Nama : Alifiya Nurzannah

Asisten : Veren Calisya

Dosen PJP : Puspa Julistia Puspita

ISOLASI DAN PEMURNIAN DNA PLASMID

MATA KULIAH
KETEKNIKAN ASAM NUKLEAT DAN PROTEIN
SEMESTER GENAP 2019/2020

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
 HASIL PENGAMATAN

Tabel 1 Kuantifikasi DNA plasmid E.coli

Sampe Konsentrasi
No A230 A260 A280 Kemurnian
l (µg/µL)
1 Meja 1 32.658 2.251 37.340 0.040 112.570
2 Meja 2 0.447 0.764 0.472 1.918 38.220
3 Meja 3 0.044 0.034 0.043 1.979 1.749
4 Meja 4 26.912 1.933 20.744 0.054 96.655
5 Meja 5 6.805 3.999 0.653 10.713 199.964
6 Meja 6 23.356 43.517 25.585 1.706 2175.854
7 Meja 7 0.561 1.034 0.613 1.808 51.739
8 Meja 8 2.863 5.644 2.800 2.021 282.241

PEMBAHASAN

Plasmid merupakan elemen genetik DNA ekstrakromosomal yang stabil untuk

diturunkan dan dapat bereplikasi secara mandiri dari kromosom bakteri. Sel bakteri
mempunyai satu jenis atau lebih DNA ekstrakromosomal atau plasmid. Secara
umum, plasmid membawa gen yang penting bagi bakteri tetapi bukan gen yang
esensial untuk pertumbuhan dan pembelahan sel bakteri tersebut. Ukuran plasmid
bervariasi dari 2.1 kb atau berat 1.8 MDa sampai 213 kb atau berat 142 MDa. Adanya
plasmid baru terlihat apabila gen yang dikandungnya memberikan sifat-sifat baru
pada inang. Umumnya plasmid akan dinamai sesuai dengan sifat plasmid tersebut,
misalnya plasmid resistensi, plasmid virulensi, plasmid degeneratif, seks-plasmid dan
kol-plasmid (Wibowo et al. 2011). Menurut Herdianto et al. (2015), plasmid
mempunyai 3 komponen penting yaitu origin of replication (ORI) yang membuat
plasmid dapat bereplikasi mandiri, multiple cloning site (MCS) yang merupakan
daerah unik sebagai situs pemotongan enzim endonuklease, dan penanda seleksi
(biasanya resistensi terhadap antibiotika) untuk membedakan antara sel inang yang
mengandung plasmid atau tidak.
Prinsip isolasi plasmid adalah memisahkan komponen sel dan DNA genom
dengan DNA plasmid berdasarkan ukuran. DNA plasmid memiliki berat molekul
yang lebih rendah dari DNA genom yang linear dan komponen sel lainnya (Iqbal et
al. 2016). Proses isolasi plasmid dilakukan pada fase log yaitu ketika pembelahan
maksimal. Menurut Herdianto et al. (2015), isolasi plasmid dapat dilakukan dengan
sesium klorida, namun jarang digunakan karena mahal, korosif, toksik, serta
memerlukan waktu yang lama. Metode yang umum digunakan dalam isolasi DNA
adalah metode lisis alkali. Metode ini cukup sederhana dan DNA yang dihasilkan
memiliki kemurnian yang relatif cukup baik (Khusnuryani et al. 2016). Metode lain
yang dapat digunakan untuk isolasi plasmid adalah lisis didih. Metode ini tidak
dianjurkan karena jumlah plasmid yang dihasilkan lebih rendah dari alkali lisis.
Plasmid yang diisolasi dengan metode alkali lisis memanfaatkan kerja enzim restriksi
lebih baik, meskipun isolat tersebut memiliki kontaminasi RNA lebih besar, namun
benar-benar bebas dari endonuklease atau zat penghambat enzim lainnya (Roy et al.
2018).
Metode isolasi plasmid yang tepat sangat penting untuk mendapatkan
plasmid dengan konsentrasi dan kemurnian yang tinggi (Herdianto et al. 2015).
Kemurnian yang tinggi dapat diperoleh ketika tidak terdapat kontaminan seperti
RNA, DNA genom, protein bakteri dan endotoksin. Hal tersebut menyebabkan
pemurnian harus dilakukan setelah proses isolasi. Beberapa metode pemurnian yaitu
penggunaan garam klorida untuk menghilangkan RNA yang berat molekulnya lebih
tinggi, presipitasi selektif plasmid superkoil, filtrasi, dan teknik kromatografi (Roy et
al. 2018).
Hasil pengamatan yang terdapat pada tabel 1 menunjukkan nilai absorbansi
DNA plasmid yang diukur dengan Thermo Scientific Spectrofotometer Nanodrop
2000 untuk menentukan kemurnian dan konsentrasi DNA plasmid tersebut. Nilai
absorbansi sampel dari meja 1 yang diukur pada panjang gelombang 230 nm, 260 nm,
dan 280 nm secara berturut-turut adalah 32.658, 2.251, dan 37.340. Menurut
Syahputra et al. (2016), kemurnian dapat diperoleh dari nisbah nilai absorbansi pada
A260 dan A280. Tingkat kemurnian DNA plasmid dinyatakan memadai jika bernilai
1.8–2.0. Hasil percobaan kemurnian untuk sampel meja 1 adalah 0.040, sehingga
tidak masuk dalam rentang kemurnian yang memadai. Kemurnian yang rendah dapat
dipengaruhi oleh kontaminasi isolat yang tinggi. Nilai kemurnian yang kurang dari
1.8 menunjukkan hasil isolasi terkontaminasi akibat protein atau fenol dan jika lebih
dari 2.0 kemungkinan terkontaminasi oleh RNA (Sutrisno et al. 2013).
Konsentrasi DNA plasmid yang diperoleh dari percobaan yaitu 112.570
µg/µL. Konsentrasi berpengaruh pada kualitas fragmen hasil amplifikasi dari analisis
kualitatif plasmid hasil isolasi melalui elektroforesis pada gel agarosa 0,8% dengan
menggunakan buffer TAE sebagai fase geraknya (Khusnuryani et al. 2016).
Konsentrasi yang terlalu tinggi menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit
dibedakan antara satu fragmen dengan fragmen lainnya, sedangkan konsentrasi yang
terlalu rendah menghasilkan fragmen yang terlalu tipis atau bahkan tidak terlihat
secara visual pad gel. Konsentrasi DNA plasmid dipengaruhi oleh kecepatan reaksi
ekstraksi dan komposisi penambahan buffer lisis. Kecepatan reaksi merupakan faktor
yang paling berpengaruh sehingga pada tahap lisis sel dan pengambilan supernatan
harus dilakukan per sampel (Harahap 2017).

