1.

Pendahuluan
Tubuh manusia memiliki sistem kompleks enzimatik alami dan pertahanan antioksidan non-
enzimatik yang menangkal efek berbahaya dari radikal bebas dan oksidan lainnya. Gratis
Radikal bertanggung jawab untuk menyebabkan sejumlah besar penyakit termasuk kanker
(Kinnula dan Crapo, 2004), kardiovaskular penyakit (Singh dan Jialal, 2006), gangguan saraf
(Sas et al.,2007), penyakit Alzheimer (Smith et al., 2000), kognitif ringan gangguan (Guidi et
al., 2006), penyakit Parkinson (Bolton et al., 2000), penyakit hati yang diinduksi alkohol
(Arteel, 2003), ulseratif kolitis (Ramakrishna et al., 1997), penuaan (Hyun et al.,2006) dan
aterosklerosis (Upston et al., 2003). Perlindungan melawan radikal bebas dapat ditingkatkan
dengan asupan makanan yang cukup antioksidan. Bukti substansial menunjukkan makanan
itu mengandung antioksidan dan mungkin khususnya antioksidan nutrisi mungkin sangat
penting dalam pencegahan penyakit. Namun, ada konsensus yang berkembang di antara para
ilmuwan bahwa kombinasi antioksidan, daripada entitas tunggal, mungkin lebih efektif dalam
jangka panjang. Antioksidan mungkin sangat bermanfaat dalam meningkatkan kualitas hidup
dengan mencegah atau menunda timbulnya penyakit degeneratif. Tambahan, mereka
memiliki potensi penghematan yang besar dalam biaya pengiriman perawatan kesehatan.
Berbagai metode digunakan untuk menyelidiki antioksidan properti sampel (diet, ekstrak
tumbuhan, antioksidan komersial dll.) Tujuan artikel ulasan ini adalah untuk mengakumulasi
semua metode yang mungkin digunakan untuk mengevaluasi antioksidan milik berbagai
sampel. Deskripsi yang dikompilasi dari semua tersedia model antioksidan in vitro dan in
vivo keuntungan produktif bagi para peneliti arena ini dengan mengurangi waktu mereka
untuk tinjauan literatur dan pengembangan metode. Dua artikel ulasan telah dipublikasikan
sebelumnya (Chanda dan Dave,2009 dan Badarinath et al., 2010) tentang evaluasi
antioksidan in vitro aktivitas. Dalam artikel ini, upaya telah dilakukan termasuk in vivo juga
dan untuk menganalisis frekuensi penggunaan metode yang berbeda.

3. Metode in vitro
Aktivitas antioksidan tidak boleh disimpulkan berdasarkan tunggal model uji antioksidan.
Dan dalam prakteknya beberapa tes in vitro prosedur dilakukan untuk mengevaluasi kegiatan
antioksidan dengan sampel yang menarik. Aspek lain adalah antioksidan itu model uji
bervariasi dalam hal yang berbeda. Karena itu, sulit untuk membandingkan sepenuhnya satu
metode dengan yang lain. Sampai batas tertentu perbandingan antara berbagai metode in vitro
telah dilakukan oleh Badarinath et al. (2010), sementara kami membahas metode dalam hal
pengelompokan dalam naskah saat ini. Peneliti harus secara kritis memverifikasi metode
analisis sebelum mengadopsi itu satu untuk keperluan penelitiannya. Umumnya antioksidan
in vitro tes menggunakan perangkap radikal bebas relatif mudah dilakukan melakukan. Di
antara metode pembersihan radikal bebas, DPPH Metode selanjutnya lebih cepat, sederhana
(mis. tidak terlibat dengan banyak langkah dan reagen) dan murah dibandingkan dengan
model uji lainnya. Di sisi lain dekolorisasi ABTS uji ini berlaku untuk antioksidan hidrofilik
dan lipofilik. Dalam artikel ini semua metode in vitro dijelaskan dan memang demikian
Penting untuk dicatat bahwa satu dapat mengoptimalkan secara logis masing-masing metode
untuk melayani tujuan eksperimentalnya karena tidak ada seorang pun Metode bersifat
absolut daripada contoh.
3.1. DPPH scavenging activity
Molekul 1, 1-difenil-2-pikrillhidrazil (a, a-difenil-bpicrylhydrazyl; DPPH) dicirikan sebagai
radikal bebas yang stabil berdasarkan delokalisasi elektron cadangan di atas molekul secara
keseluruhan, sehingga molekul tidak dimerize, seperti halnya dengan kebanyakan radikal
bebas lainnya. Delokalisasi elektron juga menimbulkan warna ungu tua, ditandai oleh pita
serapan dalam larutan etanol berpusat sekitar 517 nm. Ketika solusi DPPH dicampur dengan
itu dari substrat (AH) yang dapat menyumbangkan atom hidrogen, maka ini memunculkan
bentuk tereduksi dengan hilangnya warna ungu ini. Untuk mengevaluasi potensi antioksidan
melalui gratis pemulungan radikal oleh sampel uji, perubahan optik kepadatan radikal DPPH
dimonitor. Menurut Manzocco et al., 1998 ekstrak sampel (0,2 mL) diencerkan dengan
metanol dan 2 mL larutan DPPH (0,5 mM) ditambahkan. Setelah 30 menit, absorbansi diukur
pada 517 nm. Persentase dari pembersihan radikal DPPH dihitung dengan menggunakan
persamaan seperti yang diberikan di bawah ini:
% penghambatan radikal DPPH = ([Abr –Aar ]/Abr) x 100
di mana Abr adalah absorbansi sebelum reaksi dan Aar adalah
absorbansi setelah reaksi terjadi.

