Laporan Praktikum Hari, tanggal : Rabu, 30 Oktober 2019

Teknik Analisis Biokimia Waktu : 08.00 – 11.00 WIB

PJP : Rini Kurniasih, S.Si, M.Si
Asisten : Salma Dienta Salsabila

UJI ANTIOKSIDAN METODE FRAP

Kelompok 3

Safira Rahmadanti G84170036

Fadhilah Eka Putri G84170009
Jauzaa Rifka Lubis G84170023
Novi Rahmawati G84170029
Syndilona Br Sitepu G84170031
M. Nabil Aufa G84170044
Ahmad Syaiful Bahri G84170046
Zatta Yumni I. S. G84170048
Novi Lepiana Berutu G84170079

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2019
 PENDAHULUAN

Radikal bebas merupakan atom,molekul, atau senyawa yang memiliki

kereaktifan tinggi, hal ini dikarenakan adanya elektron yang tidak berpasangan.
Sumber radikal bebas dapat berasal dari sisa hasil metabolisme tubuh dan dari luar
tubuh seperti makanan, sinar ultra violet, polutan dan asap rokok. Jumlah radikal
bebas yang terus meningkat dalam tubuh dapat mengakibatkan terjadinya stress
oksidatif sel. Hal ini terjadi karena adanya ketidakseimbangan antara jumlah radikal
bebas dengan antioksidan yang dihasilkan tubuh. Jika hal ini terus-menerus terjadi
maka akan memicu munculnya berbagai penyakit degeneratif seperti kanker,
diabetes, peradangan dan kardiovaskuler. Antioksidan merupakan senyawa yang
dapat memperlambat proses oksidasi dari radikal bebas. Mekanisme kerja senyawa
antioksidan salah satunya yaitu dengan cara mendonorkan atom hidreogen atau
proton kepada senyawa radikal. Hal ini menjadikan senyawa radikal yang tadinya
bersifat tidak stabil menjadi lebih stabil (Febriyenti et al. 2018). Menurut Rahman
et al. (2018) dalam arti biologis antioksidan adalah senyawa yang mampu
menangkal atau meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan
merupakan senyawa pemberi elektron atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat
molekul kecil, tetapi mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi
dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan mampu bertindak sebagai
penyumbang radikal hidrogen atau sebagai akseptor radikal bebas sehingga dapat
menunda tahap inisiasi pembentukan radikal bebas.
Secara alami antioksidan diproduksi oleh tubuh berupa tiga enzim yaitu,
superoksida dimutase (SOD), glutation peroksidase dan katalase. Di antara ketiga
enzim tersebut yang mempunyai efek antioksidan paling kuat adalah enzim
superoksida dimutase, hal ini karena enzim SOD mampu mengkatalis perubahan
superoksida menjadi hidrogen peroksida dan oksigen. Superoksida merupakan
suatu radikal yang bersifat sangat reakitif (Fadiyah et al. 2018). Selain itu,
antioksidan juga dapat diperoleh dari faktor eksternal. Secara kimiawi antioksidan
alami juga terdapat dalam tumbuh-tumbuhan dan bahan pangan yaitu, pada bagian
buah, bunga, daun, batang ataupun bagian lainnya. Antioksidan yang berasal dari
tumbuh-tumbuhan biasanya barupa golongan senyawa turunan fenol seperti
flavonoid (kuersetin), turunan senyawa asam hidroksamat, kumarin, vitamin
(tokoferol) dan vitamin C (Febriyenti et al. 2018; Maesaroh et al. 2018).
Pengujian aktivitas anitoksidan dilakukan menggunakan berbagai metode
diantaranya, metode yang berbasis air 2.2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) atau
rekasi dengan radikal bebas, Ferric reducing Antioxidant Power (FRAP) atau reaksi
reduksi-oksidasi, Ferrous Ion Chelating (FIC) atau rekasi kelat melalui
pembentukan kompleks dan yang berbasis lemak misalnya Thiobarbituric acid
(TBA). Banyaknya metode uji aktivitas antioksidan tersebut dapat memberikan
hasil uji yang beragam. Hal ini diakibatkan oleh adanya pengaruh dari struktur
kimiawi antioksidan, sumber radikal bebas, dan sifat fisiko-kimia sediaan sampel
yang berbeda. Oleh karena itu, pemilihan metode pengujian yang tepat sangat
penting dalam menguji aktivitas antioksidan suatu bahan. Selai itu, pemilihan
standar juga sangat penting. Standar yang digunakan haruslah mewakili struktur
antioksidan pada umumnya (Maesaroh et al. 2018). Praktikum ini bertujuan
menganalisis aktivitas antioksidan dari bagian tumbuhan dengan metode FRAP.
 METODE

