilai r = 0.99268. Grafik
hubungan antara absorbansi dan konsentrasi kurva standar TMP terdapat pada
gambar 2.
 Gambar 2 Grafik konsentrasi dan absorbansi kurva standar TMP

Uji linearitas dapat ditentukan melalui persamaan regresi linear y = ax ± b

darn nilai r dari 9 kali pengulangan pengukuran absorbansi kurva standar.
Korelasi dinyatakan sangat kuat jika nilai r yang diperoleh di atas 0.9 tetapi
kurang dari 1.0 sesuai dengan kriteria (Padmaningrum dan Marwati 2015). Hal
tersebut membuktikan bahwa linearitas dari kurva standar TMP dengan r =
0.99268 dapat dinyatakan sangat kuat.
Perbedaan kadar MDA rata-rata antar kelompok dari penelitian
Wahdaningsih dan Utari (2016) tercantum dalam diagram yang disajikan pada
gambar 3. Hasil pengujian statistik dilakukan dengan ANOVA yang dilanjutkan
dengan uji LSD. Hasil uji LSD menunjukkan bahwa kelompok negatif memiliki
kadar MDA yang berbeda signifikan jika dibandingkan dengan semua kelompok
dengan nilai p<0.05. Kadar rata-rata MDA pada kelompok kontrol negatif yaitu
0.051 µg/ml, terjadi perbedaan yang signifikan jika dibandingkan dengan
kelompok normal yang mempunyai kadar rata-rata MDA sebesar 0.042 µg/ml.
Data tersebut membuktikan bahwa perenangan selama 10 menit dan puasa dapat
menyebabkan stres oksidatif dengan meningkatnya kadar MDA melebihi normal.
Hal ini sesuai dengan penelitian Suarsana et al. (2013) yang menyatakan bahwa
perenangan dan puasa menyebabkan kadar MDA pada kelompok negatif lebih
tinggi dari kelompok normal.

Gambar 3 Histogram rata-rata kadar malondialdehid tiap kelompok perlakuan,

tanda (*) menunjukan adanya perbedaan signifikan antar kelompok
negatif dan kelompok lain
 Hasil analisis data dari kelompok kontrol positif vitamin E menunjukkan
kadar MDA yang berbeda signifikan jika dibandingkan kelompok negatif yaitu
nilai p<0.05. Kadar rata-rata MDA pada kelompok kontrol vitamin E adalah 0.034
µg/ml. Hal ini membuktikan bahwa vitamin E dapat menurunkan kadar MDA di
hati. Menurut Vera et al. (2018), vitamin E mampu menekan MDA diperkirakan
terjadi melalui efek antioksidan primer sebagai scavenger radikal bebas dan
memutus reaksi berantai dengan radikal peroksil dengan menyumbangkan satu
atom dan bekerja dengan enzim SOD, sehingga mampu memperlambat dan
mencegah berlangsungnya reaksi peroksidasi lipid yang akhirnya akan menekan
produk MDA. Selain itu, vitamin E mempunyai afinitas terhadap pemutusan
reaksi rantai radikal dengan cara memindahkan hidrogen fenolat kepada radikal
peroksil dari asam lemak tak jenuh ganda yang telah mengalami peroksidasi,
kemudian radikal fenoksi bereaksi dengan radikal bebas peroksil selanjutnya.
Kelompok positif kuersetin juga menunjukkan perbedaan yang signifikan
jika dibandingkan dengan kelompok negatif dengan nilai P<0.05. Kelompok
kuersetin memiliki kadar MDA sebesar 0.042 µg/ml. Kuersetin ini menurut
Sulistyorini et al. (2015), mempunyai kemampuan untuk mengikat atom atau
sebagai scavenger bagi radikal bebas sehingga tidak terbentuk ROS berlebihan,
karena mampu meningkatkan aktivitas superoxide dismutase (SOD) dan catalase
(CAT). SOD adalah garis pertahanan pertama terhadap ROS yang mengonversi
H2O2, selanjutnya catalase melakukan detoksifikasi H2O2 menjadi molekul
oksigen dan air.
Berdasarkan hasil uji LSD kelompok dosis I, II dan III menunjukkan
penurunan kadar MDA yang berbeda signifikan dengan kelompok kontrol negatif
dengan p<0.05 dan tidak berbeda nyata dengan kontrol normal, kontrol positif
vitamin E dan kuersetin. Hal ini menunjukan bahwa ketiga dosis fraksi metanol
kulit H. polyhizus tersebut memiliki efek antioksidan. Berdasarkan penelitian
Wiset et al. (2012), kulit H. polyhizus mengandung terpenoid golongan karatenoid
yaitu betakaroten yang memiliki aktivitas antioksidan. Karatenoid bereaksi
dengan radikal peroksil yang merupakan hasil dari proses peroksidasi lipid
menghasilkan radikal antioksidan yang tidak reaktif untuk memulai kembali
proses propagasi radikal bebas. Pembentukan radikal antioksidan dapat terhenti
jika bereaksi dengan radikal lain dengan membentuk produk yang stabil sehingga
dapat memutus rantai radikal bebas. Selain itu, menurut Jamilah et al. (2011),
kulit H. polyhizus mengandung senyawa betasianin yang termasuk kelompok
alkaloid. Alkaloid terbukti dapat meredam atau mengurangi produksi senyawa
radikal bebas seperti anion superoksida, hidrogen peroksida dan oksida nitrat.