3.2. Hydrogen peroxide scavenging (H2O2) assay

Manusia terpapar H2O2 secara tidak langsung melalui lingkungan hampir sekitar 0,28 mg /
kg / hari dengan asupan sebagian besar dari tanaman daun. Hidrogen peroksida dapat masuk
ke dalam tubuh manusia melalui inhalasi uap atau kabut dan melalui mata atau kulit kontak.
H2O2 cepat terurai menjadi oksigen dan air dan ini dapat menghasilkan radikal hidroksil
(OH) yang dapat memulai peroksidasi lipid dan menyebabkan kerusakan DNA dalam tubuh.
Kemampuan ekstrak tanaman untuk mengais hidrogen peroksida dapat diperkirakan sesuai
dengan metode Ruch et al. (1989). Suatu larutan hidrogen peroksida (40 mM) dibuat dalam
fosfat buffer (50 mM pH 7,4). Konsentrasi hidrogen peroksida ditentukan oleh penyerapan
pada 230 nm menggunakan spektrofotometer. Ekstrak (20–60 lg / mL) dalam air suling
adalah ditambahkan ke hidrogen peroksida dan absorbansi pada 230 nm ditentukan setelah 10
menit melawan larutan kosong yang mengandung fosfat penyangga tanpa hidrogen
peroksida. Persentase pemulungan hidrogen peroksida dihitung sebagai berikut:
% scavenged (H2O2) = [(Ai –At)/Ai] x 100
di mana Ai adalah absorbansi kontrol dan At adalah absorbansites.

3.3. Nitric oxide scavenging activity

Radikal NO dihasilkan dalam jaringan biologis oleh nitric oxide sintase, yang
memetabolisme arginin menjadi sitrulin dengan pembentukan radikal NO melalui reaksi
oksidatif lima elektron (David,1999; Ghafourifar dan Cadenas, 2005;Marletta, 1989;Moncada
et al., 1989; dan Virginia et al., 2003). Senyawa sodium nitroprusside diketahui terurai dalam
air solusi pada pH fisiologis (7.2) menghasilkan radikal NO. Dibawah kondisi aerobik,
radikal NO bereaksi dengan oksigen untuk menghasilkan stabil produk (nitrat dan nitrit),
yang jumlahnya bisa ditentukan menggunakan reagen Griess (Marcocci et al., 1994). Dua(2)
mL 10 mM natrium nitroprusida dilarutkan dalam 0,5 mL saline fosfat buffer (pH 7,4)
dicampur dengan 0,5 mL sampel pada berbagai konsentrasi (0,2-0,8 mg / mL). Campurannya
kemudian diinkubasi pada 25 C. Setelah 150 menit inkubasi, 0,5 mL arutan diinkubasi ditarik
dan dicampur dengan 0,5 mL reagen Griess [(reagen asam sulfanilat 1,0 mL (0,33% dalam
20% asam asetat glasial pada suhu kamar untuk 5 menit dengan 1 mL
naphthylethylenediamine dichloride (0,1% b/v)]. Campuran tersebut kemudian diinkubasi
pada suhu kamar selama 30 menit dan daya serapnya mengalir ke dalam kuvet diukur pada
546 nm. Jumlah penghambatan radikal oksida nitrat dihitung mengikuti persamaan ini:
% penghambatan radikal NO = [(A0 – A1)/A0] x 100
di mana A0 adalah absorbansi sebelum reaksi dan A1 adalah absorbansi
setelah reaksi terjadi dengan reagen Griess