Waktu dan Tempat

Praktikum mata kuliah Teknik Analisis Biokimia materi uji antioksidan

metode FRAP dilakukan pada hari Rabu, 30 Oktober 2019 pukul 08.00 sampai
dengan pukul 11.00 WIB bertempat di Laboratorium Pendidikan Biokimia,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, neraca, penangas, sentrifusa,

spektofotometer UV-Vis dan botol gelap. Bahan yang dibutuhkan adalah ekstrak
tumbuhan, asam askorbat, etanol 96%, asam oksalat 1%, buffer fosfat 0.2 M pH
6.6, larutan K3Fe(CN)6 1%, larutan FeCl3 0.1% dan larutan trikloroasetat.

Prosedur Percobaan

Penyiapan Larutan Standar

Sebanyak 25 mg asam askorbat ditimbang, kemudian dilarutkan dengan
sedikit larutan asam oksalat 1%. Larutan tersebut lalu dipindahkan ke dalam labu
takar 25 mL dan ditambahkan lagi larutan asam oksalat 1% sampai tanda tera.
Larutan yang telah dibuat adalah larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm.
Larutan stok tersebut selanjutnya diencerkan menjadi konsentrasi 60, 70, 80, 90 dan
100 ppm dengan volume akhir 10 mL.

Penyiapan Sampel
Ekstrak kembang telang ditimbang sebanyak 0.05 mg, kemudian dilarutkan
dengan etanol 96% sebanyak 10 mL sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi
1000 ppm. Larutan tersebut kemudian diencerkan menjadi konsentrasi 100, 200,
400, 600, dan 800 ppm dengan volume akhirnya 10 mL.

Analisis aktivitas antioksidan dengan metode FRAP

Larutan Standar. Sebanyak 1 mL larutan standar tiap konsentrasi dipipet
ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 1 mL buffer fosfat 0.2 M pH 6.6
dan 1 mL kalium ferisianida 1%. Setelah itu, diinkubasi selama 20 menit dengan
suhu 50 C. Ke dalam tiap tabung, kemudian ditambahkan 1 mL larutan
trikloroasetat. Semua larutan lalu disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama
10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dipipet sebanyak 1 mL, ditambahkan
akuades sebanyak 1 mL dan larutan FeCl3 1% sebanyak 0.5 mL. Larutan
selanjutnya didiamkan selama 10 menit, kemudian diencerkan dengan faktor
pengenceran sebesar 50 kali. Setelah itu, nilai absorbansi larutan standar diukur
pada panjang gelombang 720 nm. Blanko yang digunakan dibuat dari larutan asam
oksalat 1 % sebanyak 1 mL yang mendapat perlakuan seperti larutan stndar.
Sampel. Prosedur pengujian antioksidan dengan metode FRAP untuk tiap
konsentrasi larutan sampel langkah-langkahnya sama dengan yang dilakukan pada
larutan standar.
 HASIL PERCOBAAN

Uji antioksidan dengan metode FRAP menggunakan asam askorbat sebagai

pembanding. Konsentrasi larutan asam askorbat yang diuji adalah 0, 60, 70, 80, 90,
dan 100 ppm. Data pada Tabel 1 menunjukan hasil percobaan uji antioksidan
dengan metode FRAP pada pembanding, yaitu asam askorbat. Nilai absorbansi
pada setiap konsentrasi asam askorbat bervariasi. Dari nilai absorbansi terkoreksi
dan konsentrasi asam askorbat, didapat kurva yang persamaannya adalah y = -
0.0009x + 0.6488 dan nilai R2 = 0.4679. Aktivitas antioksidan asam askorbat pada
setiap konsentrasi bernilai negatif. Dari kurva antara % aktivitas antioksidan dan
konsentrasi asam askorbat, diperoleh persamaan y = 0.2396 + 68.958 dengan nilai
R2 = 0.4679.
Tabel 1 Aktivitas antioksidan asam askorbat
[asam askorbat] Absorbansi % Aktivitas
Absorbansi terukur
(ppm) terkoreksi antioksidan
Blanko 0.015 - -
0 0.399 0.384 -
60 0.612 0.597 -55.469
70 0.582 0.567 -47.656
80 0.614 0.599 -55.990
90 0.572 0.557 -45.052
100 0.571 0.556 -44.792
Contoh perhitungan :
Absorbansi 0 ppm - absorbansi standar
% Aktivitas antioksidan = x 100%
Absorbansi 0 ppm