SIMPULAN

Plasmid dapat bereplikasi secara mandiri tanpa DNA kromosom. Plasmid

dapat diisolasi dari bakteri berdasarkan pemisahan komponen sel dan DNA genom
dengan DNA plasmid berdasarkan ukuran. Plasmid memiliki berat molekul yang
lebih rendah dari DNA genom yang linear dan komponen sel lainnya. Plasmid hasil
isolasi memiliki kemurnian 0.040 yang tergolong sangat rendah karena <1.8,
sehingga dapat disimpulkan plasmid masih terkontaminasi protein atau fenol.

DAFTAR PUSTAKA

Harahap AS. 2017. Uji kualitas dan kuantitas dna beberapa populasi pohon kapur
Sumatera. Journal of Animal Science and Agronomy Panca Budi. 2(2) : 1 – 6.

Hardianto D, Indarto A, Sasongko ND. 2015. Optimasi metode lisis alkali untuk
meningkatkan konsentrasi plasmid. Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia.
2(2): 60-70.

Iqbal M, Buwono ID, Kurniawati N. 2016. Analisis perbandingan metode isolasi

DNA untuk deteksi White Spot Syndrome Virus (WSSV) pada udang vaname
(Litopenaeus vannamei). Jurnal Perikanan Kelautan, 7(1): 54-65.

Khusnuryani A, Solihah J, Muallifah AY. 2016. Isolasi dan analisis dna plasmid
(pGEM®-3Zf(+)) sebagai sediaan kebutuhan praktikum di laboratorium biologi
fakultas sains dan tekonolgi. Integrated Lab Journal. 4(1) : 63 – 70.

Roy U, Mishra A, Jana P, Kamakar S. 2018. A comparative study on different

plasmid isolation prosedure. Int. J. Pure App. Biosci. 6(5) : 533 – 541.

Sutrisno IK, Arundina I, Sosiawan A. 2013. Identifikasi bite marks dengan ekstraksi
DNA metode Chelex. Dental Journal. 46(2) : 107 – 112.

Wibowo MH, Nugroho WS, Asmara W. 2011. Profil plasmid Escherichia coli
resisten terhadap beberapa antibiotika yang diisolasi dari peternaka ayam
komersial. J. Sain Vet. 29(1) : 43 – 50.