3.4. Peroxynitrite radical scavenging activity

Radikal Peroxynitrite (ONOO) adalah sitotoksikan dengan oksidasi kuat
properti terhadap berbagai konstituen seluler, termasuk sulfhidril, lipid, asam amino dan
nukleotida dan dapat menyebabkan kematian sel, peroksidasi lipid, karsinogenesis dan
penuaan. Ini dihasilkan in vivo oleh sel endotel, sel Kupffer, neutrofil dan makrofag. Radikal
peroxynitrite relatif stabil spesies dibandingkan dengan radikal bebas lainnya tetapi sekali
terprotonasi memberikan asam peroksinitrat yang sangat reaktif (ONOOH), terurai dengan
waktu paruh yang sangat singkat (1,9 detik) pada 37 C untuk membentuk variasi sitotoksikan
dan itu dapat menginduksi oksidasi tiol (SH) mengelompokkan protein, nitrasi tirosin,
peroksidasi lipid dan juga reaksi nitrosasi, yang memengaruhi metabolisme sel dan transduksi
sinyal. Pada akhirnya dapat berkontribusi pada seluler dan cedera jaringan dengan kerusakan
untai DNA dan sel apoptosis kematian, mis. pada timosit, sel kortikal dan leukemia HL-60
sel. Formasi yang berlebihan juga dapat terlibat dalam beberapa hal penyakit manusia seperti
penyakit Alzheimer, rheumatoid radang sendi, kanker dan aterosklerosis. Karena kurangnya
endogen Enzim yang bertanggung jawab untuk inaktivasi radikal ONOO. Metode yang
dijelaskan oleh Kooy et al., 1994 melibatkan penggunaan dari larutan stok
dihydroxyrhodamine 123 (DHR 123, 5 mM) dalam dimethylformamide yang dibersihkan
dengan nitrogen dan disimpan pada 80 C. Solusi bekerja dengan DHR 123 (final konsentrasi
5 μM) diencerkan dari larutan stok dan ditempatkan di es dalam gelap segera sebelum
percobaan. Larutan penyangga, 50 mM natrium fosfat (pH 7,4), mengandung 90 mM natrium
klorida dan 5 mM kalium klorida dengan 100 lM diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)
adalah dibersihkan dengan nitrogen dan diletakkan di atas es sebelum digunakan. Melihat
aktivitas radikal ONOO oleh oksidasi DHR 123 diukur pada spektrofotometer fluoresensi
microplate dengan eksitasi dan panjang gelombang emisi 485 nm dan 530 nm di kamar suhu
masing-masing. Latar belakang dan lampu neon terakhir Intensitas diukur 5 menit setelah
perawatan tanpa 3-morpholino- sydnonimine (SIN-1) atau asli radikal (ONOO). Oksidasi
DHR 123 dengan dekomposisi SIN-1 secara bertahap meningkat sedangkan radikal ONOO
otentik dengan cepat mengoksidasi DHR 123 dengan intensitas fluoresens terakhirnya
menjadi stabil dari waktu ke waktu.

3.5 Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) method/ABTS radical cation

decolorization assay
Metode ini, menggunakan spektrofotometer diode-array untuk mengukur
hilangnya warna ketika antioksidan ditambahkan ke biru-hijau kromofor radikal ABTS+ (2,2-
azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-Asam 6-sulfonat)). Antioksidan mengurangi radikal ABTS+
untuk ABTS dan menghilangkan warna itu. Radikal ABTS+ adalah radikal stabil bukan
ditemukan dalam tubuh manusia. Aktivitas antioksidan dapat diukur seperti yang dijelaskan
oleh Seeram et al. (2006). ABTS kation radikal disiapkan dengan menambahkan mangan
dioksida padat (80 mg)untuk larutan stok berair 5 mM dari ABTS (20 mL menggunakan 75
mM Na/K buffer pH 7). Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8 tetramethylchroman-2-carboxylic acid),
analog yang larut dalam air vitamin E, dapat digunakan sebagai standar antioksidan. kurva
kalibrasi standar dibangun untuk Trolox pada 0, 50, Konsentrasi 100, 150, 200, 250, 300, dan
350 lM. Sampel diencerkan dengan tepat sesuai dengan aktivitas antioksidan dalam PH
buffer Na/K, 7. Sampel encer dicampur dengan 200 lL larutan kation radikal ABTS+ diplat
96-well, dan absorbansi dibaca (pada 750 nm) setelah 5 menit dalam lempeng mikro
pembaca. Nilai TEAC dapat dihitung dari standar Trolox kurva dan dinyatakan sebagai setara
Trolox (dalam mM).