0.384 - 0.213
= x 100%
0.384

= -55.469 %

Asam askorbat
0.61
0.6
Absorbansi

0.59
0.58
0.57 y = -0.0009x + 0.6488
R² = 0.4679
0.56
0.55
0 20 40 60 80 100 120
Konsentrasi (ppm)

Gambar 1 Kurva standar asam askorbat

 Asam askorbat
0
-10 0 20 40 60 80 100 120

%Aktivitas antioksidan
-20
-30
-40
-50
-60 y = 0.2396x - 68.958
-70 R² = 0.4679
-80
Konsentrasi (ppm)

Gambar 2 Kurva standar asam askorbat

Tabel 2 Aktivitas antioksidan ekstrak etanol 96% bunga telang

[Sampel] Absorbansi Absorbansi % Aktivitas Nilai FRAP (mg
(ppm) terukur terkoreksi antioksidan AEE/gekstrak)
Blanko 0.003 - - -
0 0.090 0.087 - -
100 0.047 0.044 49.425 672.000
200 0.075 0.072 17.241 640.889
400 0.079 0.076 12.644 636.444
600 0.073 0.070 19.540 643.111
800 0.076 0.073 16.092 639.778

Contoh perhitungan :
Absorbansi 0 ppm - absorbansi standar
% Aktivitas antioksidan = x 100%
Absorbansi 0 ppm

0.087 - (- 0.043)
= x 100%
0.087
= 49.425 %

Ekstrak bunga telang

% Aktivitas antioksidan

y = -0.0312x + 36.088
60.000 R² = 0.3551
40.000

20.000

0.000
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
Konsentrasi (ppm)

Gambar 3 Aktivitas antioksidan ekstrak etanol 96% pada bunga kembang

telang
 Sampel yang diuji pada percobaan ini adalah ekstrak etanol 96% bunga
telang. Pengujian dilakukan pada sampel dengan konsentrasi 100, 200, 400, 600,
dan 800 ppm. Data pada Tabel 2 menunjukan hasil percobaan yang dilakukan pada
sampel ekstrak bunga telang. Nilai absorbansi pada tiap konsentrasi sampel
bervariasi. Data % Aktivitas antioksidan sampel juga bervariasi nilainya. Ekstrak
bunga telang dengan konsentrasi 100 ppm memiliki nilai % aktivitas antioksidan
yang paling besar dibandingkan dengan sampel dengan konsentrasi lainnya. Nilai
FRAP sampel dihitung dengan menggunakan persamaan pada kurva absorbansi dan
konsentrasi pembanding berupa asam askorbat. Dari perhitungan tersebut diperoleh
nilai FRAP pada tiap konsentrasi sampel secara berurutan adalah 672, 640.889,
636.444, 643.111, dan 639.778 mg AAE/gekstrak. Sampel dengan kosentrasi 100
ppm, mempunyai nila FRAP yang paling besar.