SIMPULAN

MDA termasuk radikal bebas yang dihasilkan dari reaksi peroksidasi lipid.
Peningkatan kadar MDA yang melebihi kadar normal di hati menyebabkan stres
oksidatif. Analisis kadar MDA dilakukan dengan metode TBA-MDA melalui
kemampuan pembentukan komplek berwarna merah jambu antara MDA dan asam
tiobarbiturat (TBA). Kadar MDA pada tikus wistar yang mengalami stres
oksidatif dapat diturunkan oleh senyawa antioksidan fraksi metanol kulit
Hylocereus polyhizus dengan dosis 5, 10, dan 20 mg/ 200 g BB.
 DAFTAR PUSTAKA

Anggraeni S, Setyaningrum T, Listiawan MY. 2017. Perbedaan kadar

malondialdehid (mda) sebagai petanda stres oksidatif pada berbagai derajat
akne vulgaris. Periodical of Dermatology and Venereology. 29(1) : 36 –
43.
Jamilah B, Shu CE, Kharidah M, Dzulkifly MA, Noranizan A. 2011. Physico-
chemical characteristics of red pitaya (Hylocereus polyrhizus) peel. Int.
Food Res J. 18: 279 – 286.
Lina. 2008. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat
ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J.
Agardh dengan metode deoksiribosa[skripsi]. Yogyakarta(ID) :
Universitas Sanata Dharma.
Mishra S, Mishra R. 2015. Molecular integrity of mitochondria alters by
potassium chloride. International Journal of Proteomics. 2015 : 1 – 12.
Padmaningrum RT, Marwati S. 2015. Validasi metode analisis siklamat secara
spektrofotometri dan turbidimetri. J. Sains Dasar. 4(1) : 23 – 29.
Suarsana IN, Wrediyati T, Suprayogi A. 2013. Respon stres oksidatif dan
pemberian isoflavon terhadap aktivitas enzim superoksida dismutase dan
peroksidasi lipid pada hati tikus. JITV. 18(2) : 146 – 152.
Sulistyorini R, Sarjadi, Johan A, Djamiatun K. 2015. Pengaruh ekstrak etanol dun
kelor (Moringa oleifera) pada ekspresi insulin dan insulitis tikus diabetes
melitus. MKB. 47(2) : 69 – 76.
Sutari VT, Sugito, Aliza, Asmarida. 2013. Kadar malondialdehid (mda) pada
jaringan hati ikan nila (Oreochromis niloticus) yang diberi cekaman panas
dan pakan suplementasi tepung daun jaloh (Salix tetrasperma Roxb).
Jurnal Medika Veterinaria. 7(1) : 35 – 38.
Vera B, Dasrul, Azhar A, Karmil F, Riady G, Sabri M. 2018. Pengaruh pemberian
vitamin E terhadap kadar malondialdehid (mda) serum tikus putih (Rattus
norvegicus) diabetes melitus. JIMVET. 2(1) : 70 – 76.
Wahdaningsih S, Utari EK. 2016. Pengaruh pemberian fraksi metanol kulit buah
naga merah (Hylocerecus polyhizus) terhadap kadar malondialdehid pada
tikus (Rattus novergicus) wistar yang mengalami stres oksidatif. Jurnal
Pharmascience. 3(1) : 45 – 55.
Wiset N, Poomsa-ad, Srilaong V. 2012. Comparisons of antioxidant activity and
bioactive compounds of dragon fruit peel from various drying methods.
World Academy of Science, Engineering, and Technology. 6 : 10-29
Zaetun S, Dewi LBK, Wiadnya IBR. 2018. Profil kadar mda (malondialdehide)
sebagai penanda kerusakan seluler akibat radikal bebas pada tikus yang
diberikan air beroksigen. Jurnal Analis Medika Bio Sains. 5(1) : 79 -84.