3.6.Parameter antioksidan penjebak radikal total (TRAP) metode

Metode ini didasarkan pada perlindungan yang diberikan oleh antioksidan pada peluruhan
fluoresensi R-phycoerythrin (R-PE) selama reaksi peroksidasi terkontrol. Fluoresensi R-
Phycoerythrin dipadamkan oleh ABAP (2,20-azo-bis (2-amidino-propana) hidroklorida)
sebagai generator radikal. Ini Reaksi pendinginan diukur dengan adanya antioksidan. Potensi
antioksidan dievaluasi dengan mengukur pembusukan dalam penghancuran. Menurut Ghiselli
et al. (1995) 120 lL sampel encer ditambahkan ke 2,4 mL dapar fosfat (pH7,4), 375 lL air
bidistilled, 30 lL R-PE encer dan 75 lL ABAP; kinetika reaksi pada 38 ° C dicatat selama 45
menit oleh spektrometer luminesensi. Nilai TRAP adalah dihitung dari panjang fase lag
karena sampel dibandingkan dengan standar.

3.7. Uji daya pereduksi antioksidan (FRAP)

Metode ini mengukur kemampuan antioksidan untuk mengurangi besi ferric. Hal ini
didasarkan pada pengurangan kompleks besi ferric dan 2,3,5-triphenyl-1,3,4-triaza-2-
azoniacyclopenta-1,4- diene chloride (TPTZ) ke bentuk besi pada pH rendah. Ini reduksi
dimonitor dengan mengukur perubahan penyerapan pada 593 nm, menggunakan
spektrofotometer dioda-array. Antioksidan pengujian dapat dilakukan dengan metode yang
dikembangkan oleh Benzie dan Strain (1999). Tiga mililiter FRAP yang disiapkan reagen
dicampur dengan 100 lL sampel encer; absorbansi pada 593 nm direkam setelah inkubasi 30
menit pada 37 C. Nilai FRAP dapat diperoleh dengan membandingkan penyerapan perubahan
dalam campuran tes dengan yang diperoleh dari peningkatan konsentrasi Fe3+ dan dinyatakan
sebagai mM setara Fe2+ per kg (makanan padat) atau per L (minuman)dari sampel.

3.8. Aktivitas pemulungan radikal superoksida (SOD)

Meskipun anion superoksida adalah oksidan yang lemah, itu pada akhirnya menghasilkan
radikal hidroksil yang kuat dan berbahaya juga sebagai oksigen singlet, yang keduanya
berkontribusi terhadap stres oksidatif (Meyer dan Isaksen, 1995). Anion superoksida mengais
aktivitas dapat diukur seperti yang dijelaskan oleh Robak dan Gryglewski (1988). Radikal
anion superoksida dihasilkan dalam 3,0 mL buffer Tris-HCl (16 mM, pH 8.0), mengandung
0,5 mL nitroblue tetrazolium (NBT) (0,3 mM), 0,5 mL Larutan NADH (0,936 mM), ekstrak
1,0 mL dan 0,5 mL Buffer Tris – HCl (16 mM, pH 8.0). Reaksi dimulai dengan
menambahkan 0,5 mL larutan phenazine methosulfate (PMS) (0,12 mM) ke campuran,
diinkubasi pada 25 C selama 5 menit dan maka absorbansi diukur pada 560 nm terhadap
blanko Sampel.