PEMBAHASAN

Sistem kerja antioksidan secara umum dibagi menjadi dua yaitu, enzimatik
dan non enzimatik. Contoh antioksidan yang bekerja secara enzimatik adalah
superoksida dimutase (SOD), katalase, peroksidase, asam askorbat peroksidase,
glutation peroksidase dan polifenol peroksidase. Antioksidan yang bekerja secara
non enzimatik contohnya adalah asam askorbat, senyawa fenolik, karotin dan α-
tokoferol. Senyawa fenolik yang sangat aktif sebagai antiokasidan alam, paling
banyak ditemukan pada tumbuh-tumbuhan. Salah satu tumbuhan yang dapat
menjadi sumber antioksidan adalah tumbuhan telang (Clitoria ternatea L.) yang
merupakan tanaman polong dan termasuk ke dalam famili Fabaceae. Beberapa
penelitian telah menyatakan bahwa tumbuhan ini terutama pada bagian bunganya
memiliki kandungan kimia fenolik, flavonoid, antosianin, flavonol glioksida,
kaempferol glioksida, kuersetin glioksida, mirisetin glioksida, terpenoid, tanin dan
steroid. Senyawa fenolik mempunyai korelasi positif dengan aktivitas antioksidan,
sehingga polifenol kemungkinan merupakan senyawa yang paling berpotensi
menyumbangkan aktivitas antiradikal pada bunga telang (Andriani dan Murtisiwi
2018).
Pengujian aktivitas antioksidan pada tanaman dan bahan pangan lainnya
dapat dilakukan dengan berbagai metode salah satunya adalah metode Ferric
Reducing Antioxidant Power (FRAP). Prinsip metode ini adalah mengukur
kemampuan senyawa antioksidan untuk mereduksi kompleks senyawa Ferric
Tripyridyl Triazine (Fe(III)-TPTZ) menjadi bentuk ferro yang berwarna biru pada
pH rendah 3.6 (Setiawati et al. 2015). Menurut Rohmadianto (2019) metode FRAP
menggunakan Fe(TPTZ)3+ kompleks besi-ligan 2,4,6-tripiridil-triazin sebagai
pereaksi. Kompleks Fe(TPTZ)23+ akan berfungsi sebagai zat pengoksidasi dan akan
mengalami reduksi menjadi Fe(TPTZ)22+ yang berwarna kekuningan. Persamaan
rekasinya adalah
Fe(TPTZ)23+ + AROH  Fe(TPTZ)22+ + H+ + AR=O.
Senyawa Fe(TPTZ)3+ mewakili senyawa oksidator yang mungkin terdapat dalam
tubuh dan dapat merusak sel-sel tubuh, sedangkan sampel yang mengandung
antioksidan yang kemudian dapat mereduksi senyawa Fe(TPTZ)3+ menjadi
Fe(TPTZ)2+ sehingga Fe(TPTZ)3+ tidak akan melakukan reaksi yang merusak sel-
sel tubuh. Semakin banyak konsentrasi Fe(TPTZ)3+ yang direduksi maka aktivitas
antioksidan dari sampel juga semakin besar. Penambahan FeCl3 dalam reagen untuk
membentuk senawa Fe3+ dan memperlambat reaksi reduks Fe3+ menjadi Fe2+ yang
terjadi sangat cepat oleh pengaruh cahaya(Syarif et al. 2015). Menurut Al Amin et
al. (2018) penambahan FeCl3 bertujuan untuk membentuk kompleks berwarna
hijau sampai biru. Penambahan larutan TCA bertujuan agar kompleks kalium
ferrosianida mengendap. Larutan pembanding yang digunakan adalah asam
askorbat. Asam askorbat digunakan karena telah diketahui berfungsi sebagai
antioksidan sekunder yang mampu menangkal radikal bebas ekstraseluler. Hal ini
dikarenakan asam askorbat mempunyai gugus hidroksi bebas (Maryam et al. 2016).
Data percobaan pada pembanding berupa asam askorbat, menunjukan hasil
yang kurang baik karena nilai % aktivitas antioksidannya bernilai negatif. Nilai
aktivitas antioksidan menyatakan kemampuan asam askorbat untuk mengatasi efek
radikal bebas. Menurut Al amin et al. (2018) pada metode FRAP, aktivitas
antioksidan menyatakan kemampuan senyawa untuk mereduksi Fe3+ menjadi Fe2+.
Senyawa yang mempunyai daya reduksi kemungkinan dapat berperan sebagai
antioksidan karena dapat menstabilkan radikal bebas. Asam askorbat yang
merupakan contoh antioksidan sekunder (Maryam et al. 2016) seharusnya
mempunyai nilai aktivitas antioksidan yang tidak negatif. Ketidaksesuaian hasil
percobaan terjadi karena prosedur percobaan tidak dilaukan dengan benar dan asam
askorbat yang digunakan kondisinya sudah tidak baik. Hasil percobaan pada
sampel, diperoleh bahwa nilai % aktivitas antioksidan dan nilai FRAP nya
bervariasi. Sampel dengan konsentrasi 100 ppm mempunyai nilai % aktivitas
antioksidan dan nilai FRAP yang paling besar dibandikan dengan sampel lainnya.
Menurut Maryam et al. (2016) % aktivitas antioksidan dan nilai FRAP sama-sama
menyatakan kemampuan antioksidan dalam mengatasi radikal bebas. Nilai FRAP
dinyatakan dalam mg equivalen asam askorbat per gram ekstrak (AAE). Ascorbic
Acid Equivalent (AAE) merupakan acuan umum untik mengukur sejumlah asam
askorbat yang terdapat dalam suatu bahan. Sampel ekstrak bunga telang, memiliki
nilai FRAP sebesar 672 mg AEE/ gekstrak, hal ini berarti dalam setiap grak ekstrak
setara dengan 672 mg asam askorbat.