3.9. Hydroxyl radical scavenging activity

Radikal hidroksil adalah salah satu spesies oksigen reaktif yang kuat di Indonesia sistem
biologis yang bereaksi dengan lemak tak jenuh ganda bagian asam dari fosfolipid membran
sel dan menyebabkan kerusakan ke sel. Kemampuan pembersihan radikal hidroksil diukur
oleh metode Kunchandy dan Rao (1990). Itu campuran reaksi (1,0 mL) terdiri dari 100 μL
dari 2-deoksi- Dribose (28 mM dalam 20 mM buffer KH2PO4-KOH, pH 7,4), 500 μL
ekstrak, 200 μL EDTA (1,04 mM) dan 200 μM FeCl3 (1: 1 v / v), 100 μL H2O2 (1,0 mM)
dan 100 μL askorbatasam (1,0 mM) yang diinkubasi pada suhu 37 C selama 1 jam. Satu
mililiter asam tiobarbiturat (1%) dan 1,0 mL trikloroasetat asam (2,8%) ditambahkan dan
diinkubasi pada 100 C selama 20 menit. Setelah pendinginan, absorbansi diukur pada 532
nm, terhadap sampel kosong

3.10. Hydroxyl radical averting capacity (HORAC) method

Uji HORAC dijelaskan oleh Ou et al. (2002) mengukur logam aktivitas chelating antioksidan
dalam kondisi Reaksi seperti Fenton menggunakan kompleks Co (II) dan karenanya
kemampuan melindungi terhadap pembentukan radikal hidroksil. Larutan hidrogen peroksida
0,55M disiapkan dalam suling air dan 4,6 mM Co (II) disiapkan dengan melarutkan 15,7 mg
CoF2.4H2O dan 20 mg asam pikolinat dalam 20 mL suling air. Fluorescein - 170 μL (60 nM,
konsentrasi akhir) dan 10 μL sampel diinkubasi pada suhu 37 C selama 10 menit. Langsung
di pembaca piring. Setelah inkubasi 10 μL H2O2 (27,5 mM, final konsentrasi) dan 10 μL Co
(II) (konsentrasi akhir 230 μM) larutan ditambahkan kemudian. Inisial fluoresensi diukur
setelah pembacaan dilakukan setiap menit setelah bergetar. Untuk sampel kosong, dapar
fosfat solusi digunakan. Standar 100, 200, 600, 800 dan 1000 μM larutan antioksidan (dalam
buffer fosfat 75 mM, pH 7,4) adalah digunakan untuk membangun kurva standar. Nilai-nilai
HORAC akhir dihitung menggunakan persamaan regresi antara standar konsentrasi
antioksidan dan luas bersih di bawah melengkung. Satu unit HORAC ditugaskan ke area
perlindungan netto disediakan oleh 1μM antioksidan standar dan aktivitas sampel dinyatakan
sebagai setara antioksidan standar lμM per gram berat segar sampel. Asam galat bisa
digunakan sebagai antioksidan standar.

3.11. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) Method

ORAC adalah analisis tabung reaksi baru yang menarik dan revolusioner yang dapat
digunakan untuk menguji Power ‘Kekuatan Antioksidan’ dari makanan dan
zat kimia lainnya. Tes ini dapat dilakukan dengan menggunakan bphycoerythrin (β-PE) atau
fluorescein sebagai molekul target. Sementara meninjau, β-PE tidak ditemui dalam publikasi
nanti dari tahun 2005. Jadi tampaknya fluorescein menggantikan β-PE sebagai target molekul
dalam uji ORAC. Tes dilakukan menggunakan Trolox (analog Vitamin E yang larut dalam
air) sebagai standar untuk menentukan Trolox Equivalent (TE). Nilai ORAC
kemudian dihitung dari Trolox Equivalent dan dinyatakan sebagai unit atau nilai ORAC.
Semakin tinggi nilai ORAC, semakin tinggi semakin besar ‘‘ Kekuatan Antioksidan ’.
Pengujian ini didasarkan pada generasi penggunaan radikal bebas AAPH (2,2-azobis 2-
amidopropane dihydrochloride) dan
pengukuran penurunan fluoresensi dengan adanya bebas pemulung radikal. Prior et al. (2003)
telah melaporkan yang otomatis Uji ORAC. Dalam pengujian ini β-phycoerythrin (β-PE)
digunakan sebagai target kerusakan akibat radikal bebas, AAPH sebagai radikal peroksi
generator dan Trolox sebagai kontrol standar. Setelah penambahan AAPH ke larutan uji,
fluoresensi direkam dan aktivitas antioksidan dinyatakan sebagai setara trolox (Cao et al.,
1993; Frei et al., 1990). Pengujian dapat dilakukan sesuai dengan Prior et al. (2003) dalam
piring fluoresensi polipropilena 96-baik dengan final volume 200 μL. Tes dilakukan pada pH
7,0 dengan Trolox (6.25, 12.5, 25, dan 50 μmol / L untuk uji lipofilik; 12.5, 25, 50 dan 100
μmol / L uji hidrofilik) sebagai standar dan 75 mM / L buffer fosfat sebagai blanko. Setelah
penambahan AAPH, pelat ditempatkan segera di konter multilabel dipanaskan lebih dulu
sampai 37 C. Piring terguncang secara orbital selama 10 detik dan fluoresensi dibaca pada
interval 1 menit untuk 35 menit pada panjang gelombang eksitasi 485 nm dan emisi panjang
gelombang 520 nm. Kurva area-di bawah kurva dihitung untuk setiap sampel menggunakan
perangkat lunak Wallac Workout 1.5. Perhitungan akhir hasil dibuat dengan mengambil
perbedaan area-under-kurva-pembusukan antara kosong dan sampel dan / atau standar
(Trolox) dan menyatakan ini dalam μM dari setara Trolox (TE) per g berat kering sampel (lM
TE / g).
3.12. Metode pengurangan daya (RP)
Metode ini didasarkan pada prinsip peningkatan absorbansi dari campuran reaksi.
Meningkatkan absorbansi menunjukkan peningkatan aktivitas antioksidan. Dalam metode ini,
senyawa antioksidan membentuk kompleks berwarna kalium ferricyanide, asam trikloro
asetat dan ferric chloride, yang diukur pada 700 nm. Peningkatan daya serap campuran reaksi
menunjukkan kekuatan reduksi sampel (Jayaprakash et al., 2001). Dalam metode yang
dijelaskan oleh Oyaizu (1986) 2,5 mL 0,2 M buffer fosfat (pH 6,6) dan 2,5 mL K3Fe (CN)6
(1% b/v) ditambahkan ke 1,0 mL sampel dilarutkan dalam air suling. Campuran yang
dihasilkan adalah diinkubasi pada 50 C selama 20 menit, diikuti dengan penambahan 2,5 mL
asam trikloro asetat (10% b/v). Campurannya disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit
untuk mengumpulkan lapisan atas larutan (2,5 mL), dicampur dengan air suling (2,5 mL) dan
0,5 mL FeCl3 (0,1%, b/v). Absorbansi adalah kemudian diukur pada 700 nm terhadap sampel
kosong.

3.13. Metode fosfomolibdenum

Uji kapasitas antioksidan total adalah metode spektroskopi untuk
penentuan kuantitatif kapasitas antioksidan, melalui pembentukan kompleks
fosfomolibdenum. Pengujian didasarkan pada pengurangan Mo (VI) menjadi Mo (V) oleh
sampel analit dan pembentukan selanjutnya hijau kompleks fosfat Mo (V) pada pH asam.
Antioksidan total kapasitas dapat dihitung dengan metode yang dijelaskan oleh Prieto et al.
(1999). 0,1 mL larutan sampel (100 μg) dikombinasikan dengan 1 mL reagen (0,6 M asam
sulfat, 28 mM natrium fosfat dan 4 mM amonium molibdat). Tabung itu ditutup dan
diinkubasi dalam bak air mendidih pada suhu 95 C untuk 90 mnt. Setelah mendinginkan
sampel ke suhu kamar, absorbansi larutan berair diukur pada 695 nm terhadap kosong dalam
spektrofotometer UV. Solusi kosong yang khas mengandung 1 mL larutan reagen dan sesuai
volume pelarut yang sama digunakan untuk sampel dan diinkubasi dalam kondisi yang sama
dengan sisa sampel. Untuk sampel komposisi yang tidak diketahui, kapasitas antioksidan bisa
dinyatakan sebagai setara dengan a-tokoferol.