SIMPULAN

Uji aktivitas antioksidan dengan metode FRAP didasarkan pada pengukuran

daya reduksi sampel terhadap raegen-reagen yang dianggap sebagai radikal bebas.
Ekstrak bunga telang yang diuji dapat berfungsi sebagai antioksidan dan diantara
semua konsentrasi yang diuji, ekstrak dengan konsentrasi 100 ppm adalah yang
paling baik kemampuan antioksidannya. Hal ini didasarkan pada nilai % aktivitas
antioksidan dan nila FRAP nya yang paling besar, yaitu 49.425 % dan 672 mg
AEE/gekstrak.

DAFTAR PUSTAKA

Al Amin Y, Naspiah N, Rusli R. 2018. Formulasi sediaan krim anti aging berbahan
 aktif ekstrak buah libo (Ficus Variegata). JMPC. 5(2): 301-307.
Andriani D, Murtisiwi L. 2018. Penetapan kada fenolik total ekstrak etanol bunga
telang (Clitoria ternatea L.) dengan spektrofotometri UV-Vis. Cendekia
Journal of Pharmacy. 2(1): 32-91.
Fadiyah Af, Wardhani RM, Rahmatika N, Wijayanti SPM. 2018. Eksplorasi potensi
ekstrak cair daun kecombrang yang mengandung antioksidan sebagai
penetralisir radikal bebas dalam darah petugas SPBU. J. Litbang Kota
Pekalongan. 15(1): 8-16.
Febriyenti, Suharti N, Lucida H, Husni E, Sedona O. 2018. Karakterisasi dan studi
aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol secang (Caesalpinia sappan L.).
JSFK. 5(1): 23-27.
Maesaroh K, Kurnia D, Al-Anshori J. 2018. Perbandingan metode uji aktivitas
antioksidan DPPH, terhadap asam askorbat, asam galat dan kuersetin.
Chemica et Natura Acta. 6(2): 93-100.doi:10.24198/cna.v6.n2.19049.
Maryam S, Baits M, Nadia A. 2016. Pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak
etanol daun kelor (Moringa oleifera Lam.) menggunakan metode FRAP
(Ferric Reducing Antioxidant Power). JFI. 2(2): 115-118.
Rahman A, Malik A, Ahmad AR. 2016. Skrining fitokimia dann uji aktivitas
antioksidan ekstrak etanolik buah buni (Antidesma bunius (L.) SPRENG). J.
Fitofarmaka Indonesia. 3(2): 159-163.
Rohmadianto D, Suhartatik N, Widanti YA. 2019. Aktivitas antioksidan teh rambut
jagung (Zea mays L. sacharata) dengan penambahan rosela (Hibiscus
sabdariffa L) dan variasi lama pengeringan. JTIP. 3(2): 113-120.
Setiawati H, Marsono Y, Suteja AM. 2015. Kadar antosianin dan aktivitas
antioksidan flake beras merah dan ketan hitam dengan variasi suhu perebusan.
J. Teknologi Pangandan Gizi. 12(1): 29-38.
Syarif S, Kosman R, Inayah N. 2015. Uji aktivitas antioksidan terong belanda
(Solanum betaceum Cav.) dengan metode FRAP. As-Syifaa. 7(1): 26-33.