3.14. Metode ferric tiosianat (FTC)

Metode ini dapat dimanfaatkan untuk menentukan antioksidan aktivitas seperti yang
diilustrasikan oleh Kikuzaki et al. (1991). Campuran dari 4 mg sampel (konsentrasi akhir
0,02% b/v) dalam 4 mL etanol, 4,1 mL asam linoleat 2,51% dalam etanol, 8,0 mL 0,02
Buffer fosfat (pH 7,0) dan 3,9 mL air suling yang terkandung dalam vial tutup ulir
ditempatkan dalam oven pada suhu 40 C di gelap. 0,1 mL campuran reaksi ditransfer ke tes
tabung dan, untuk itu; 9,7 mL etanol berair 75% (v/v), diikuti dengan 0,1 mL amonium
tiosianat 30% dan 0,1 mL 0,02 M ferro klorida dalam asam klorida 3,5% sudah ditambahkan.
Tiga menit setelah penambahan ferrous chloride ke campuran reaksi, absorbansi dari
campuran yang dihasilkan (warna merah) diukur pada 500 nm setiap 24 jam sampai
absorbansi kontrol mencapai maksimum. Standar antioksidan (konsentrasi akhir 0,02% b/v)
digunakan sebagai positif kontrol, dan campuran tanpa sampel digunakan sebagai
kontrol negatif.

3.15. Metode asam tiobarbiturat (TBA)

Metode TBA, dijelaskan oleh Ottolenghi (1959) adalah sebagai berikut: The konsentrasi
sampel akhir 0,02% b/v digunakan dalam metode ini. Dua mL asam trikloroasetat 20% dan 2
mL 0,67% Asam tiobarbiturat ditambahkan ke 1 mL larutan sampel. Campuran ditempatkan
dalam bak air mendidih selama 10 menit
dan kemudian disentrifugasi setelah pendinginan pada 3000 rpm selama 20 menit. Aktivitas
absorbansi supernatan diukur pada 552 nm dan direkam setelah mencapai maksimum.

3.16. DMPD (N, N-dimethyl-p-phenylene diamine dihidroklorida)methode

Metode dekolorisasi kation radikal DMPD telah dikembangkan untuk pengukuran aktivitas
antioksidan dalam makanan dan sampel biologis. Pengujian ini didasarkan pada pengurangan
larutan buffered dari DMPD berwarna dalam buffer asetat dan besi klorida. Prosedur ini
melibatkan pengukuran penurunan dalam penyerapan DMPD pada daya serap maksimum
505 nm. Kegiatan itu diungkapkan sebagai persentase pengurangan DMPD. Fogliano et al.
(1999) memperoleh radikal dengan mencampur 1 mL larutan DMPD (200 mM), 0,4 mL besi
klorida (III)(0,05 M), dan 100 mL larutan buffer natrium asetat di 0,1 M, memodifikasi pH
menjadi 5,25. Campuran reaktif memiliki untuk disimpan dalam kegelapan, di bawah
pendingin, dan pada suhu rendah(4–5 C). Reaksi terjadi ketika 50 μL dari sampel
(pengenceran 1:10 dalam air) ditambahkan ke 950 μL dari larutan radikal DMPD+.
Absorbansi diukur setelah 10 menit
pengadukan terus menerus, yang merupakan waktu yang dibutuhkan untuk mencapai konstan
nilai dekolorisasi. Hasilnya dikuantifikasi dalam mM Trolox pada kurva kalibrasi yang
relevan.

3.17. b-carotene linoleic acid method/conjugated diene assay

Ini adalah salah satu metode cepat untuk menyaring antioksidan, yaitu terutama didasarkan
pada prinsip bahwa asam linoleat, yang merupakan asam lemak tak jenuh, dioksidasi oleh
'Spesies Oksigen Reaktif' (ROS) diproduksi oleh air yang mengandung oksigen. Produk
terbentuk akan memulai oksidasi b-karoten, yang akan menyebabkan untuk perubahan warna.
Antioksidan mengurangi tingkat perubahan warna, yang diukur pada 434 nm dan aktivitasnya
adalah diukur. Metode seperti yang dijelaskan oleh Kabouche et al. (2007): b-karoten(0,5
mg) dalam 1 mL kloroform ditambahkan ke 25 lL linoleat asam dan 200 mg campuran
tween-80 emulsi. Kloroform diuapkan pada suhu 40 C, 100 mL air suling jenuh dengan
oksigen secara perlahan ditambahkan ke residu dan arutan sangat gelisah untuk membentuk
emulsi yang stabil. Empat mL campuran ini ditambahkan ke tabung reaksi yang mengandung
200 lL sampel disiapkan dalam metanol pada konsentrasi akhir (25, 50, 100, 200 dan 400 lg /
mL). Begitu emulsi solusi ditambahkan ke tabung, absorbansi waktu diukur pada 470 nm.
Tabung diinkubasi selama 2 jam pada 50C. Vitamin C dapat digunakan sebagai standar.
Aktivitas antioksidan dihitung sebagai persentase penghambatan (I%) relatif terhadap kontrol
menggunakan persamaan berikut:
I% = [1 – ( As - As120)/Ac -Ac120)]
di mana As adalah serapan awal, As120 adalah serapan sampel pada 120 menit, Ac adalah
absorbansi negatif awal kontrol dan Ac120 adalah absorbansi dari kontrol negatif pada 120
menit.

3.18. Xanthine oxidase method

Aktivitas xanthine oxidase dengan xanthine sebagai sub-substrat dapat diukur secara
spektrofotometri, dengan metode Noro et al. (1983). Ekstrak (500 lL 0,1 mg/mL) dan
allopurinol (100 μg/mL) (dalam metanol) dicampur dengan 1,3 mL dapar fosfat (0,05 M, pH
7,5) dan 0,2 mL 0,2 unit/mL larutan xanthine oksidase. Setelah 10 menit inkubasi di suhu
kamar (25 C), 1,5 mL substrat xanthine 0,15M solusi ditambahkan ke campuran ini.
Campurannya lagi diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar (25 C) lalu absorbansi diukur
pada 293 nm menggunakan spektrofotometer terhadap kosong (0,5 mL metanol, 1,3 mL
buffer fosfat, 0,2 mL xanthine oksidase). Solusi 0,5 mL metanol, 1,3 mL dapar fosfat, 0,2 mL
xanthine oksidase dan Substrat xanthine 1,5 mL digunakan sebagai kontrol. Persentase dari
penghambatan dihitung menggunakan rumus:
Persentase penghambatan = [1-(As/Ac)]x 100
di mana As dan Ac adalah nilai absorbansi dari sampel uji dan kontrol, masing-masing.

3.19. Cupric ion reducing antioxidant capacity (CUPRAC) method

Reagen pengoksidasi kromogenik dari CUPRAC yang dikembangkan metode, yaitu,
bis(neocuproine)tembaga(II) klorida [Cu (II)-Nc], bereaksi dengan polifenol [Ar(OH)n]
dengan cara tersebut.
2n Cu(Nc)2+2 + Ar(OH)n = 2n Cu(Nc)2+ + Ar (=O)n + 2n H+
di mana proton yang dibebaskan dapat disangga dengan yang relatif larutan buffer amonium
asetat pekat. Dalam reaksi ini, gugus polifenol Ar-OH reaktif dioksidasi ke kuinon yang
sesuai dan Cu(II)-Nc dikurangi menjadi chelate Cu yang sangat berwarna Cu (I) -Nc
menunjukkan maksimum penyerapan pada 450 nm. Menurut Apak et al. (2008), 1 mL dari
10-2 M CuCl2, 1 mL neocuproine 7,5 x 10-3 M dan 1 M larutan NH4CH3COO ditambahkan ke
tabung reaksi gelas. Kemudian, 400 lL dari larutan standar yang baru disiapkan ditambahkan
dan dilarutkan ke volume akhir 4,1 mL dengan air deionisasi. Prosedur ini diulang untuk 400
μL, 300 μL, 200 μL, 100 μL dan 50 μL penambahan larutan yang baru disiapkan dari sampel.
Solusi yang disiapkan dicampur dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit.
Absorbansi pada 450 nm ditentukan terhadap reagen kosong oleh spektrometer. Perhitungan
kapasitas antioksidan senyawa sebagai setara Trolox (Nilai TEAC) dengan metode CUPRAC
telah dilaporkan.

3.20. Metal chelating activity

Ferrozine dapat membentuk kompleks dengan warna merah dengan membentuk chelates
dengan Fe2+. Reaksi ini dibatasi di hadapan agen chelating lainnya dan menghasilkan
penurunan warna merah kompleks ferrozine-Fe2+. Pengukuran warna reduksi menentukan
aktivitas chelating untuk bersaing bersama ferrozine untuk ion besi (Soler-Rivas et al., 2000).
Itu chelation ion ferro diperkirakan menggunakan metode Dinis et al. (1994). 0,1 mL ekstrak
ditambahkan ke larutan 0,5 mL besi klorida (0,2 mM). Reaksi dimulai oleh
penambahan 0,2 mL ferrozine (5 mM) dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit dan
kemudian absorbansi diukur pada 562 nm. EDTA atau asam sitrat (Dinis et al., 1994) dapat
digunakan sebagai kontrol positif.